脱髓鞘病变中轴突损伤的实验研究

目的 探讨多发性硬化等脱髓鞘疾病中轴突的损伤以及轴突损伤出现的时间、形态特征.方法 用MOG35-55蛋白多肽免疫C57BL/6J小鼠复制多发性硬化的动物模型,结合常规形态学染色和神经系统特殊染色,在疾病发作前期、疾病发作期、高峰期和慢性期不同时间点观察炎症反应、髓鞘脱失和轴突的变化.结果 髓鞘的脱失和轴突的损伤出现在疾病的发作前期,并且这种改变与炎症细胞浸润及髓鞘脱失有密切的关系.损伤的轴突在形态上表现为不规则、肿胀、直径不一致、扭曲;轴突断裂,在断端呈球状、卵圆形或橄榄状;另一种突出的变化是轴突消失.结论 脱髓鞘病变中轴突的损伤是一种早期的和普遍的病变,且轴突的损伤与多种因素有关.     

多发性硬化、实验性变态反应性脑脊髓炎与细胞粘附分子

细胞粘附分子(Cellular Adhesion Molecules,CAMs)是一类介导细胞与细胞，细胞与细胞外基质间粘附作用，位于细胞膜表面的大分子糖蛋白。CAMs主要分为免疫球蛋白超家族、整合素家族、选择素家族等，以配体相对应的形式发挥作用。实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimental Allergic Encephalomyelitis，EAE)为多发性硬化(Multiple     

SD大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎模型的建立

目的探索SD大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）模型制作的试验方法与技术。方法采用完全福氏佐剂-脑脊髓匀浆，并辅以注射百日咳疫苗诱导SD大鼠EAE模型，比较不同的免疫原（同种或异种），注射方法（一次或多次注射）以及性别差异对模型制作的影响。观察和比较动物的神经症状和病理改变。结果使用同种脑脊髓匀浆，多次注射雌性SD大鼠诱导的模型，其发病持续时间分别为16～20天，10～14天；发病率为85％；复发率为46．67％，而致死率仅有5．88％；明显优于其他组别。病理学证实发病大鼠具有典型的脱髓鞘改变和胶质结节形成。结论使用同种脑脊髓匀浆，多次注射雌性SD大鼠诱导的动物模型其临床表现、病理特征、病程特点与人类的多发性硬化（MS）具有很大的相似性，适用于MS的研究。     

树突状细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎病程进展中作用的研究

目的：研究树突状细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎病程进展中的作用。方法：诱导实验性变态反应性脑脊髓炎模型，采用直接免疫荧光法观察树突状细胞在外周淋巴结和中枢神经系统中分布及数量的变化。结果：免疫后第4、7、9天外周淋巴结树突状细胞数量逐渐增加，免疫后第9天脑、脊髓中才出现树突状细胞浸润。免疫后第15天外周淋巴结及中枢神经系统中树突状细胞数量均达高峰，第23天其数量减少。实验性变态反应性脑脊髓炎组与对照组差别显著。结论：树突状细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎的发生、发展、转归，尤其在触发发病中起着重要作用。     

不同种系动物诱导实验性变态反应性脑脊髓炎模型的研究

目的：探索国内不同种系动物诱发实验性变态反应性脑脊髓炎（ＥＡＥ）的可能性,寻找诱导ＥＡＥ的合适实验动物,以推进国内临床神经免疫学的研究。方法：用含异种动物脊髓的完全弗氏佑剂乳化物作为抗原,进行动物背部皮下多点注射,观察和比较动物的神经症状和病理变化。结果：（１）抗原诱导ＥＡＥ,如果发病,一般都在注射捩的２周后开始出现症状,在注射后１９天左右症状最明显,且脑组织出现明显的炎性病理变化。（２）ＳＤ大鼠     

CD28在实验性变态反应性脑脊髓炎发病机制中作用的研究

本文通过临床试验研究了CD28在实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)免疫发病机制中的可能作用,为脑脊髓炎的临床研究与治疗提供了宝贵的科学依据和理论指导.     

大鼠急性实验性变态反应性脑脊髓炎模型的建立

目的建立大鼠急性实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)模型.方法采用豚鼠脊髓和福氏完全佐剂混合乳剂一次性注入Wistar大鼠双足垫和尾部,同时腹腔注射左旋咪唑诱导大鼠发生EAE.观察发病情况;HE染色观察病理变化;Loyez氏髓鞘染色法观察髓鞘改变.结果空白对照组大鼠均未出现症状,HE染色大脑白质及脊髓无炎性细胞浸润;Loyez氏染色未见髓鞘脱失;模型组临床症状发生率为87.5%,HE染色见大脑白质及脊髓血管周围有大量炎性细胞浸润;Loyez氏染色见部分脱髓鞘改变.结论用豚鼠脊髓髓鞘蛋白和福氏完全佐剂混合乳剂同时辅以左旋咪唑成功地诱导Wistar大鼠发生急性EAE.     

左旋咪唑激发大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎的初步观察

目的：观察左旋咪唑(LMS)激发大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的作用。方法：将Wistar大鼠分为5组：Control组、GPSCH(琢鼠全脊髓匀浆) CEA(完全福氏佐剂)组、LMS组、LMS CFA组和CFA组，采用动物行为学、常规HE和LFB染色法观察动物的发病情况与中枢神经系统(CNS)的病理变化情况。结果：①LMS CFA组2/10和GPSCH CFA组5／10大鼠出现典型的EAE行为学改变、CNS炎性细胞浸润和髓鞘脱失。②CFA组8／10大鼠出现住剂性关节炎症状，未见CNS炎性细胞浸洞和髓鞘脱失。③LMS组和Control组都未见动物行为学和CNS病理学改变。结论：LMS CFA可直接激发EAE，而不需要全脊髓匀浆的诱导。     

树突状细胞与实验性变态反应性脑脊髓炎

自身免疫性疾病的激发和自身反应性T细胞的激活与维持的机制尚不十分清楚。作为有力的抗原呈递细胞(APC)的树突状细胞(DC)，兼有抗原传递以及初级致敏T细胞的作用，可以破坏自身忽略并诱发进展的自身反应性T细胞。在自身免疫性疾病中，不同类型的树突状细胞在诱导Th1／Th2细胞的反应中发挥了重要作用。特定的细胞因子可以诱导免疫源性的树突状细胞向耐受源性的树突状细胞分化。     

MBP_(68-86)与MBP_(87-99)诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的轴突损伤修复及其机制研究

目的观察髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)68-86及MBP87-99诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠模型中淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)及生长相关蛋白(growth-associatedprotein,GAP)-43mRNA表达及其环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)-蛋白激酶(protein kinase,PKA)的变化,探讨EAE大鼠发病过程中轴突损伤修复及其可能的分子机制。方法应用不同肽段的MBP68-86或MBP87-99与不完全福氏佐剂及结核杆菌混合制成抗原,皮下注射于大鼠双后足垫,建立大鼠EAE模型。观察其神经功能评分、脑组织病理变化,酶联免疫测定大鼠脑组织cAMP含量,实时荧光定量RT-PCR法测定大鼠脑组织APP、GAP-43及PKA mRNA表达。结果与MBP87-99组大鼠比较,MBP68-86所致EAE病情进展快,神经功能评分较高,炎细胞浸润重并形成袖套状改变。中剂量MBP68-86免疫大鼠第14天,脑组织GAP-43 mRNA表达较正常组明显降低(P<0.05);第28天,APP mRNA表达明显升高(P<0.05)。MBP87-99免疫大鼠第28天,APP mRNA表达较正常组和小剂量MBP68-86明显上升(P<0.05);GAP-43 mRNA表达较大、小剂量MBP68-86明显升高(P<0.05)。大、小剂量MBP68-86与MBP87-99免疫大鼠第28天,脑组织cAMP水平均较正常组明显增高(P<0.01或P<0.05),中剂量MBP68-86与MBP87-99组大鼠脑组织PKA mRNA表达明显升高(P<0.01)。结论 MBP68-86或MBP87-99均可诱导Lewis大鼠产生EAE。可引起脑组织的炎性细胞浸润、脱髓鞘及轴突损伤等,且损伤有一定的自我修复功能,其机制可能与调节cAMP-PKA信号途径有关。综合分析研究结果发现,MBP68-86中剂量(每只50μg)可作为探索EAE发病特点及药物观察的实验模型。     

雌激素对实验性自身免疫性脑脊髓炎的保护作用

目的 检测雌激素在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的预防性治疗作用并初步探讨其体内作用机制.方法 用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)和完全弗氏佐剂(CFA)免疫C57BL/6J小鼠制备EAE模型;雌激素于建模始每日皮下注射50 μmol/L进行治疗,通过发病指数评分、脊髓病理分析、炎症因子水平检测,并应用流式细胞仪(FACS)及实时荧光定量PCR(qPCR)评价治疗效果;进一步通过分析小鼠脾细胞及脊髓相关功能分子CD4/PD-l、CD19/PD-L1、CD4/CD25/Foxp3、CD19/CD21/CD23及CD 19/CD5/CDl dhigh的表达变化,探讨雌激素可能的作用机制.结果 雌激素预防性治疗可有效延缓EAE小鼠的发病,减轻脱髓鞘病变.病理结果显示,雌激素治疗能减少小鼠脊髓组织炎性细胞的浸润,同时下调外周炎性因子TNF-a及IL-17A的分泌表达(P＜0.01);与模型组相比,雌激素治疗下调T淋巴细胞表面活化分子CD69的表达(P＞0.05)并可显著上调CD4+T细胞表面PD-1的表达(P＜0.05);同时,雌激素治疗后PD-1的配体CD19+B细胞表面PD-L1的表达明显上调(P＜0.01),脾细胞中CD19+CD21highCD23low(P＜0.01)及CD19+CD5+CD1dhigh(P＜0.01)的比例也有不同程度的升高,但对脾细胞中CD4+CD25Toxp3*的表达无明显作用.结论 雌激素预防性治疗可延缓EAE小鼠的发病进程,其作用机制可能与上调PD-1/PD-L1通路并上调调节性B细胞水平有关.     

黄岑苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的影响

目的观察不同浓度黄岑苷(baicalin)对实验性自身免疫脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型的作用,并研究其初步机制。方法建立实验性自身免疫性脊髓炎小鼠模型,免疫后第3天给予高低剂量黄岑苷灌胃,每天1次,共20 d。对小鼠活动进行神经功能评分,TUNEL染色检测脊髓组织细胞凋亡情况,ATP水平检测试剂盒检测脊髓组织ATP含量水平,免疫印迹法(Western blot)检测Bax、Bcl-2、cleaved cas-9和cleaved cas-3蛋白表达水平。结果黄岑苷能够提高实验性自身免疫脑脊髓炎小鼠神经功能,延后发病时间;黄岑苷干预后,Tunel染色结果显示脊髓组织凋亡细胞数下降,ATP水平下降,免疫印迹法结果显示Bcl-2的蛋白表达显著上升,Bax、cleaved cas-9和cleaved cas-3的蛋白表达显著下降。结论黄岑苷可通过抑制线粒体内源性凋亡途径抑制细胞凋亡,保护线粒体,提高实验性自身免疫脑脊髓炎小鼠神经功能,为预防疾病提供了实验理论依据。     

C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立

目的:建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型,为探讨多发性硬化的免疫病理机制和实验性治疗提供依据.方法:C57BL/6小鼠40只,分为3组.EAE组25只,采用皮下注射完全弗氏佐剂与300 μg MOG35-55制备的乳化抗原,辅以腹腔注射109个/ml百日咳疫苗的方法诱导发病;佐剂组8只,用生理盐水代替抗原肽制备免疫乳剂,余同EAE组;正常对照组7只,仅注射生理盐水.采用H-E和LFB染色的方法观察小鼠EAE模型的组织学改变.结果:从免疫后11 d开始,EAE组小鼠有22只陆续出现EAE临床症状,发病率为88%.佐剂组与正常对照组小鼠均未出现临床神经系统症状.光镜下可见EAE组小鼠的大脑和脊髓组织中有大量的炎性细胞浸润,白质脱髓鞘改变明显.结论:此种造模方法简单可行,模型稳定,可在国内广泛推广.     

Fasudil对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠致脑炎性T细胞的免疫调节作用

目的：探讨法舒地尔(Fasudil)修饰的脾单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的疗效及可能的分子机制。方法：雌性C57BL/6小鼠采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35–55诱导,建立主动免疫EAE模型,免疫后第9天制备脾MNCs,和/无Fasudil培养。作用72 h后收集上述细胞,检测T细胞亚群的变化、Rho激酶(Rho kinase,ROCK)活性和细胞因子水平;以5×107个细胞/只小鼠腹腔注射诱导,建立被动转移EAE模型,并将小鼠分为PBS-MNCs组和Fasudil-MNCs组,每组8只。观察各组小鼠临床评分和体质量变化。结果：免疫第9天EAE小鼠脾致脑炎性MNCs可通过被动转移实验诱导EAE模型的建立,而体外Fasudil修饰的MNCs不能诱导EAE的发生;与PBS-MNCs组相比,Fasudil-MNCs组小鼠体质量减轻较少(P<0.05)。体外实验显示：Fasudil处理的MNCs ROCK活性降低(P<0.01);Fasudil可抑制IFN-γ和IL-17的CD4+T细胞比例(IFN-γ：P<0.01;IL-17：P<0.05),并增强TGF-β和IL-10的CD4+T细胞分泌(均P<0.001);此外,Fasudil可降低细胞因子IL-17水平(P<0.001)和增强细胞因子IL-10分泌(P<0.05)。结论：Fasudil介导的细胞治疗通过抑制辅助性T细胞1(helper T cell 1,Th1)和Th17炎性反应,促进Th2免疫调节作用,影响EAE的发生和发展。     

PKA干预淫羊藿苷治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎对中枢神经CREB表达的影响*

目的 研究淫羊藿苷（ICA）治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）对环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的影响,并探讨ICA治疗的作用机制。方法 复制C57BL/6小鼠EAE模型,并将其分为3组,每组 6只。模型对照组：予生理盐水3?ml/d灌胃;ICA组：予以ICA 300?mg/（kg·d）灌胃;ICA+H89组：予以ICA 300?mg/（kg·d）灌胃并予以蛋白激酶A（PKA）特异性阻断剂H89 5?mg/（kg·d）腹腔注射;另取6只未经模型复制的C57BL/6小鼠同等条件下饲养作为正常对照组,予生理盐水3?ml/d灌胃。EAE小鼠在发病达高峰时开始给药,1次/d,连续给药5?d。每日进行神经损害评分,至给药结束后次日。给药结束后次日进行神经损害评分后处死小鼠,立即采集脊髓颈膨大部分进行Western blotting检测,检测CREB的表达。结果 ICA组小鼠神经损害表现明显改善,与治疗前比较差异有统计学意义（P?<0.05）,而ICA+H89组小鼠及模型对照组小鼠神经损害评分均无改善,治疗前后比较差异无统计学意义（P?>0.05）。模型对照组脊髓组织中CREB的表达较正常对照组降低（P?<0.05）。ICA组治疗后CREB的表达与模型对照组比较,差异有统计学意义（P?<0.05）,ICA组CREB的表达升高。但同时给予ICA与H89治疗的小鼠并不能提高脊髓组织中CREB的表达,与模型组比较差异无统计学意义（P?>0.05）。结论 ICA可能是通过PKA途径提高中枢神经系统中CREB的表达,从而发挥对EAE的治疗作用。     

Combined therapy with methylprednisolone and ulinastatin in experimental autoimmune encephalomyelitis

Background Our previous study had demonstrated that ulinastatin （UTI） had a neuroprotective effect in experimental autoimmune encephalomyelitis （EAE）. Methylprednisolone has been recommended to be a standard drug in multiple sclerosis （MS） therapies. The present study was to investigate the protective effects of UTI combined methylprednisolone in EAE. Methods Mice were divided into a UTI treatment group, a methylprednisolone treatment group, a combined treatment group with UTI and methylprednisolone, a normal saline treatment group, and a normal control group. EAE mice were induced in groups receiving different combined treatments, or respective monotherapies. Demyelination was evaluated by Solochrome cyanin staining. 2＇,3＇-cyclic nucleotide 3＇- phosphodiesterase （CNP）/myelin basic protein （MBP）/the precursor form of nerve growth factor （proNGF）/p75/inducible nitric oxide synthase （iNOS） proteins in cerebral cortex of EAE were detected by Western blotting. Results The combined treatment group had a lower clinical score （0.61±0.06） and demyelinating score （1.33±0.33） than the groups with normal saline （clinical score： 1.39±0.08, P 〈0.001; demyelinating score： 2.75±0.49, P 〈0.05） or monotheraphies. Compared with the saline treated EAE group, UTI combined methylprednisolone significantly increased expressions of CNP （1.14±0.06 vs. 0.65±0.04, P 〈0.001）, MBP （1.28±0.14 vs. 0.44±0.17, P 〈0.001）, and decreased expressions of proNGF （1.08±0.10 vs. 2.32±0.12, P 〈0.001）, p75 （1.13±0.13 vs. 2.33±0.17, P 〈0.001）, and iNOS （1.05±0.31 vs. 2.17±0.13, P 〈0.001） proteins in EAE. Furthermore, UTI combined methylprednisolone could significantly upregulate MBP （1.28±0.14 vs. 1.01±0.15, P 〈0.05） expression and downregulate iNOS （1.05±0.31 vs. 1.35±0.14, P 〈0.05） expression compared to methylprednisolone treatment EAE group. And proNGF expression was significantly lower in combined treatment （1.08±0.10） than that in UTI （1.51±0.24, P 〈0.05） or methylprednisolone （1.31±0.04, P 〈0.05） treatment group. Conclusion Combination treatment of UTI with methylprednisolone was shown to protect EAE, suggesting that combination therapy is a potential novel treatment in MS.     

一种慢性EAE模型的制备方法

目的:通过探讨一种慢性实验变态反应性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型的制备方法,为研究多发性硬化的发病机制打下基础.方法:72只近交系清洁级8～10周健康雌性C57BL/6J小鼠,随机分为发病组、佐剂组和空白对照组,各组小鼠又分为发病初期、发病高峰期和慢性期组.发病组用mMOG35-55免疫C57BL/6J小鼠制成慢性EAE动物模型.结果:本实验终止时,发病组C57BL/6J小鼠累计有20/24(83.3%)的小鼠发病,累计有1/24(8.3%)的小鼠死亡,最高临床症状评分达5级,即全身皆瘫后死亡.发病组小鼠第1次免疫后13 d内均未发病,14～20 d发病,20～24 d达高峰,28～32 d进入慢性期,部分临床症状可缓解;空白对照组和佐剂组均没有发病.发病小鼠病理学检测有特征性表现.结论:本实验采用人工合成mMOG35-55与自制完全弗氏佐剂混合而成抗原乳剂,成功建立了慢性EAE小鼠模型.本实验所复制的慢性EAE模型具有发病率高、死亡率低、模型稳定的特点,可用于研究多发性硬化.