黏附分子CD146在人脐静脉内皮细胞的表达

目的：观察正常人脐静脉内皮细胞（HLWECs）上黏附分子CD146的表达及其表达部位,初步探讨CD146与内皮细胞的关系及其生理意义。方法：体外培养的HUVECs连续观察72h,分别收集培养24h、48h、72h细胞,用反转录一聚合酶链反应方法（RT-PCR）检测CD146mRNA的表达;流式细胞仪和免疫荧光法测定CD146蛋白质的表达及其定位。结果：（1）CD146mRNA水平的表达：HUVECs在培养早期（24h）即表达CD146mRNA（0．27±0．0274）,但延长细胞的培养时间似乎并没有进一步改变CD146mRNA的表达水平（0．31±0．0466,0．35±0．0249,P〉0．05）。（2）CD146蛋白质水平的表达和定位：流式细胞仪检测显示CD146单抗-FITC阳性标记于36．78％的HUVECs,平均荧光强度为45．54;免疫荧光提示（CD146主要表达于HUVECs细胞膜上,而在细胞核和胞浆中也有少量表达。体外培养的HUVECs相互融合时,位于细胞膜上的CD146表达增强,呈线性、连续性地表达于细胞-细胞间的连接部位。结论：体外培养的HUVECs连续性的表达黏附分子CD146,主要位于细胞膜上,胞核及胞浆亦有少量表达;CD146在细胞内外的表达强度有赖于细胞间联系的建立和细胞增殖的程度,CD146在促进细胞生长和维持组织完整性等方面发挥重要作用。     

用培养人脐静脉内皮细胞法观察体外循环对内皮细胞的损伤作用

目的　采用体外培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) ,观察体外循环 (CPB)后人体炎性血浆对内皮细胞(EC)的影响。　方法　选取风湿性心瓣膜病行人工瓣膜置换术患者 2 0例 ,取不同时间点的 CPB血浆。将已培养好的HU VEC随机分为 4组 ,对照组 :加入正常培养基 ; 组 :加入 CPB 4 5分钟的血浆 ; 组 :加入 CPB 90分钟的血浆 ; 组 :加入 CPB90分钟血浆 抑肽酶。观察未贴壁悬浮 EC、组织型纤活酶激活物 (t- PA)功能、EC分泌血小板颗粒膜蛋白 - 14 0 (GMP- 14 0 )、6 -酮 -前列腺素 F1α(6 - K- PGF1α)和乙酰胆碱刺激 EC合成 NO的变化。　结果　悬浮细胞数和t- PA, 组和 组显著高于对照组 , 组与 组比较显著降低 (P<0 .0 1)。各组间 GMP- 14 0差别均无显著性意义。6 - K- PGF1α, 组、 组和 组均显著高于对照组 , 组与 组比较显著降低 (P<0 .0 5 )。 NO 组比对照组显著升高 , 组比对照组显著降低 ; 组与 组比较显著升高 (P<0 .0 5 )。　结论　 CPB可激活或损伤 EC,抑肽酶可减轻此作用 ,用培养的 HU VEC研究 CPB损伤 EC的机制是一种可行的方法。     

人端粒酶逆转录酶mRNA导入对人血管内皮细胞生长的影响

目的 寻求使处于生长停滞期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖寿命延长的方法。方法 将体外转录质粒pcDNA3-hTERT用BamHI酶切使之线性化，经T7RNA聚合酶催化以转录合成hTERTmRNA。用脂质体法将hTERTmRNA导入处于生长停滞期的HUVEC。检测hTERTmRNA导入后细胞端粒酶活性表达与细胞生长增殖情况。结果 导入hTERTmRNA后，细胞有端粒酶活性的暂时表达，增殖寿命较单纯用脂质体处理的对照细胞延长了7代。结论 hTERTmRNA导入细胞能可控地、瞬时地重建细胞端粒酶活性，可望广泛应用于人体细胞增殖寿命延长的尝试。     

深低温冻存降低人脐静脉血管内皮细胞的免疫原性

目的 探讨深低温冻存对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)免疫原性的影响.方法 体外分离、培养HUVEC,将传代至第2代的HUVEC进行冻存、复苏.将复苏的HUVEC与人淋巴细胞进行单向混合人淋巴细胞-血管内皮细胞培养(MLEC),观察HUVEC刺激下淋巴细胞增殖情况(测定刺激指数);利用流式细胞仪检测冻存前后HUVEC的HLA-A、B、C及HLA-DR抗原表达的变化;检测不同浓度γ干扰素(IFN-γ)作用下新鲜及冻存HUVEC的HLA-A、B、C及HLA-DR抗原的表达情况.结果 新鲜HUVEC的刺激指数为1.716±0.181,冻存HUVEC为1.686±0.145,二者间的差异无统计学意义(P>0.05).新鲜HUVEC和冻存HUVEC的HLA-A、B、C抗原表达率分别为(96.6±1.9)%和(96.0±1.4)%,表达强度分别为84.1±5.7和82.4±4.8,二者间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).新鲜HUVEC和冻存HUVEC均不表达HLA-DR抗原.当IFN-γ的浓度≥100 U/ml时,新鲜HUVEC和冻存HUVEC的HLA-A、B、C表达强度逐渐增强(P<0.01),同一IFN-γ浓度下,新鲜HUVEC和冻存HUVEC的HLA-A、B、C表达强度的差异均无统计学意义(P>0.05);新鲜HUVEC和冻存HUVEC的HLA-DR表达随IFN-γ浓度的升高逐渐加强,其表达率和强度均呈剂量依赖性(P<0.01),新鲜HUVEC较冻存HUVEC表达更显著(P<0.01).结论 在无或低浓度IFN-γ(≤50 U/ml)条件下,深低温冻存对HUVEC免疫原性的影响不显著,而在高浓度IFN-γ(≥100 U/ml)条件下,深低温冻存的HUVEC的HLA-DR抗原表达显著低于新鲜HUVEC,这可能是冷冻降低免疫原性的机制之一.     

脂肪干细胞来源外泌体对人脐静脉血管内皮细胞增殖、迁移及管样分化的影响北大核心CSCD

目的探讨脂肪干细胞来源外泌体(adipose-derived stem cell released exosomes,ADSC-Exos)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、迁移及管样分化的影响。方法取吸脂患者自愿捐赠的脂肪组织,采用酶消化法分离培养获得ADSCs,并行流式细胞检测及成脂诱导鉴定。收集第3代ADSCs上清液提取外泌体,透射电镜观察其形态,Western blot检测其膜表面标志性蛋白Alix和CD63,用纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight分析外泌体粒径分布范围。用PKH26荧光标记的ADSC-Exos与HUVECs共培养后,共聚焦显微镜观察ADSC-Exos能否进入HUVECs。将ADSC-Exos与HUVECs共培养1、2、3、4、5 d,CCK-8法检测ADSC-Exos对HUVECs增殖影响;共培养12 h时ELISA法检测细胞上清液VEGF蛋白表达量。采用Transwell迁移实验检测ADSC-Exos对HUVECs迁移能力的影响。通过体外Matrigel基质胶实验,观察ADSCExos对HUVECs管状结构形成的影响;将HUVECs与Matrigel基质胶混合后联合ADSC-Exos注射在BALB/c雄性裸鼠皮下,2周后检测基质胶中新生血管情况,计算平均血管密度(mean blood vessel density,MVD)。上述实验均以等量PBS作为对照。结果经鉴定所培养细胞符合ADSCs的特征。ADSC-Exos为形态一致的圆形或椭圆形膜性囊泡,表达标志性蛋白Alix和CD63,粒径范围30~200 nm。共聚焦显微镜观察示ADSC-Exos可被HUVECs摄取。CCK-8法检测示,各时间点实验组细胞增殖均优于对照组(P<0.05)。Transwell实验结果显示,实验组跨膜迁移细胞数较对照组显著增多(t=9.534,P=0.000)。在体外Matrigel胶成管实验中,实验组管样结构数明显多于对照组(t=15.910,P=0.000);在体内实验中,实验组MVD亦显著高于对照组(t=16.710,P=0.000)。ELISA检测示,实验组细胞上清液VEGF蛋白表达量明显高于对照组(t=21.470,P=0.000)。结论 ADSC-Exos可促进HUVECs增殖、迁移及管样结构形成,提示ADSC-Exos可促进血管新生。     

辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞分泌IL-6和IL-8的影响

目的：研究辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞分泌IL-6和IL-8的影响。方法：辛伐他汀（5μg／mL，10μg/mL）分别预处理细胞8h后加入100ng／mL的脂多糖（ipopolysaccharides，LPS）共同孵育，用ELISA方法检测不同时间点（1、12和24h）JL-6和IL-8含量变化。结果：空白对照组细胞在不施加任何刺激的情况下可以分泌少量IL-6和JL-8，并随时间的延长分泌量不断增加；LPS刺激组IL-6和IL-8分泌量比对9鼐组明显增加．差异有统计学意义（P〈0．05）；经过辛伐他汀预处理组IL-6和IL-8分泌量明显低于LPS单独刺激（P〈0．01）。结论：辛伐他汀具有抑制LPS刺激血管内皮细胞分泌炎症因子JL-6和JL-8的作用。     

组织工程血管种子细胞培养的实验研究

目的：为血管组织工程的实验研究提供细胞来源，方法：分别采用消化法和和组织块法培养血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，并进行两种细胞的传代、纯化、鉴定以及形态学观察，结果：培养的两种细胞均符合血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的形态特征，结论：所培养的细胞可提供作进一步深入的血管组织工程的研究。     

异丙酚对人脐静脉内皮细胞上细胞间粘附分子-1表达的影响

目的 观察异丙酚对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达及对中性粒细胞(PMN)在内皮细胞上粘附数的影响。方法利用人脐带体外培养获得人脐静脉内皮细胞,将其随机分为空白组、异丙酚组、内毒素组、异丙酚 内毒索组。用流式细胞仪检测人脐静脉内皮细胞上ICAM-1的表达量。利用PMN分离液从人全血中分离出PMN。在光镜下计数PMN在内皮细胞上的粘附数。结果 4 μg/ml异丙酚对人脐静脉内皮细胞上ICAM-1的表达和对PMN在内皮细胞上的粘附数均无显著影响(P>0.05);40μg/ml异丙酚对人脐静脉内皮细胞上ICAM-1的表达和对PMN在内皮细胞上的粘附数均有抑制作用(P<0.01)。结论40μg/ml异丙酚对PMN与内皮细胞之间的过度粘附有抑制作用,从而可能对机体有一定的保护作用。     

兔骨髓单个核细胞体外向内皮细胞诱导的实验研究

[目的]研究兔骨髓单个核细胞(marrowmononuclearcells,MNCs)向内皮方向诱导的简捷有效方法,进行科学的计量分析并观察体外传代培养条件下的主要生物学特点。[方法]梯度离心分离兔MNCs,直接诱导培养,以每106个MNCs收获第1、2代内皮细胞的数量计量内皮细胞的收获效率;传代培养,倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,免疫组化及内皮细胞功能鉴定。[结果]以1×106/cm2的密度接种MNCs,经7~8d培养可收获第1代内皮细胞;第1、2代内皮细胞的收获总量和MNCs的收获量呈显著的正相关,每106个MNCs平均可收获第1代内皮细胞约(7·086±0·75)×104个,平均收获第2代细胞(53·20±6·47)×104个。诱导的内皮细胞为铺路石样,呈单层生长,第2代细胞CD31、八因子相关抗原免疫组化均为阳性,摄取低密度脂蛋白和结合凝集素实验均阳性。[结论]以1×106/cm2的MNCs接种密度,收获第1、2代内皮细胞所需时间较短,收获效率高,在体外培养条件下生物学特性稳定,有望作为骨组织工程血管化的种子细胞。     

异丙酚预先给药对TNF-α诱导人脐静脉血管内皮细胞ICAM-1表达的影响

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种重要的炎性介质,也是重要的免疫调节因子,是炎性反应的早期启动因子,可诱导血管内皮细胞上细胞间黏附分子-1（ICAM-1）等黏附分子表达上调,ICAM-1通过识别炎性细胞上相应的配体来介导炎性细胞向局部组织募集,促进炎性反应的发生。异丙酚是广泛用于临床的静脉麻醉药,可通过抑制炎性反应减轻细胞损伤,但其机制有待进一步研究。本研究拟评价异丙酚预先给药对TNF-α诱导人脐静脉血管内皮细胞ICAM-1表达的影响。     

人-猪异种生物瓣瓣膜材料的实验构建

目的　探讨用组织工程的方法实现异种生物瓣瓣膜材料的内皮化 ,制备新一代的生物瓣瓣膜材料。方法　取自肉联厂宰杀后 2小时内 4℃冰水保存的 8只猪心 ,在无菌条件下取出主动脉瓣分成 4组 :1组戊二醛 (GA) ,2组环氧氯丙烷 (EC) ,3组环氧氯丙烷 +左旋谷氨酸 (EC+L - GA) ,4组环氧氯丙烷 +左旋谷氨酸 +细胞提取液 (EC+L -GA +CE)。再将新生儿脐带 (离体后 6小时内 )用胰蛋白酶消化制备种子细胞 ,接种于加入 M199(10 %的胎牛血清 +2 0 %的混合血清 +黏附蛋白 +内皮细胞生长因子 )的培养液中进行种植 ,每日用倒置相差显微镜观察细胞生长情况 ,并进行内皮细胞 因子的定性检测、细胞生长覆盖密度的检测、光学和电子显微镜观察。　结果　倒置相差显微镜观察 :1组未见细胞生长 ,2组可见有细胞呈散在性生长覆盖 ,但较 3、4组的细胞数及覆盖率明显降低 (P<0 .0 1)。光镜和电镜观察 :1组未见有内皮细胞生长 ;2组可见有散在的内皮细胞生长 ;3组内皮细胞局部生长并可见细胞脱落 ;4组内皮细胞生长于原瓣叶的无细胞纤维支架上 ,并呈单层紧密排列 ,少见有细胞脱落或丢失 ,细胞沿纤维嵌合排列 ,细胞下组织呈间隙稀疏构成 ,有少量的基质成分和散在的胶原纤维 ,细胞沿纤维间隙排列、嵌合生长 ,形成空间三维排列生长的内皮     

人骨髓间质干细胞的优化培养

目的探索人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的优化培养条件.方法应用不同条件,研究原代培养方法、接种密度、首次换液时间、培养基、血清浓度及种类对细胞生长的影响,并以选定的条件培养、扩增MSCs,扩增后向成骨细胞和软骨细胞诱导.结果在其它条件不变的前提下,密度梯度分离法优于全骨髓法,2.5×105/cm2是人MSCs原代培养的适宜接种密度,原代第5天首次换液为最佳换液时间,DMEM培养基优于α-MEM培养基,血清C为适宜的血清,10%为适宜的血清浓度.所选条件培养的MSCs可在体外扩增15代以上,形态保持不变,并具有良好的分化潜能.结论建立了人MSCs的体外优化培养条件,为其在组织工程方面的应用作出了新的探索.     

成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性

目的探讨成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性. 方法取2周龄乳兔颅盖骨及肾脏皮质传代培养制备成骨细胞(A组)、血管内皮细胞(B组)及成骨细胞与血管内皮细胞联合培养(C组),用Ⅰ型胶原和血管Ⅷ因子免疫细胞化学染色鉴定成骨细胞和血管内皮细胞,倒置相差显微镜和组织学染色观察细胞的生长特性和细胞相容性,检测碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)活性,观察血管内皮细胞对成骨细胞产生的ALP活性有无影响,MTT法检测细胞活力,分析细胞生长和增殖情况. 结果免疫细胞化学染色证实,培养的细胞为成骨细胞和血管内皮细胞.倒置相差显微镜、HE和Masson染色均显示两种细胞混合生长良好.ALP检测结果:C组ALP活性明显高于A组和B组(P＜0.01),A组高于B组(P＜0.05).MTT检测结果表明:C组细胞早期增殖较慢,而后期增殖较快. 结论成骨细胞与血管内皮细胞具有良好的相容性,血管内皮细胞能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力.联合培养细胞具有很强的增殖潜能.     

兔骨膜成骨细胞与肾血管内皮细胞间接共培养的体外实验研究

目的　探讨兔骨膜成骨细胞 (RPOB)和肾血管内皮细胞 (RRVEC)不同比例下间接共培养对成骨细胞增殖及功能的影响 ,优选细胞间接共培养的适宜比例。方法　取 RPOB和 RRVEC,采用细胞嵌盒培养系统 ,对照组、试验 1、2、3组分别以 RPOB和 RRVEC按 1∶ 0、2∶ 1、1∶ 1和 1∶ 2间接共培养 4天。通过细胞计数、碱性磷酸酶 (AL P)活性测定及 3H-脯氨酸掺入试验观察 RPOB和 RRVCE增殖分化能力及功能状态。结果　试验 1组 RPOB较对照组、试验2、3组增殖活跃 (P<0 .0 5 ) ,且 3H-脯氨酸掺入较高 (P<0 .0 5 ) ;试验 1组 AL P活性较对照组和试验 3组高 (P<0 .0 5 ) ,但与试验 2组无显著差异 (P>0 .0 5 )。结论　 RPOB和 RRVEC以 2∶ 1进行间接共培养时 RPOB增殖能力强、功能活跃 ,适宜进一步组织工程研究     

人类白细胞抗原G1转染猪内皮细胞降低异种细胞排斥反应的研究

目的研究转染人类白细胞抗原G1(humanleukocyteantigenG1,HLA-G1)基因后的猪内皮细胞系(porcineendothelialcells,PECs)细胞,对人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)和自然杀伤细胞92(naturekillercell92,NK-92)细胞介导的杀伤作用的改变。方法利用脂质体包裹的方法,将携带HLA-G1基因的真核表达载体pcDNA3.0转染PECs细胞,在蛋白质水平通过间接免疫荧光法、在RNA水平通过RT-PCR,检测HLA-G1的表达;取6名健康志愿者,每人5ml静脉血,分离出单个核细胞和NK-92作为效应细胞,利用51Cr释放试验来检测其杀伤作用的改变。结果转染HLA-G1基因后,在转染的内皮细胞中蛋白质水平和RNA水平均检测到HLA-G1基因的表达;PBMC和NK-92细胞介导的对PECs细胞的杀伤作用均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论转染HLA-G1后的PECs,可有效地降低由人NK细胞介导的杀伤作用,从而为抑制异种细胞排斥反应提供了新的思路。     

人体肌卫星细胞培养的实验研究

目的 了解人体肌卫星细胞在体外培养条件下的生物学特性。方法 标本取自创伤病例的四肢骨骼肌,消化、提纯后,在生长培养液内培养10天,细胞生长至汇合后分化培养5天。倒置显微镜观察,绘制细胞生长曲线,计算细胞融合率,结蛋白免疫细胞化学方法（ABC）法鉴定肌卫星细胞。结果 细胞消化、提纯后纯度为90％。在生长培养液内肌卫星细胞分裂增生;在分化培养条件下,汇合状态的肌卫星细胞发生融合,形成肌管,分化培养24小时细胞融合率开始明显增加,分化72小时融合率达到高峰。结论 人体肌卫星细胞在适当的培养条件下可以增生、分化,形成肌纤维。结蛋白免疫细胞化学染色是早期鉴定肌卫星细胞的有效方法。     

成人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的研究

目的研究成人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）体外分化为血管内皮细胞的能力并探讨其诱导条件。方法分离成人骨髓单个核细胞，经贴壁法获取MSCs。所获细胞分4组进行诱导：组1、2以5×10^3／cm^2细胞密度接分别接种于含2％和15％胎牛血清的L—DMEM培养基；组3、4以5×10^4／cm^2细胞密度分别接种于上述两种血清浓度的培养基，各组细胞经血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）辅以牛脑提取物的诱导，对照组为正常传代培养的MSCs。在诱导的第14、21天分别测定表面分子CD34、VEGFR-2、CD31和Ⅶ因子相关抗原（factor Ⅷ—related antigen，又称von Willebrand factor，vWF）以及体外成血管实验对分化细胞进行鉴定，同时测定不同诱导条件下的细胞增殖指数（proliferation index，PI）。结果组3细胞经诱导后，内皮系表面分子CD34、VEGFR-2、CD31、vWF于第14天均有不同程度表达，分别为8．5％、12．0％、40．0％、30．0％．其中CD34、VEGFR-2在第21天表达上调，为15．5％、20．0％，余各诱导组细胞未表达上述表面分子；诱导后的组3细胞呈低增殖状态（PI值约为10．4％），在半固体培养基中还可形成血管腔样结构。结论从成人骨髓中分离培养的MSCs，在较高细胞接种密度和低增殖状态下，经VEGF、牛脑垂体提取物诱导后，可分化为血管内皮细胞，可作为治疗性血管生成及组织工程理想的种子细胞。     

单酶消化复合植块法培养雪旺细胞的实验研究

目的探讨一种快速获取高纯度、高活性雪旺细胞的分离、培养方法,并从转录及翻译水平对获取细胞进行鉴定。方法取4周龄SD大鼠双侧坐骨神经,胶原酶Ⅰ消化15 min后接种于培养瓶中,进行体外培养并按1∶2比例传代,倒置相差显微镜观察细胞生长状态及形态变化,MTT法检测细胞增殖情况并绘制生长曲线,RT-PCR检测S100及胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)基因表达情况,并行免疫组织化学染色观察S100及GFAP蛋白表达水平,计算细胞纯度。结果胶原酶Ⅰ消化后组织块培养24 h即可见成纤维样细胞迁出,胞体细长,折光性较弱;48 h后可见大量细胞迁出,细胞多呈双极或三极,突起细长,胞体饱满,折光性强,72 h形成细胞集落。细胞传代后48～72 h即可长满瓶底,并出现螺旋形细胞集落,多次传代后细胞仍生长旺盛,细胞质饱满。MTT结果显示,第3代细胞第3天即进入对数生长期,随时间延长逐渐增殖,第7天进入平台期,生长曲线呈"S"形。RT-PCR结果示培养细胞表达S100、GFAP基因;免疫组织化学染色检测显示大部分细胞呈阳性染色,表达S100及GFAP蛋白,雪旺细胞纯度为98.37%±0.30%。结论单酶消化复合植块法可以快速获得高纯度、高活性的大鼠雪旺细胞。     

利用Geneticin纯化雪旺细胞的实验研究

目的：了解Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ在雪旺细胞培养过程中去除成纤维细胞的作用。方法：组织块法培养雪旺细胞，４～３天后应用含有１００μｇ／ｍｌ浓度的Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ培养液培养４～５天，再改用普通培养液进行培养，并进行细胞传代，利用Ｓ－１００蛋白和ＧＦＡＰ（胶质纤维酸性蛋白）进行免疫组化染色，鉴定培养的雪旺细胞。结果：应用含有Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ的培养液培养雪旺细胞４～５天后成纤维细胞基本消失，雪旺细胞仍生长良好，并可传代培养。经Ｓ－１００蛋白和ＧＦＡＰ免疫组化染色鉴定培养的细胞基本为染色阳性的雪旺细胞。结论：应用含Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ的培养液培养雪旺细胞能够有效地去除成纤维细胞，获得纯度高、活力良好的雪旺细胞。