人肿瘤坏死因子-α基因真核表达载体的构建

目的 :构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha(hTNF α)基因的真核表达载体。方法 :应用RT PCR的方法从足月妊高征患者的胎盘组织中 ,扩增出hTNF αcDNA ,连接至载体pMD 18 Tvec tor中 ,经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3.1 myc his(- )A ,B ,C的相应酶切位点 ,通过RT PCR方法检测其在体外转导绒癌耐药细胞后hTNF α基因的表达。结果 :自胎盘中克隆的hTNF αcDNA经序列测定证实 ,与Genbank的序列完全一致 ;用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实 ,克隆基因正确插入载体pcDNA3 1 myc his(- )A ,B ,C。经脂质体介导转导绒癌耐药细胞后 ,检测到其在转导的细胞中稳定表达。结论 :通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF αcDNA全长的真核表达载体     

人TNFα真核表达载体的构建及其在人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM中的稳定表达

目的：构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha （hTNF-α） 基因的真核表达载体,建立稳定表达hTNF-α基因的细胞模型.方法： 应用RT-PCR 的方法从分离的正常人外周血单核细胞（LPS刺激）中,扩增出hTNF-αcDNA ,连接至载体pMD18-T vector中,经酶切鉴定与序列测定证实;以亚克隆法构建于真核表达载体pBK-CMV的相应酶切位点, 转化至大肠埃希菌DH5α,最后将表达的pBK-hTNFα重组蛋白行SDS-PAGE电泳,并作考马斯亮蓝染色分析,Western blot鉴定;经脂质体Lipofectamine2000转染HepG2/ADM细胞后,经G418筛选,通过ELISA、RT-PCR方法检测其在体外转染肝癌耐药细胞HepG2/ADM后hTNFα基因和蛋白的表达.结果：自正常人外周血单核细胞中克隆的hTNF-αcDNA 成功连接到pMD18-T vector,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切、经序列测定证实,与Genbank的序列完全一致;pBK-hTNFα的克隆表达重组蛋白经Western blot证实此蛋白为hTNFα.克隆基因正确插入载体pBK-CMV中.pBK-hTNFα经脂质体介导转染肝癌耐药细胞后, ELISA、RT-PCR方法检测到其在转染细胞中稳定表达.结论：通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF-αcDNA 全长的真核表达载体pBK-hTNFα.     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的：建立稳定的基因工程细胞系。方法：将含有人肿瘤坏死因子α（hTNFα）全长cDNA插入表达载体pSNAV2．0，产生重组质粒pSNAV2．0-TNFα，利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中，G418筛选阳性克隆hTNF／293，采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果：通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明：在质粒pSNAV2．0中插入片段正确。采用RT—PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达，分子量为17KDa。结论：成功构建重组质粒pSNAV2．0-TNFα，真核表达载体构建正确，转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白，并能分泌到细胞外。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆血管内皮生长因子C（Vascular Endothelial Growth Factor C）功能片段的cDNA，构建人VEGF-C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C在宫颈癌中表达的意义及在淋巴管生长及转移中的作用。方法：根据人VEGF—CcDNA序列，设计合成二对特异性引物，第一对5’端含有EcoR Ⅰ及第二对3’端含有XhoI酶切位点。运用RT—PCR法克隆人MDA—MB231中的VEGF—C cDNA部分编码序列（CDS）：经双酶切后将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），重组质粒在处于感受态的大肠杆菌DH5d中扩增，纯化。通过PCR和双酶切鉴定阳性重组子及进行基因序列的测定。结果：用RT—PCR克隆到VEGF—CcDNA部分CDS；PCR和双酶切鉴定阳性重组子，显示有人VEGF—C cDNA编码序列，基因序列测定显示重组质粒上插入的人VEGF—C序列正确。结论：从富含VEGF—C的人MDA—MB231细胞系中克隆得到的VEGF—C基因功能片段cDNA．成功构建了人真核表达栽体pcDNA3．1（＋）／VEGF-C。     

RT-PCR构建人甲胎蛋白全长基因真核表达载体

目的采用反转录PCR(RT—PCR)构建人甲胎蛋白(Alpha—Fetoprotein，AFP)全长基因真核表达载体，为下一步应用以AFP蛋白为靶点的基因治疗作准备。方法体外培养人肝癌细胞HepG2，Trizol裂解细胞，提取总mRNA。设计含有特定酶切位点BglⅡ，SalⅠ和真核启动元件Kozak序列的RT—PCT正反向引物，采用RT—PCR法克隆AFP全长cDNA，使用BglⅡ SalⅠ双酶切载体pEGFP—C3载体和AFP cDNA，将AFP cDNA连接载体pEGFP—C3，构建新的真核表达载体，命名为pEGFP—AFP。结果通过测序证明pEGFP—AFP真核表达载体含有AFP全长基因：结论：本研究成功构建人甲胎蛋白基因真核表达载体pEGFP—AFP，为进一步的分子试验和基因治疗打下了基础。     

pEGFP-BLCAP真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pEGFP—BLCAP并转染骨肉瘤细胞SOSP—M。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP—M细胞中提取总RNA，经RT—PCR获得BLCAP基因的cDNA，测序正确后插入真核表达载体pEGFP—C2中。构建的重组质粒经脂质体介导转染SOSP—M细胞，经观察荧光蛋白表达和Western blot鉴定目的蛋白在转染后的SOSP—M细胞中的表达情况。结果：RT—PCR成功地扩增出一条约280bp的片段，经限制性内切酶分析和DNA序列测定证实目的基因cDNA已插入重组质粒；荧光显微镜下观察到转染后的SOSP—M细胞发出较强绿色荧光，Western blot证明BLCAP能以融合蛋白的形式在SOSP—M细胞中获得表达。结论：构建了真核表达载体pEGFP—BLCAP并成功表达目的蛋白。     

VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

人MAGE-3真核表达载体的构建与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因，构建真核表达载体，建立MAGE-3阳性细胞株，制备肿瘤核酸疫苗。方法 用RT—PCR方法扩增MAGE-3cDNA，以pcDNA3．1 为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT—PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。结果 正确构建了pcDNA3．1／MAGE-3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达。结论 成功构建了pcDNA3．1／MAGE-3真核表达质粒，建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

分泌型人白细胞介素18重组质粒的构建及其真核表达

目的：构建带IL—12 P40信号肽序列的分泌型IL—18质粒，使其在真核细胞中稳定表达。方法：根据IL—12 P40的信号肽cDNA序列及人成熟IL—18序列设计4条特异性引物，用RT—PCR法自人树突状细胞中分别扩增IL—12 P40信号肽序列(片段A)及成熟IL—18基因(片段B)，用重叠延伸PCR法拼接和扩增融合基因(片段C)，连接制备pGEM—T克隆载体，亚克隆至pcDNA3．1^ 。转染NCI—H460人肺癌细胞株，经RT—PCR和Western blot检测IL—18的表达。结果：表达质粒的酶切图谱符合预期的结果，测序结果与预期的cDNA序列完全一致，转染细胞株表达了IL—18。结论：成功地构建了含IL—12 P40信号肽序列的IL—18表达质粒，并在人肺癌细胞株中得到了表达。     

高表达CypA肝癌细胞系的建立及其功能初步研究

目的：构建含人全长CypA cDNA的真核表达质粒,建立高表达CypA蛋白的肝癌细胞系,为进一步研究CypA在肝癌中的功能和作用机制提供细胞模型。方法：将人全长CypA cDNA序列克隆后,连接至真核表达载体pcDNA3.1中,再将构建的真核表达载体转染至FHCC98肝癌细胞中,经G418加压筛选后获得稳定表达CypA的肝癌细胞株;免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况;MTT法测定细胞的增殖速率。结果：真核表达载体pcDNA3.1-CypA经酶切、测序鉴定,结果正确;免疫印迹结果显示,稳定转染后细胞的CypA表达水平显著高于空载体转染和未转染的细胞;与对照相比,稳定高表达CypA的细胞增殖速度加快。结论：成功构建了含有人全长CypA cDNA序列的真核表达载体pcDNA3.1-CypA;建立了稳定高表达CypA的FHCC-98肝癌细胞系;CypA的高表达可以促进FHCC98细胞的增殖。     

人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的：扩增人核糖体蛋白S13（RPS13）编码基因序列，构建其正，反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，利用DNA重组技术的建正，反义真核表达载体，经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，筛选正，反义基因稳定转染细胞，RNA斑点杂交法检测正，反义稳定转染细胞mRNA水平的变化。结果：从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA，RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，并经测序证实；目的基因因按正，反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),并经酶切鉴定证实；经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞，反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞，G418筛选获得稳定转染细胞；RNA斑点杂交试验证实；正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调，反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调。结论：成功克隆了人RPS13编码基因序列，并构建了其正，反义真核表达载体，在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞，正义转染细胞中RPS13mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。     

人肿瘤坏死因子-α基因转导绒癌耐药细胞系体外耐药逆转的研究

目的 将人肿瘤坏死因子-alpha(hTNF-α)基因导入已建立的绒癌耐药细胞系，观察hTNF-α基因转导后对绒癌细胞耐药性逆转的体外作用。方法 通过阳离子脂质体将hTNF-α基因转导绒癌耐药细胞系，用新霉素筛选含hTNF-α片段的单细胞克隆，用RT-PCR方法和细胞免疫组织化学方法，检测转导hTNF-α基因的耐药细胞中MDRl mRNA和MDRl蛋白(P-gp)表,达水平的改变。采用四甲基偶氮唑蓝比色法，检测转导hTNF-α基因的耐药细胞对足叶乙甙(VP-16)的耐药指数。结果 转导hTNF-α基因后，绒癌耐药细胞中检测出hTNF-α mRNA表达，转导hTNF-α基因在mRNA水平能一定程度的逆转绒癌耐药细胞的MDRl，而在P-gp蛋白水平几乎能完全逆转绒癌耐药细胞的MDRl。转导hTNF-α基因的细胞的耐药指数明显降低。结论 hTNF-α基因转导后，可通过调节MDRl的表达，来逆转绒癌耐药细胞系的耐药性。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的:建立稳定的基因工程细胞系.方法:将含有人肿瘤坏死因子α(hTNFα)全长cDNA插入表达载体pSNAV2.0,产生重组质粒pSNAV2.0-TNFα,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中,G418筛选阳性克隆hTNF/293,采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达.结果:通过Sal I和EcoR I双酶切、PCR及测序鉴定证明:在质粒pSNAV2.0中插入片段正确.采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFct蛋白表达,分子量为17KDa.结论:成功构建重组质粒pSNAV2.0-TNFα,真核表达载体构建正确,转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白,并能分泌到细胞外.     

人α1抗胰蛋白酶基因的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的克隆人α1抗胰蛋白酶(α1-AT)基因并在真核细胞中表达。方法以人α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)基因的总RNA为模板，采用反转录PCR法得到α1-AT的编码区cDNA，构建真核表达载体pcDNA3．1( )-α1-AT，在脂质体介导下转染非洲绿猴肾细胞系COS-7，经G418压力筛选建立稳定转染人α1-AT的细胞系，用Western印迹检测其在COS-7细胞中的表达。结果获得的人α1-AT cDNA序列与文献报道的核苷酸序列一致，Western印迹证实稳定转染人α1-AT的COS-7细胞系中有α1-AT的表达。结论构建了人α1抗胰蛋白酶的真核表达载体，并在COS-7细胞中获得稳定表达。     

非编码RNA—UCA1对膀胱癌细胞耐药及转化能力的影响

目的：构建长链非编码RNA—UCA1的真核表达载体pcDNA／UCA1,探讨UCA1对膀胱癌细胞BLs-211耐药及转化能力的影响。方法：构建UCA1的真核表达载体pcDNA/UCA1,用脂质体2000将pcDNA/UCA1表达载体及空载体pcDNA3.1转染人膀胱癌细胞BLS-211细胞,用G418筛选,建立稳定表达UCA1 RNA的BLs-211／UCA1细胞及转染空载体的BLs-211／pcDNA31细胞,用RT—PCR方法检测两株细胞中UCA1及neo基因的表达,鉴定阳性细胞株,通过四甲基偶氮唑蓝（M竹）比色法检测两株细胞对顺铂及丝裂霉素耐药的变化,软琼脂克隆形成实验检测两株细胞克隆形成率的变化。结果：成功构建pcDNA／UCA1真核表达载体,并建立起稳定表达UCA1的BLs-211／UCA1细胞,表达UCA1 RNA后,BLs-211／UCA1细胞对顺铂及丝裂霉素c的耐药性增加,软琼脂克隆形成能力增强。结论：UCA1 RNA增强了膀胱癌细胞BLs-211的耐药能力及转化能力,可能在膀胱癌复发及进展中发挥作用。     

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，构建真核表达载体，本研究拟探索该基因在肿瘤基因治疗中的应用基础。方法 根据GenBank数据库提供的CD基因核苷酸序列，设计并合成一对引物，采用PCR方法，从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因，并与pcDNA3．1定向连接，构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体pcDNA3．1-CD，并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定。结果克隆了大肠杆菌CD基因，并构建了真核表达载体，经限制性内切酶酶切、PCR扩增和DNA测序证实了其正确性。结论 pcDNA3．1-CD真核表达载体构建成功。     

VEGF165-PE38重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达

目的构建血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物（PE38）基因的真核融合表达载体,研究其在HEK293细胞中的表达情况。方法通过PCR获得实验需要的VEGF165基因片段,通过酶切pRB391质粒获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建VEGF165与PE38融合基因的真核表达载体pIRES2-VEGF165-PE38-EGFP,重组质粒经限制性内切酶及DNA序列测定证实构建成功后,用Lipofectamine2000脂质体转染HEK293细胞,然后用RT—PCR及ELISA法检测VEGF165-PE38融合蛋白在HEK293细胞的表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,VEGF165-PE38融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pIRES2-EGFP,RT—PCR及ELISA法检测证实重组基因可在HEK293细胞表达。结论VEGF165-PE38融合基因可在HEK293细胞中表达,为进-步研究其对肿瘤血管内皮细胞的靶向毒性及临床应用奠定基础。