减毒沙门氏菌在抗肿瘤治疗中的应用

目前用于肿瘤治疗的细菌已逐渐发展为肿瘤治疗的潜在策略,这主要是由于细菌菌株的发展保持了良好的抗肿瘤功效,同时也具有低毒的特性。细菌介导的肿瘤治疗依赖于兼性厌氧菌,这些厌氧菌可以在氧化良好或贫氧区域存活,可靶向肿瘤。其中,减毒沙门氏菌作为基因递送载体、抗肿瘤免疫激活剂和肿瘤细胞死亡诱导剂,可通过改善宿主免疫环境、降低吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达以及调节肿瘤细胞的自噬与凋亡发挥内在抗肿瘤活性。     

可经粘膜途径递送DNA疫苗的减毒伤寒沙门菌载体的研究进展

DNA疫苗的本质是在哺乳动物细胞内表达重组蛋白抗原的质粒DNA,DNA疫苗能刺激机体产生体液及细胞免疫,有效的DNA疫苗载体可向细胞内高效传送质粒DNA.伤寒沙门菌是细胞内寄生菌,可通过黏膜途径感染,穿过黏膜上皮细胞屏障侵入黏膜相关淋巴组织(MALT),被MALT内专职抗原递呈细胞(APC)吞噬,并可在细胞吞噬泡内存活和增殖,同时细菌本身的病原相关分子模式(PAMP)是天然佐剂,因此可诱导机体产生有效的系统和局部经黏膜免疫应答,是极有发展潜力的经黏膜途径递送DNA疫苗的载体.     

携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌对小鼠免疫功能的影响

目的:探讨携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌对小鼠免疫功能的影响.方法:分别用3×108cfu 减毒沙门氏菌(Ty)、携带绿色荧光蛋白基因的减毒沙门氏菌(Typl-GFP)、携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌(Typl-HGF)、10% NaHCO3 于第O、14、28 天灌胃免疫小鼠,末次免疫后7天,分别收集各组动物全血及血清,用流式细胞仪检测抗凝全血中CD4+ T、CD8+T 及 IgM、IgGl、lgA 水平,用 ELISA 法检测血清中免疫球蛋白 IgM、IgGl,MTT 法检测脾脏组织中脾淋巴细胞的增殖能力.结果:流式细胞仪检测结果表明,Typl-HGF 组 CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+ 比值与其它三组比较显著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01);其IgM、IgA 与 NaHCO3 对照组相比无统计学意义(P>0.05),但与Ty、Typl-GFP 组相比显著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.05),而 IgGl 与 NaHCO3 对照组相比显著升高(P<0.01),ELISA 结果与流式细胞仪检测结果基本一致;Typl-HCF 组脾细胞的增殖活性明显低于其它实验组(P<0.05).结论:初步证明口服Typl-HGF 后对小鼠的细胞免疫和体液免疫均有抑制作用.     

减毒沙门菌作为新型肿瘤疫苗运送载体——癌症免疫治疗新希望

抗肿瘤免疫治疗是通过提高肿瘤特异性抗原的免疫原性及肿瘤细胞对效应性杀伤细胞的敏感性,调动机体免疫系统抵抗肿瘤细胞增殖和浸润的免疫治疗方法.与常规手术治疗、放射治疗和化学药物治疗相比,免疫治疗具有伤害小、毒性低等优点,但其在疫苗策略领域中的效果并不理想.近年来的研究表明,适当的载体有望显著提高疫苗的效果.减毒沙门菌是一种活疫苗载体,具有佐剂的作用,能够有效激活机体免疫细胞,在抗肿瘤免疫治疗中具有广阔的应用前景.     

减毒鼠伤寒沙门氏菌运送CD8+T细胞表位的细胞免疫应答

目的： 探索减毒沙门氏菌运送CD8＋ T 细胞表位诱导机体产生特异性细胞免疫应答的规律性.方法： 通过构建融合表达OVA 257～264aa和LCMV NP 118～132aa CD8＋ T 细胞表位的原核表达质粒ptG2F, 以电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207, 筛选重组菌SL7207（ptG2F）.采用静脉注射免疫C57BL/6和BALB/c小鼠, 间隔2 wk, 分别于第2次和第3次免疫后, 取免疫小鼠脾细胞, 用ELISPOT法检测特异性IFN-γ分泌细胞和IL- 4分泌细胞.结果： 携带CD8＋ T细胞表位的重组菌SL7207（ptG2F）能诱导产生细胞免疫应答.在提呈OVA CD8＋ T细胞表位时, 2次免疫后, 诱导产生的细胞免疫应答趋向于Th1; 而在3次免疫后, 呈现Th1/Th2的平衡转换.在提呈LCMV NP CD8＋ T细胞表位过程中, Th2免疫应答水平高于Th1, 且有增强趋势.结论： 减毒沙门氏菌可以有效运送CD8＋ T细胞表位并诱导产生特异细胞免疫应答, 这为减毒细菌作为运送载体的研究提供了参考依据.     

表达鼠精子Cyritestin蛋白的减毒沙门氏菌疫苗株的构建及其鉴定

目的 构建表达鼠精子eyritestin蛋白的可口服减毒沙让氏菌活疫苗株。方法 应用质粒TAZ83／13，将之进行双酶切获得含有成熟cyritestin蛋白cDNA序列的酶切片段。将其插入表达载体yA3149中，构建重组质粒pCFL。将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株X4632和X4550中，以获得重组菌株X4632（pCFL)和X4550（pCFL)。结果 该两种无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下，可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。X4550(pCFL)在体内可较稳定地害居于Peyer‘s结，肠系膜淋巴结和脾脏；X4632（pCFL)可较稳定地定居于Peyer‘s结。二者均可表达被抗cyritestin单抗（mAb)识别的重组cyritestin蛋白。口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。结论 X4632（pCFL),X4550（pCFL)疫苗株的构建，为研究以cyritestin为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础。     

以减毒沙门菌作为DNA疫苗载体的研究

目的 以真核表达质粒pCMVβ为报告基因，研究用芳香族氨基酸合成缺陷的沙门菌SL7207为载体以提高DNA疫苗免疫应答的可行性。方法 携带质粒pCMVβ的SL7207体外感染小鼠腹腔巨噬细胞后，用X-gal染色方法和RT-PCR方法检测巨噬细胞内β-gal的表达。小鼠口服免疫SL7207(pCMVβ)后，用RT-PCR方法检测β-gaⅠ基因在淋巴组织中的转录产物；用ELISA方法检测体液免疫；用^3H-TdR掺入法检测脾淋巴细胞增殖；用JAM试验检测杀伤性T淋巴细胞反应。结果 SL7207能有效地将质粒DNA传递到体外培养的巨噬细胞中并进行表达；小鼠口服携带有pCMVβ的SL7207后，能在脾脏、派伊尔结、肠系膜淋巴结中检测到目的基因的转录，并可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。与肌内注射pCMVβ相比较，口服SL7207(pCMVβ)能更有效地诱导出细胞免疫应答。结论 减毒沙门菌SL7207作为DNA疫苗的载体，可经口服途径进行免疫，并可将质粒直接传递给抗原递呈细胞，诱导出以细胞免疫为主的免疫应答。     

含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌株的构建与鉴定

目的:构建含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261(减毒鼠伤寒沙门氏菌)疫苗菌.方法:将质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入LB5000(鼠伤寒沙门氏菌)进行甲基化,利用修饰后重组质粒转化终宿主菌SL3261,抗生素筛选后挑取单个菌落扩增进行抽提质粒和PCR鉴定,SL3261疫苗菌与HepG2细胞体外共培养,荧光显微镜和RT-PCR分别检测GFP(绿荧光蛋白)的表达和4-1BBL基因的转录.结果:导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261经抽提质粒电泳后获得了同原转化质粒相同大小的目的条带,质粒PCR获得了约930 bp的条带,200个HepG2细胞感染SL3261为201±46 CFU、SL3261-pIRES2-EGFP为163±37,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32,含质粒SL3261在体外感染HepG2细胞的能力同原细菌基本相同(P＞0.05).感染含质粒SL3261的HepG2细胞观察到GFP表达,感染含重组质粒SL3261的HepG2细胞经RT-PCR检测到约930 bp的目的条带.结论:成功构建了能携带大鼠4-1BBL基因真核表达质粒的SL3261疫苗菌.     

淋球菌重组与减毒鼠伤寒沙门氏菌活疫苗口服免疫的初步研究

在克隆淋球菌膜抗原CppB基因并在大肠杆菌和减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得高效表达的基础上,用表达CppB-LacZ融合蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌口服免疫Balb/c小鼠。ELISA检测表明被免疫小鼠血清中特异性抗体滴度可达1:160,并诱发了DTH反应,说明产生了特异的免疫反应。重组菌可在肠道中较持久地寄生,对小鼠未见有明显的毒副反应。     

重组减毒细菌运送CD8+T细胞表位的效应分析

目的:分析重组减毒菌体外运送CD8 T细胞表位的效应。方法:以表达卵清蛋白(OVA)和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)CD8 T细胞表位的重组菌13A(ptG2F)、25A(ptG2F)和SL7207(ptG2F)感染抗原提呈细胞(APC)LKb、LLd和骨髓源树突状细胞(BMDC),应用体外抗原提呈试验检测APC对重组菌运送的CD8 T细胞表位的提呈效应。结果:感染试验证实,减毒菌13A、25A和SL7207对LKb细胞或LLd细胞均具有良好的侵袭能力,BMDC对重组菌具有很好的摄取功能。抗原提呈试验结果显示,在感染的早期(2h),LKb、LLd细胞和BMDC均可提呈重组菌13A(ptG2F)或SL7207(ptG2F)运送的T细胞表位;在感染的晚期(48h),LKb细胞对OVA257-264CD8 T细胞表位的提呈效应降低,LLd细胞对LCMV118-132CD8 T细胞表位的提呈效应增强。3种APC均不能提呈25A(ptG2F)运送的T细胞表位。另外,在同样的作用条件下,BMDC对减毒菌运送的抗原表位的提呈效应要强于LKb和LLd细胞。结论:重组菌能运送CD8 T细胞表位,为基于减毒细菌的新型基因工程疫苗的分子设计提供了有益借鉴。     

实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌方法的建立和应用

目的建立丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,用于沙门菌属内的分型鉴定。方法根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立实时PCR检测方法。结果检测体系灵敏度高,纯DNA和菌液的最低检出限分别可达10fg和20CFU/反应体系;特异性好,对71株细菌的检测符合率达100%。20株沙门菌采取盲号模拟血培养标本进行血培养检测及鉴定,检出5株丙型副伤寒沙门菌和4株猪霍乱沙门菌,与试验的菌株相符。70份食品中用实时荧光PCR同时检测丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌均为阴性,而用传统方法分离培养未检出。结论建立的实时PCR检测方法可以快速、特异、灵敏地检测出丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌。     

表达自杀基因的减毒伤寒沙门氏菌对肿瘤的抑制作用

目的 研究表达自杀基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌对肿瘤的抑制作用。方法 把表达自杀基因的质粒（pc-CD)导入减毒的鼠伤寒沙门氏菌,以荷瘤鼠为模型研究沙门氏菌／自杀基因与5－FC系统对肿瘤的抑制作用。结果 该系统能抑制肿瘤生长,延长荷瘤鼠的存活期。结论 鼠伤寒沙门氏菌可以作为基因治疗的候选载体。     

Salmonella Typhi： from a Human Pathogen to a Vaccine Vector

Salmonella （S.） typhi is an important intracellular pathogen. Among the more than 2,300 closely-related Salmonella serovars bacteria recognized, S. typhi is the only one that is pathogenic exclusively for humans, in whom it causes typhoid or enteric fever. The pathogen has been around for many years and many studies have been done in an effort to combat it. Molecular and biologic features of S. typhi and host factors and immune responses involved in Salmonella invasion have been extensively studies. Vaccines that have been developed most notably are Vi polysaccharide and Ty21a. However, as the results show, there is still a long way to go. It is also shown that multi-drug resistance has occurred to the few available antibiotics. More and more studies have shown that Salmonella can be used as a vaccine vector carrying antigens of other pathogens. This has been promising in that the immune system can be elicited in response to both the Salmonella bacteria and the antigen of the pathogen in question. This review aims to highlight some of the milestones attained in the fight against the disease from the time S. typhi was seen as a pathogen causing typhoid fever to the use of Salmonella as a vaccine vector. Cellular ＆ Molecular Immunology.     

比较可表达产生VLP颗粒的CHIKV DNA疫苗和减毒活疫苗在小鼠中的免疫效果

目的:比较可表达产生病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）的CHIKV DNA疫苗与CHIKV181/clone25减毒活疫苗在小鼠中的免疫应答与保护效果。方法:C57BL/6n小鼠分别用CHIKV DNA疫苗20 μg以肌肉注射加电转的形式免疫2次,CHIKV181/clone25减毒活疫苗10...     

HCMV pp65核酸疫苗表达载体的构建及其体内免疫效果评价

目的 构建人巨细胞病毒(HCMV)pp65基因表达载体并初步评价其作为核酸疫苗的体内免疫效果。方法利用分子克隆方法构建HCMVpp65表达载体pcDNA3．pp65；对其活性进行体外鉴定后，以肌肉和皮下2种途径、3种剂量组免疫小鼠；测量免疫小鼠的体重、体温等一般状况，利用M3T方法测定免疫小鼠的T细胞增殖活性、NK活性，利用ELISA方法测定小鼠的抗HCMV IgM、IgG抗体，免疫小鼠血清的病毒中和实验。结果成功构建：HCMVpp65表达载体pcDNA3．pp65并免疫小鼠后，小鼠体重、体温等一般状况未见明显变化，T细胞增殖活性增强，NK细胞活性增强，HCMVIgM、IgG抗体增高，且有时间、剂量依赖性，免疫小鼠血清对HCMV有部分中和作用。结论pcDNA3．pp65表达载体可引起机体特异性细胞免疫和体液免疫，可作为一种有一定应用前景的核酸疫苗进一步深入研究。     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的 构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础.方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd -pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd -pVAX1-BLS-L7/L12).以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价.结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生.通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主.结论 所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主.可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗.