转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性

背景:脂肪间充质干细胞在转化生长因子β1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞。然而,外源性转化生长因子β1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷。因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义。目的:探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性。方法:利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、HindⅢ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率。结果与结论:重组质粒经XboⅠ、HindⅢ双酶切后出现1.35bp和5.4kb2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率80%,且转染细胞后有转化生长因子β1mRNA和蛋白的表达上调。提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒。     

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165)的真核表达载体，并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法：利用基因克隆技术，将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamHI和XhoI双酶切后，再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆。用免疫细胞化学鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组体中已插入目的基因片段VEGF165，免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论：成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165。并在骨髓基质细胞中得到表达，为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受。推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用。目的:构建大鼠Delta1基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上。利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达。结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的HindIII和XbaI双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Delta1送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确。转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Delta1的表达显著增高。实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白。     

锌指转录因子snai1高表达质粒构建和稳定株的筛选

背景:研究表明Snai1和E-钙黏素在肿瘤组织中有负向表达关系,且与Snai1与CDH1启动子区box盒结合,抑制CDH1基因转录。目的:构建针对snai1的高表达载体,建立稳定转染的细胞株。方法:根据GenBank中snai1的基因序列人工合成snai1全序列,将合成好的序列装入Pmd-18T载体并转化感受态细胞DH5α,进行阳性克隆筛选。测序验证重组克隆中基因序列正确后,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切Pmd-18T/snai1质粒,将所得的snai1全基因片段转入pcDNA3.1(+)空质粒,构建pcDNA(+)/snai1真核表达质粒,同时构建阴性对照质粒,并分别对结肠腺癌细胞HT-29进行转染,最后利用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT-PCR和Western blot鉴定宿主细胞内snai1基因的表达情况。结果与结论:成功构建了真核表达质粒pcDNA(+)/snai1,顺利转染结肠癌细胞HT-29后于600mg/LG418浓度时筛选21d得到snai1基因稳定表达株,构建的snai1基因正义表达质粒pCDNA3.1(+)/snai1转染宿主细胞后可促进snai1基因的表达。     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC).方法:将pMD-18-VP1克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达.结果:构建的pcDNA3.1-VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS-PAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1.结论:成功地构建了重组质粒pcDNA3.1- VP1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达.     

Pax-8 基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究

目的: 构建大鼠 Pax-8 基因全长序列的真核表达载体pcDNA3.1(+),并将重组质粒转染至心肌细胞系H9c2中进行表达,测定转染后 Pax-8 基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法: 酶切pCMV sport6- Pax-8 获得大鼠 Pax-8 全长基因,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Pax-8。限制性酶切鉴定和DNA测序鉴定插入片段。将重组质粒经脂质体法转染至大鼠心肌细胞系H9c2细胞中,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后Pax-8 mRNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖;以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行 Pax-8 质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blotting法检测活化caspase-3的表达。结果: 成功构建了大鼠pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表达载体,且证实转染后心肌细胞的 Pax-8 mRNA 及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空质粒组(P<0.05)。转染 Pax-8 基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0.05),明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P<0.01),同时下调活化caspase-3的表达(P<0.01)。结论: 通过基因重组技术成功使得 Pax-8 基因在心肌细胞中过表达。 Pax-8 基因可能通过促进心肌细胞增殖及抑制心肌细胞凋亡从而参与胚胎心脏发育的过程。     

pcDNA3.1(+)—增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达

目的:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)并观察其在大鼠体内的转染部位及表达时间.方法:构建重组质粒pcDNA3.1(+)-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔,观察其在大鼠体内转染后的时空效应.结果:双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1(+)约5.4kb, EGFP约750bp,另外测序分析与文献报道结果完全一致;动物实验结果表明,鞘内注射24h后在大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达,在14d达到高峰,4周后明显下降,第7周消失;在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光.对照组所有取材部位均没有绿色荧光.结论: 重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔,且外源基因得到了表达.     

pcDNA3.1-MORC2重组质粒的构建及其在胃癌细胞SGC-7901中的表达和定位

目的 构建真核表达载体pcDNA3.1-MORC2并瞬时转染人胃癌细胞SGC-7901,观察融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以人MORC2 cDNA为模板,PCR扩增MORC2全长编码基因,亚克隆至pcDNA3.1-hisA表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,提取细胞蛋白进行Wester...     

鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定

目的：对小鼠β防御素-2（mBD2）基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法：通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素（LPS）,建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（＋）真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果：提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论：成功地构建了pcDNA3.1（＋）/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

含人血栓调节蛋白基因重组质粒的构建和表达

目的:构建hTM真核表达质粒,并导入脐静脉内皮细胞(HUVECs)中表达,为临床血栓病的基因治疗提供实验依据和物质基础。方法:PCR法扩增hTM基因的全长表达片段,HindⅢ/EcoRⅠ酶切后与pcDNA3.1(+)/neo质粒连接成pcDNA3.1/hTM。经鉴定正确后,由阳离子脂质体包裹转染HUVECs,免疫组化检测转染后细胞hTM的表达。结果:双酶切及测序鉴定均证实hTM基因被成功克隆。pcDNA3.1/hTM经脂质体介导能有效地转染内皮细胞,转染效率约为10%左右。结论:成功构建pcDNA3.1/hTM重组质粒,并且能在内皮细胞中高效表达。为进一步的基因治疗提供物质基础。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

IL-12双亚基共表达载体的构建及在人骨髓间充质干细胞中的表达

 目的 构建人 IL-12（hIL-12）p40 和 p35 双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法 根据 hIL-12 p40 和 p35 亚基全长 cDNA 序列分别设计合成引物行 PCR 扩增，将扩增所得 p40 和 p35 片段采用 overlap PCR 法拼接，获得的 rhIL-12 融合基因与 pGEM-T Easy 质粒连接，将鉴定正确的 pGEM-T/rhIL-12 重组质粒克隆至 pcDNA3.1（+）真核表达质粒中，构建 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 真核表达载体，并进行测序鉴定。将鉴定正确的 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 经脂质体介导转染 hMSC，同时以转染 pcDNA3.1（+）空质粒作为对照组，在倒置显微镜下观察细胞生长形态；在转染后第 4 天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达；另分别在转染后第 2、4、6、8、10、12、14 天，采用 ELISA 方法检测细胞培养上清液中 rhIL-12 融合基因的表达水平。 结果 PCR 扩增结果显示特异性扩增出 p40（1000 bp）、p35（600 bp）、rhIL-12（1600 bp）片段，均与预期 DNA 表达片段大小一致。pcDNA3.1（+）/rhIL-12 测序显示克隆的 rhIL-12 基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察，可见转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 生长形态和生长速度与对照组 hMSC 相比均无明显差异。蛋白质印迹和 ELISA 检测显示，转染 pcDNA3.1（+）/rhIL-12 的 hMSC 培养上清液中可见 rhIL-12 融合蛋白的持续表达；而对照组中均未检测到 rhIL-12 融合蛋白表达。 结论 成功构建了 hIL-12 p40 和 p35 双亚基真核共表达载体 pcDNA3.1（+）/rhIL-12，为利用 hIL-12 进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。     

p75真核表达载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的：构建人神经生长因子低亲和力受体p75真核表达质粒,并在前列腺癌细胞PC-3中表达。方法：运用RT-PCR技术从人脑胶质细胞瘤组织中分离扩增编码人p75完整基因,与pcDNA载体重组,并通过酶切和测序鉴定;用脂质体介导法将重组质粒转染到PC-3细胞中,经G418筛选后,用RT-PCR、间接免疫荧光化学和细胞免疫组织化学法在转录和翻译两个水平上检测表达产物。结果：酶切和测序证实所获得的重组质粒包含p75完整基因;在转染pcDNA3．1( )-p75的PG3细胞中检测到转录和翻译产物。结论：成功地构建了p75真核表达质粒并在PC-3细胞中表达,为深入研究p75在前列腺癌中的生物学功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在QSG7701细胞中的表达和鉴定

目的：进行丙型病毒肝炎核心蛋白真核表达载体的构建，并在人源肝细胞QSC7701中进行表达与鉴定。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1—3011质粒中扩增出HCV核心（core）基因片段，构建peDNA3．1（-）／core重组真核表达质粒。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701，用免疫组织化学SP法检测丙型肝炎病毒核心蛋白的表达，再通过Western blot印迹法进行鉴定。结果：所克隆的core片段大小正确，序列正确；成功的构建了pcDNA3．1（-）／core重组表达质粒，瞬时转染QSG7701细胞，用SP免疫组化检测到了核心蛋白的表达，Western blot印迹法显示其分子量约为21000。结论：丙型病毒肝炎核心蛋白的真核表达载体pcDNA3．1（-）／core在人肝细胞中能有效表达HCV核心蛋白，从而为进一步研究和解析核心蛋白在肝细胞癌变机制中的所起的作用提供了良好的核心蛋白表达系统，同时也为开发丙型肝炎DNA疫苗提供了前期条件。     

骨髓间充质干细胞中软骨调节素Ⅰ的稳定上调表达

背景：软骨调节素Ⅰ是一种糖蛋白,主要在软骨中表达,而在骨髓间充质干细胞中少量表达。结合课题组的前期研究,推断软骨调节素Ⅰ在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中可能会起促进作用。 目的：构建软骨调节素Ⅰ表达载体,使其在大鼠骨髓间充质干细胞中稳定上调表达。 方法：在大鼠软骨组织中获取软骨调节素Ⅰ目的基因,使用pcDNA3.1(+)质粒表达载体构建pcDNA3.1(+)/ChM-I表达载体。密度梯度离心法和贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞。用脂质体法将构建的pcDNA3.1(+)/ChM-I表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞,使用G418稳定筛选转染细胞,用RT-PCR 及Western blot 检测软骨调节素Ⅰ在细胞株内的表达。 结果与结论：对阳性克隆的双酶切鉴定及测序和分析对比,结果显示与软骨调节素Ⅰ基因长度相符并且序列无误,且读码框正确。RT-PCR及western blot检测结果显示,软骨调节素Ⅰ的mRNA及蛋白在骨髓间充质干细胞中稳定的高表达。实验成功构建了pcDNA3.1(+)/ChM-I表达载体,并成功将其转染到大鼠骨髓间充质干细胞中,最终使软骨调节素Ⅰ在大鼠骨髓间充质干细胞中稳定上调表达。     

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的 克隆人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）F基因,构建F基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/F,并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因,然后克隆到pGEM-3zf载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,行酶切鉴定,脂质体法转染COS-7细胞,应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSVF基因序列,序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSVF基因,并在真核细胞中获得表达。