人AGM区基质细胞对脐血LTC-IC的支持作用

为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血长期培养启动细胞(LTC-IC)的造血支持作用,建立了人AGM区基质细胞与脐血CD34+细胞体外长期共培养体系。采用免疫磁珠方法分离人脐血CD34+细胞,接种于已制备好人AGM区基质细胞(hAGMS1-S5)饲养层的24孔板中共培养,同时设无饲养层组作为对照,分别于共培养5、6、7、8周时收获细胞行造血细胞集落培养,并采用极限稀释法(LDA)检测与人AGM区基质细胞共培养后的脐血CD34+细胞的LTC-IC含量。结果表明,无饲养层的对照组培养5周后不再产生造血细胞集落,而以hAGMS1-S5作为饲养层,共培养5周后造血细胞仍具有集落形成能力。hAGMS1-S5维持LTC-IC的作用组间比较有显著性差异(P<0.05),其中以hAGMS3与S4组支持作用最强。LDA检测结果显示,hAGMS3和S4维持LTC-IC的能力无显著性差异(P>0.05);与hAGMS3和S4共培养14天后脐血CD34+细胞中的LTC-IC扩增,分别是达到(176±46)%、(187±52)%,S3和S4两组间比较无显著性差异(P>0.05)。结论:人AGM区基质细胞S1-S5对脐血LTC-IC具有维持作用,特别是hAGMS3和S4两株细胞对脐血LTC-IC具有更好的维持及扩增作用。     

体外培养的人AGM区基质细胞表达多种造血生长因子

本研究检测人胚胎主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞表达的造血生长因子，为探讨AGM区基质细胞在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用提供基础资料。采用RT—PCR方法在mRNA水平分析IL-6、SCF、Fit3-L、OSM、IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子在人AGM区基质细胞（hAGMSI—S5）的表达情况，应用ELISA法测定IL-6、SCF、Fit3-L在hAGMSI—S5细胞培养上清液中的分泌水平，并将脐血CD34^＋细胞与hAGMSI—S5饲养层细胞共培养14天后行造血细胞集落培养以进一步检测人AGM区基质细胞的造血支持作用。结果表明：hAGMSI—S5均表达IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生长因子mRNA，不表达IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。在hAGMSI—S5细胞培养上清液中可测得分泌的SCF、Fit3-L、IL-6等因子，hAGMSI—S5组间比较各因子水平无显著性差异（P〉0．05）。集落培养结果表明，hAGMSI—S5对CFU—GM、BFU—E、CFU-Mix均有不同程度的扩增作用，hAGMSI—S5的造血支持作用组间比较亦显示有显著性差异（P〈0.05），其中hAGMS3,S4优于S1、S2及S5。结论：人AGM区基质细胞表达SCF、Fit3-L、IL-6、OSM等多种造血生长因子，这可能与AGM区基质细胞支持造血细胞原始发生和体外维持造血干细胞功能相关。     

人胚胎AGM区基质细胞在体外培养中对脐血CD34+细胞的支持作用

目的探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血CD34+细胞的造血支持作用.方法采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞,接种于底层已制备好的人AGM区基质细胞S1～S5饲养层的24孔板中,同时设无饲养层组及取自同期胚胎的躯干成纤维(hFT)细胞为对照,体外培养28 d,每7 d收获细胞并检测总数,流式细胞术检测CD34+、CD34+CD38细胞含量,并行造血细胞集落培养.结果在未加外源性造血生长因子的条件下,5株人AGM区基质细胞hAGMS1～S5对造血细胞总数、CD34+及CD34+CD38细胞、造血细胞集落均有不同程度的扩增及维持作用,与无饲养层组、hFT细胞组比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞总数在21 d达到峰值[扩增(25.13±4.83)倍],CD34+、CD34+CD38-细胞在扩增14 d达到峰值[(2.68±0.51)倍、(2.38±0.45)倍],高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)亦在14 d达到峰值[(2.62±0.85)倍].hAGMS1～S5的造血支持作用组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5.结论人AGM区基质细胞对脐血CD34+细胞具有维持及扩增作用,特别是hAGMS3、S4两株细胞具有更好的维持作用,为胚胎早期造血发生机制和诱导胚胎干细胞造血分化研究提供了重要的模式细胞和基础资料.     

含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用

为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎千细胞(embryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14 ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Tran-swell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM + FL诱导和AGM + BM诱导共6组.分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+ c-Kit+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析.结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+ c-Kit+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.O1);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组最佳(p<0.01).结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用.     

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景：前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。目的：模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾（AGM）区、胎肝（FL）及骨髓（BM）基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体（EB）,并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM＋FL和EB/AGM＋FL＋BM共4组。共培养6d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1＋c-Kit＋细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。结果与结论：①EB/AGM＋FL组和EB/AGM＋FL＋BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1＋c-Kit＋细胞明显升高（P〈0.05）。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组（P〈0.05）,而EB/AGM＋FL、EB/AGM＋FL＋BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM＋FL和AGM＋FL＋骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。     

胚胎AGM区造血发育的研究现状

主动脉-性腺-中肾（AGM）区是哺乳动物体节期胚胎自主产生造血干细胞（HSC）的主要造血组织。AGM区造血发生模式主要是造血发生内皮,而近年来有证据表明造血血管原始干细胞和血管外间质也参与其造血形成。AGM—HSC的表面标志随发育成熟变化活跃,其中CD41是最早建立的造血标志,而内皮细胞特异分子在不同发育阶段HSC的表达变化提示该细胞的逐步成熟和稳定。经典造血生长因子白介素3对AGM-HSC的扩增效应令人兴奋,而联合斑马鱼模型揭示前列腺素对AGM区以及骨髓HSC的调节活性也预示今后的研究手段将更为丰富。最近,AGM区间充质干细胞（MSC）的发现及其显著的造血支持功能将有助今后发掘新型的HSC调控因子。本文就AGM区的造血发生模式、AGM区HSC的表面标志和AGM区造血干细胞的调控进行了综述。     

BMP-4在人AGM区基质细胞的表达

本研究旨在观察BMP-4在人胚胎主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞的表达,为建立含AGM区基质细胞的诱导胚胎干细胞造血分化培养体系提供理论和实验依据。体外传代培养人胚胎AGM区基质细胞（hAGM S1-S5）及取自同期胚胎的躯干成纤维细胞（hFT）,采用RT-PCR方法在mRNA水平分析BMP-4在hAGM S1-S5的表达情况,并应用ELISA方法测定BMP-4在hAGM S1-S5细胞培养上清液中的分泌水平,同时以hFT细胞作为对照。结果表明：体外培养中的hAGM S1-S5细胞形态学表现主要为成纤维间质细胞样,少量呈内皮样,是早期胚胎AGM区来源的异质细胞群。hAGM S1-S5细胞均表达BMP-4 mRNA,hFT不表达BMP-4 mRNA。hAGM S1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的BMP-4,其分泌水平（pg/ml）分别为55.98±11.20、61.16±9.39、76.26±11.31、86.38±18.34、85.39±21.22,与hFT对照组（16.76±7.04pg/ml）相比有显著性差异（p〈0.05）,hAGM S1-S5组间比较BMP-4水平无显著性差异（p〉0.05）。结论：体外培养中的人AGM区基质细胞表达BMP-4,与AGM区基质细胞支持造血干细胞原始发生的功能相关。     

小鼠胚胎AGM区Flk-1~+细胞的造血特性

本研究旨在考察Flk-1分子在胚胎期10.5 d(E10.5)的主动脉-性腺-中肾区(AGM区)不同类型造血前体细胞的表达情况。通过流式细胞术分析发现低于10%的Flk-1+细胞与CD41、CD45/Ter119有共表达,继而分选出CD31+CD45-Ter119-Flk-1+CD41+(R1,代表不成熟的造血前体细胞)和CD31+CD45-Ter119-Flk-1+CD41-(R2,代表内皮细胞)两群细胞,利用造血集落培养和OP9共培养体系分别考察其体外的髓系与淋系潜能。结果表明:仅R1组细胞能在造血集落培养体系中形成典型的造血集落,但与OP9共培养7-9 d后,两组细胞均能产生丰富的造血前体细胞(CD45+c-Kit+)、髓系细胞(Gr-1+/Mac-1+)、红细胞(Ter119+)和B淋巴细胞(CD19+)。结论:E10.5的小鼠胚胎AGM区Flk-1仍然在幼稚的造血前体细胞以及更早期的生血内皮细胞表达,但是此时的造血干细胞前体和造血干细胞是否表达Flk-1仍需通过体内功能实验明确。     

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景:前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞.目的:模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell 非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL 和EB/AGM+FL+BM共4 组.共培养6 d 后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态.结果与结论:①EB/AGM+FL 组和EB/AGM+FL+BM 组收获细胞涂片均发现原始造血细胞.②拟胚体来源细胞经AGM 区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+ 细胞明显升高(P < 0.05).③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P < 0.05),而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高.提示AGM+FL 和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层.     

人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景：研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化。目的：以人主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros,AGM）区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响。方法：将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性。再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Coγ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组。结果与结论：拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1＋c-Kit＋细胞占（13.12±1.30）%。NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成。静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因。提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力。     

Sonic hedgehog信号通路对AGM区来源的成血-血管细胞增殖、迁移和分化作用

目的探讨Sonichedgehog（Shh）信号通路对小鼠主动脉-中肾-肾上腺（AGM）区来源的成血．血管细胞增殖、分化和迁移的影响。方法联合应用抗小鼠CD34、Flkl单克隆抗体（单抗）的磁珠，从孕11dBALB／c鼠胚胎AGM区分离培养成血-血管干细胞，并同时培养AGM区来源基质细胞，用流式细胞术对所分离细胞进行表型鉴定。用免疫组织化学法检测基质细胞表达Shh蛋白的情况；借助TransweU细胞共培养体系，观察在AGM的基质细胞共培养体系中，不同浓度的Shh活性肽及其单抗对成血．血管干细胞增殖、细胞周期、迁移及向内皮细胞定向分化的影响。结果AGM区基质细胞高表达Shh蛋白（阳性率高达90％以上），并可促进成血-血管干细胞增殖，其增殖效应可被10．00μg／mlShh单抗阻断；0．10-10．00μg／ml外源性Shh活性蛋白与AGM区基质细胞共培养的成血-血管干细胞，可使成血．血管干细胞长时间增殖，并促进细胞迁移，但并不诱导细胞凋亡与分化；而当0．10-10．00μ／ml外源性Shh活性蛋白作用于单独培养的成血-血管干细胞，细胞经过短时间增殖后，随后发生凋亡并向内皮细胞分化。结论Shh信号通路参与了成血-血管干细胞的增殖、分化、凋亡及迁移等生物学特性的调控，但其具体作用存在时空的差异，AGM区微环境对Shh信号通路具有整合和调试的作用。     

Chemotaxis of primitive hematopoietic cells in response to stromal cell-derived factor-1

Stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) provides a potent chemotactic stimulus for CD34(+) hematopoietic cells. We cultured mobilized peripheral blood (PB) and umbilical cord blood (CB) for up to 5 weeks and examined the migratory activity of cobblestone area-forming cells (CAFCs) and long-term culture-initiating cells (LTC-ICs) in a transwell assay. In this system, SDF-1 or MS-5 marrow stromal cells placed in the lower chamber induced transmembrane and transendothelial migration by 2- and 5-week-old CAFCs and LTC-ICs in 3 hours. Transmigration was blocked by preincubation of input CD34(+) cells with antibody to CXCR4. Transendothelial migration of CB CAFCs and LTC-ICs was higher than that of PB. We expanded CD34(+) cells from CB in serum-free medium with thrombopoietin, flk-2 ligand, and c-kit ligand, with or without IL-3 and found that CAFCs cultured in the absence of IL-3 had a chemotactic response equivalent to noncultured cells, even after 5 weeks. However, addition of IL-3 to the culture reduced this response by 20-50%. These data indicate that SDF-1 induces chemotaxis of primitive hematopoietic cells signaling through CXCR4 and that the chemoattraction could be downmodulated by culture ex vivo.     

转基因骨髓基质细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增作用的研究

为探讨转染FL基因的人原代骨髓基质细胞对脐血CD34+ 细胞的体外扩增效应 ,建立了转基因骨髓基质细胞与人脐血CD34+ 细胞共培养体系。采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+ 细胞 ,在不同的体外培养体系中进行培养并取样检测细胞总数 ,CFC和CD34+ 细胞百分率。结果表明 ,在不同组合的培养体系中 ,转基因骨髓基质细胞培养体系较骨髓基质细胞培养体系和无滋养层培养体系对有核细胞总数 ,CFC含量和CD34+ 细胞含量均具有明显的扩增作用 ,分别扩增了 12 2 .5± 4 .3,39.6± 2 .7和 11.8± 0 5 2倍 (P <0 .0 5 )。结论 :转染FL基因的人骨髓基质细胞协同其它细胞因子可增强对人脐血CD34+ 细胞的体外扩增作用。     

小鼠骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞造血分化的影响

骨髓间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞 ,在体外具有一定的造血支持作用 ,与造血干细胞共移植可促进其植入。本研究旨在初步探讨应用小鼠骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养作为一种新的分化体系的可行性。首先分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞 ,然后利用扩增培养的骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养 ,通过造血集落培养和RT PCR观察造血分化的特点。结果表明 ,分离、扩增培养至第四代之后的骨髓间充质干细胞形态均一 ,高表达Sca 1,CD2 9,CD4 4和CD10 5 ,而CD34和CD4 5等造血与内皮细胞特异性表面标志呈阴性 ;特异性诱导体系内传代后 (>4代 )的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化。与悬浮分化体系相比 ,骨髓间充质干细胞共培养体系中初始分化的胚胎干细胞含有显著增加的拟胚体形成细胞而没有造血集落形成细胞。此外 ,RT PCR检测发现 :共培养细胞表达胚胎干细胞特异性转录因子Oct 4 ,而造血标记Flk 1,GATA 1和 β H1为阴性。结论 :间充质干细胞在一定程度上抑制了胚胎干细胞的初始分化 ,但是共培养体系来源的拟胚体产生造血集落的能力显著高于悬浮体系     

人胎盘造血干/祖细胞及淋巴细胞亚群表型的研究

目的　探讨人胎盘组织中是否含有造血干 祖细胞 (HSPC) ,并分析其淋巴细胞亚群的表型特征。方法　将新鲜胎盘制成单个细胞悬液 ,用流式细胞仪分析其有核细胞中HSPC、淋巴细胞及其亚群的表型特征 ,并用流式细胞术 (FCM)或MiniMACS分选胎盘CD34 细胞。结果　胎盘CD34 细胞百分率是脐带血的 8.8倍 ,CD34 CD38- 细胞和CD34 CD38 细胞百分率分别为脐带血的 4 .6倍和 11.9倍 ;FCM分选胎盘CD34 细胞的回收率和纯度分别为 (6 3.0 5± 10 .14 ) %和 (86 .39± 11.2 7) % ;胎盘中的淋巴细胞总数、T细胞 (CD3 CD2 )、B细胞 (CD1 9 )、Th(CD3 CD4 )细胞及Th Ts比值均明显低于脐带血 ,而CD8 CD2 8- T抑制细胞则明显高于脐带血。结论　人胎盘富含HSPC ,在胎儿期具有重要的造血功能 ,可望成为HSPC移植的重要资源。CD8 CD2 8- T抑制细胞可能在胎 母免疫耐受中起重要作用。