骨髓基质干细胞诱导成雪旺细胞的可行性及促轴突生长的体外功能实验

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)向雪旺细胞(SCs)分化的可行性,以及分化成类SCs的表型、分子及功能特征.方法 原代培养F344乳鼠BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面特异标记CD29、CD44、CD45的表达;诱导干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化,评价干细胞的生物学特性;采用碱性成纤维细胞生长因子和forskolin等诱导BMSCs向SCs分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定SCs特异性标记物S100和p75的表达;RT-PCR分析诱导前、后SCs相关基因的表达;培养大鼠背根神经节神经元,分别与诱导前后的BMSCs共培养,评价其促轴突生长的功能特性.结果 分离培养的鼠BMSCs CD29、CD44表达呈阳性,CD45表达呈阴性:干细胞诱导的成骨细胞茜素红染色阳性,脂肪细胞油红O染色阳性;BMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与SCs相似;免疫荧光染色S100和p75阳性;RT-PCR结果S100、CD104均表达增强;与背根神经节神经元共培养,诱导后的BMSCs促进轴突生长的距离为(285.3±36.7)μm,与未诱导组BMSCs的[(113.5±11.5)μm]相比,差异有统计学意义(t=8.966,P=0.001).结论 BMSCs可诱导分化成SCs,其表型、分子及功能特征与SCs相似,诱导分化的BMSCs是一种理想的神经组织工程的种子细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养对白介素1β致髓核细胞退变的影响

目的 :观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)与髓核细胞(NPCs)共培养对白介素1β(IL-1β)致NPCs退变的影响。方法:在体外分别分离培养大鼠NPCs和BMSCs,分别传至第3代,采用流式细胞仪鉴定BMSCs纯度,分别测定CD29、CD31、CD45、CD90表型。取第3代NPCs分为3组:A组,无IL-1β干预,不与BMSCs共培养,设为对照组;B组,用IL-1β干预NPCs后不与BMSCs共培养;C组,用IL-1β干预NPCs后与BMSCs细胞借由transwell小室间接共培养。IL-1β干预时间和BMSCs共培养时间均为24h,之后取出transwell,将3组NPCs通过实时定量荧光PCR(RT-PCR)观察其解聚蛋白样金属蛋白-4(ADAMTS-4)、解聚蛋白样金属蛋白酶-5(ADAMTS-5)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)基因表达量,同时通过Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)凋亡试剂盒和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)试剂盒观察3组NPCs凋亡情况。结果 :流式细胞鉴定结果显示90%以上的BMSCs表现为CD29、CD90阳性,小于5%的BMSCs表现为CD31、CD45阳性,细胞纯度较好。3组NPCs中ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-13的基因相对表达量:A组为0.98±0.19、1.10±0.08、1.21±0.24,B组为5.23±0.25、6.92±2.33、23.39±0.09,C组为2.31±0.26、3.33±1.52、12.68±0.11,与A组比较,B、C组均明显升高(P0.05),C组与B组比较均明显降低(P0.05)。Caspase-3活性相对表达量A组为1.20±0.18,B组为5.92±0.93,C组为2.33±0.52,与A组比较,B、C组明显升高(P0.05),C组与B组比较明显降低(P0.05)。细胞凋亡率A组为4.2±2.2,B组为17.1±3.7,C组为10.5±2.4,与A组比较,B、C组明显升高(P0.05),C组与B组比较明显降低(P0.05)。结论:与BMSCs共培养可有效降低IL-1β致NPCs退变相关因子的基因表达,减少细胞凋亡;BMSCs可作为种子细胞对椎间盘炎性环境起到"治疗"作用。     

大鼠雪旺细胞对脊髓源性神经干细胞生长及分化的影响

目的 观察雪旺细胞(SCs)在体外对脊髓来源的神经干细胞(NSCs)生长及分化的影响.方法 分别从胎鼠脊髓和出生24 h内的SD大鼠坐骨神经分离培养NSCs及SCs并鉴定.实验分成对照组:NSCs单独培养组;A组:脑源性神经营养因子(黼)与NSCs共培养组;B组:SCs与NSCs共培养组;C组:BDNF+SCs与NSC共培养组.观察NSCs的形态学变化,计数并测量细胞团的数量及直径.利用免疫细胞化学方法检测神经元样细胞的表达并计算其百分率及阳性细胞突起的平均长度.结果 来源于新生大鼠脊髓组织的NSCs能够表达NSCs的标志物神经巢蛋白(Nestin),NSCs可分化为神经元及星形胶质细胞;72 h,A、B、C组细胞团的数量及细胞团的平均直径,均大于对照组(P＜0.05);传代培养3 d、7 d、14 d的NAP-2染色阳性神经元样细胞所占的百分率及阳性细胞突起平均长度均大于对照组(P＜0.05).结论 大鼠SCs在体外能够促进脊髓来源的NSCs生长并诱导其定向分化.     

骨髓基质干细胞治疗脊髓损伤的体外诱导分化及相关蛋白表达

目的 探讨模拟脊髓细胞环境下骨髓基质干细胞(BMSCs)的分化及蛋白差异表达.方法 分离培养Wistar大鼠骨髓的BMSCs和脊髓的神经细胞,设立BMSCs自然分化组、与神经细胞共培养组和双层培养组,8 d后对各组BMSCs进行神经特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光检测.应用表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)筛选双层培养组BMSCs变化明显的蛋白进行分析.结果 BMSCs与神经细胞共培养和双层培养8 d后,BMSCs呈神经细胞形态.NSE和GFAP检测结果 ,BMSCs与神经细胞共培养组明显高于BMSCs与神经细胞双层培养组(P＜0.05),而BMSCs和神经细胞双层培养组又明显高于BMSCs自然分化组(P＜0.05).SELDI-TOF-MS检测到TIP39_RAT和CALC-RAT增加到原来的5.360和2.807倍,INSL6-RAT、PNOC_RAT和PCSK1_RAT减少到原来的38.0%、49.9%和43.8%.结论 在脊髓神经细胞微环境下体外培养BMSCs能诱导其分化成神经细胞,而且接触培养分化率高;BMSCs在向神经细胞分化机制中与TIP39_RAT、CALC_RAT、INSL6_RAT、PNOC_RAT和PCSK1_RAT密切相关.     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

许旺细胞诱导下脂肪来源干细胞向神经细胞方向分化的研究

目的 探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)和SD大鼠许旺细胞(Schwann cells)利用Transwell非接触式共培养时生长增殖特性和向神经元样细胞分化的规律.方法 取1月龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,按酶原消化法获取脂肪来源干细胞,同时取大鼠坐骨神经按改良植块法获取许旺细胞.取P3代脂肪来源干细胞分三组:A组使用ADSCs和许旺细胞构建Transwell非接触式共培养体系,B组利用β-巯基乙醇(BME)、丁酸酯羟基茴香醚(BHA)作为脂肪来源干细胞诱导因子使其向神经方向诱导,C组脂肪干细胞为对照组.比较各组细胞形态,观察脂肪来源干细胞代谢、轴突生长、免疫荧光染色情况,并做统计学分析.结果 A组脂肪来源干细胞部分分化为具有细长突起的细胞,B组诱导培养后,大多数存活的细胞也同样转变为类似于神经元的形态,A组突起长度(11.64±1.64)μm,B组突起长度 (13.03±1.35)μm,差异有统计学意义(P>0.05),细胞生长代谢旺盛.A组B组诱导分化后的细胞NF表达阳性率分别为(54.16±9.35)%和(62.25±8.95)%,两者差异无统计学意义,而GFAP染色阴性.在细胞数量上,A组为(4.08±0.68)×107/L,C组(4.20±0.79)×107/L,差异无统计学意义(P>0.05),但明显高于B组(3.23±0.37)×107/L(P<0.05).结论 许旺细胞能促进脂肪来源干细胞向神经方向分化,效果与使用β-BME加BHA试剂诱导的结果相近,并能有效防止脂肪来源干细胞损伤.     

化学去细胞异体神经添加不同组织来源雪旺细胞对周围神经损伤修复的功能评价

目的构建不同组织来源雪旺细胞(Schwann cells,SCs)及化学去细胞异体神经(chemically extracted acellular nerve allograft,CEANA)移植物,比较其修复周围神经缺损的效果。方法 4周龄SD大鼠3只,体重80～120g,体外培养、扩增和鉴定BMSCs及脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)。体外诱导BMSCs和ADSCs分化为类雪旺细胞(dMSC,dADSC),并采用胶质细胞标记物p75和抗胶原纤维酸性蛋白(glial fi brillary acidic protein,GFAP)进行鉴定。取出生3d SD大鼠10只,体重6～8g,分离培养SCs。20只成年Wistar大鼠,体重200～250g,取双侧约20mm坐骨神经制备CEANA。40只成年雄性SD大鼠,制备左侧15mm坐骨神经缺损模型,根据神经缺损修复方法不同随机分为5组(n=8):A组,取自体坐骨神经翻转后吻合;B组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个SCs;C组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dMSC;D组,取15mm CEANA吻合后补充5×105个dADSC;E组,取15mm CEANA吻合。术后12周行感觉和运动功能恢复评价及组织学评价。结果 BMSCs和ADSCs表面抗原标志为CD34-、CD45-、CD90+。经诱导后BMSCs和ADSCs形态变化与SCs相似,呈双极、星形结构,SCs标记物p75和GFAP均表达阳性。术后12周,A、B、C、D、E组肢体50%回缩阈值分别为(13.8±2.3)、(15.4±6.5)、(16.9±5.3)、(16.3±3.5)和(20.0±5.3)g,A组与E组比较差异有统计学意义(P0.01),B、C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。A、B、C、D、E组小腿三头肌收缩力恢复率分别为87.0%±9.7%、70.0%±6.6%、69.0%±6.7%、65.0%±9.8%和45.0%±12.1%,A、B、C、D组与E组比较差异有统计学意义(P0.05)。各组远端吻合口神经坚牢蓝染色显示神经纤维排列整齐,无炎性反应。甲苯胺蓝染色和透射电镜观察显示,B、C、D组有髓神经纤维计数及有髓神经纤维髓鞘厚度均大于E组,差异均有统计学意义(P0.01);B组轴突直径大于C、D组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 CEANA补充dADSC修复周围神经缺损与补充dMSC和SCs具有类似的修复效果。dADSC来源广泛,可作为组织工程神经理想的种子细胞,在复合CEANA修复周围神经缺损发挥重要作用。     

淤胆血清及肝细胞生长因子体外诱导BMSCs向肝细胞分化

目的探讨大鼠血清体外扩增BMSCs的可能性,及淤胆大鼠血清和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)体外诱导其分化为肝细胞,解决肝组织工程细胞来源短缺的可行性。方法取6周龄健康雌性Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓细胞,分离、纯化并传代培养BMSCs。取12～14周龄健康Wistar大鼠40只,随机分为两组(n=20),制备正常及淤胆大鼠血清。取第3代BMSCs按培养液不同分组:A组,DMEM加10%FBS;B组,肝细胞生长培养基(hepatocyte growth medium,HGM)加5%FBS;C组,HGM加5%正常大鼠血清;D组,HGM加5%淤胆大鼠血清;E组,HGM加5%淤胆大鼠血清、25μg/LHGF。观察各组诱导培养过程中的细胞形态变化,MTT法测定细胞生长曲线,免疫细胞化学法检测甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)表达,高碘酸-希夫染色检测糖原表达,脲酶-谷氨酰脱氢酶法检测上清液尿素含量。结果诱导培养过程中D、E组出现多角形及双核细胞,A、B、C组细胞形态无明显变化。MTT生长曲线显示C组细胞生长速度最快,B组最慢,与A、D、E组比较差异均有统计学意义(P0.05),A、D、E组间比较差异无统计学意义(P0.05)。D、E组于诱导培养7d开始出现AFP及CK18阳性表达,14d开始出现糖原阳性表达,同时间点E组阳性表达率高于D组(P0.05);D、E组上清液中尿素含量随诱导时间延长逐渐升高,同时间点E组高于D组(P0.05)。各时间点A、B、C组均未见AFP、CK18、糖原阳性表达,尿素浓度无明显变化。结论正常大鼠血清能明显促进BMSCs增殖;淤胆大鼠血清对BMSCs有一定促增殖作用,且能有效诱导其向肝细胞分化;联合使用淤胆血清和HGF能提高细胞分化率。     

不同浓度神经生长因子诱导BMSCs的实验研究

目的 研究不同浓度神经生长因子体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的调节作用.方法 贴壁培养BMSCs,流式细胞检测表面标志物.A组加入3种浓度EGF和bFGF;B组加同样浓度bFGF;C组不加诱导剂.A、B组用脑源性神经营养因子(BDNF)和全反式维甲酸(ATRA)诱导,免疫荧光及免疫组化鉴定.结果 第3代BMSCs为梭形样细胞,CD29、CD44、CD90为阳性,CD34、CD45为阴性.A组中100μg/L巢蛋白(NESTIN)(81.9±1.8)%.A组与B组比较,差异有统计学意义(P<0.05).继续诱导,可见微管相关蛋白2(MAP2)、神经丝(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞.结论 采用改良的全骨髓贴壁法,细胞活性好.bFGF和EGF同时应用比bFGF单独应用效果好.100μg//L(bFGF+EGF)预诱导m神经干细胞数量多,并分化为神经元样细胞.     

静脉移植骨髓间充质干细胞在大鼠损伤脊髓中的存活与分化

目的:探讨脊髓损伤后静脉移植骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)治疗脊髓损伤的可行性。方法:体外分离、培养、扩增、纯化、BrdU(5-溴尿嘧啶)标记10只同种异体SD大鼠的BMSCs;WD法制成同种SD大鼠完全性截瘫的脊髓损伤动物模型,制模后7d随机分为A、B、C三组,A组22只,为应用BM-SCs移植组,B组22只,作为对照组,C组16只,作为空白对照组。A组经鼠尾静脉注射BMSCs悬液(2×106个/ml)1ml,B组经鼠尾静脉注射1mlL-DMEM液,C组作为空白对照组。注射后2、3、6周用免疫组织化学检测BMSCs在损伤段脊髓的存活、分布、分化情况并作计数观察。结果:A组移植后2、3、6周BrdU阳性的BMSCs主要分布于损伤段及邻近节段脊髓内;移植后2周BrdU阳性的BMSCs约占移植细胞数的4.9%,移植后3周占4.4%,移植后6周占2.9%。移植后2周,BMSCs形态大多变为圆形或椭圆形,部分阳性标记的细胞长出神经元样突起,约12.6%表达星形胶质细胞特异性蛋白GFAP,约5.4%表达神经元特异性核蛋白(NeuN)。B、C组损伤段脊髓内未见有BrdU阳性细胞。结论:脊髓损伤后静脉移植的BMSCs能在脊髓损伤灶内停留、存活,表现出对损伤灶的趋化性,部分存活的BMSCs可向神经元和星形胶质细胞分化,可用于脊髓损伤的细胞移植治疗。     

大鼠雪旺细胞对两种来源的成骨细胞增殖分化影响的研究

目的 研究应用雪旺细胞(SCs)对两种来源的成骨细胞(OB)的增殖与分化的影响,为构建神经化组织工程骨提供体外实验理论依据.方法 通过采用股骨、胫骨髓腔冲洗法获得SD大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),采用胰蛋白酶消化新生鼠颅骨获得OB及采用消化后组织块法获得SCs.将BMSCs在成骨诱导液作用3周,鉴定BMSCs向OB分化.采用96孔共培养板将第2代SCs种植于上室,颅骨来源OB种植下室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组.将诱导分化的OB种植于下室,第2代SCs种植于上室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组,分别于共培养后1、3、5、7、9d采用甲基噻唑基四唑(MTT)进行增殖比较.采用6孔共培养板,实验组上室种植SCs,下室分别种植颅骨来源及BMSCs来源的OB,不加SCs的两种来源的OB作为对照组,分别共培养后于3、7 d检测两种来源OB的碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2 mRNA表达.结果 SCs对颅骨来源的OB在共培养3、5、7、9 d 4个时间点均有明显促增殖作用,在碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2mRNA在各个时间段均起到抑制作用.SCs对大鼠BMSCs来源的OB在共培养1、3 d无明显促增殖作用,在5、7、9 d有明显促增殖作用,在成骨培养基的环境里,SCs可促进BMSCs诱导的OB分化.结论 选择BMSCs来源的OB 与 SCs共培养更适合用于构建神经化组织工程骨.     

辛伐他汀对幼鼠骨小梁中骨形成相关因子表达以及BMSCs成骨分化的影响

目的既往研究表明辛伐他汀具有促成骨作用,现探讨辛伐他汀对幼鼠骨小梁中骨形成相关因子表达以及BMSCs成骨分化的影响。方法 40只1周龄雄性SD大鼠,体重17.5～19.5 g,随机分为2组,每组20只。实验组于大鼠颈部皮下注射辛伐他汀注射液[5 mg/(kg.d)],对照组同法注射等剂量生理盐水。于注射后1、3周,两组分别脱颈处死10只大鼠,采用免疫组织化学染色检测胫骨上端骨小梁BMP-2、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、VEGF的表达情况。注射后1、3周,两组分别取大鼠双侧股骨,采用全骨髓培养法体外分离培养BMSCs,取第1代BMSCs成骨诱导培养,培养后14 d行ALP染色,培养后21 d采用实时荧光定量PCR检测BMP-2、Runx2、Osterix、Msx2、Dlx3、Dlx5 mRNA的表达,培养后28 d行von Kossa染色。结果免疫组织化学染色示注射后1、3周两组胫骨上端骨小梁BMP-2、MMP-13、VEGF表达,差异均无统计学意义(P>0.05)。成骨诱导培养14 d,注射后1、3周两组ALP染色阳性细胞百分比差异均无统计学意义(P>0.05);成骨诱导培养21 d,实时荧光定量PCR检测示注射后1、3周两组BMP-2、Runx2、Osterix、Dlx3、Dlx5、Msx2 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义(P>0.05);成骨诱导培养28 d,注射后1、3周两组钙结节单位面积比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论皮下注射辛伐他汀5 mg/(kg.d)后1、3周对幼鼠骨小梁中骨形成相关因子表达以及BMSCs成骨分化无明显影响。     

骨髓基质干细胞作软骨组织工程种子细胞研究

目的　综述近年来骨髓基质干细胞体外培养、定向分化为软骨细胞的条件及相关研究进展。方法　广泛查阅相关文献 ,对上述研究进展进行整理、综合和分析。结果　骨髓基质干细胞易于分离培养 ,体外增殖能力强 ,传代多次后仍保持有多分化潜能 ;体内成软骨能力明确 ;但骨髓基质干细胞定向分化的软骨细胞 ,不是终末分化阶段 ,而只是一个中间阶段。结论　骨髓基质干细胞以其自身多方面的特点已成为软骨组织工程的另一种可选择的种子细胞 ,但其进一步分化为成熟软骨细胞的条件尚需进一步研究。     

不同部位取材的雪旺细胞培养与纯化研究

目的探讨不同部位取材分离纯化雪旺细胞(Schwann cells,SCs)的纯度、活性以及数量差异,为神经缺损修复提供优质、足量种子细胞奠定理论基础。方法 6只5日龄SD大鼠,雌雄不限,体重8～10 g;切取背根神经节(实验组)和坐骨神经(对照组)。采用联合酶消化加机械吹打法分离培养SCs,并进行纯化及传代培养。取第1代SCs,用计数法绘制8 d内SCs生长曲线,MTT法检测8 d内SCs增殖情况,抗S-100免疫细胞化学检测SCs纯度,ELISA法检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)浓度。结果每只大鼠可切取背根神经节36～43个。消化成单个细胞后计数,实验组可获取(7.5±0.6)×106个SCs,对照组可获取(3.5±0.4)×106个SCs,差异有统计学意义(t=13.175,P=0.000)。两组SCs第3天开始进入对数增长期,随培养时间延长,细胞数及细胞增殖吸光度(A)值均呈上升趋势;且培养3、4、5、6 d时,实验组细胞数及A值明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。经S-100免疫细胞化学检测,实验组SCs纯度为92.08%±3.45%,对照组为77.50%±3.57%,差异有统计学意义(t=6.869,P=0.001)。ELISA法检测示实验组培养3 d和5 d时BDNF浓度均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论与坐骨神经相比,取材于背根神经节能获得数量更多、纯度和活性更高的SCs,为神经损伤修复创造了必要条件。     

脂肪组织来源干细胞的分化潜能和应用

目的介绍脂肪组织来源的干细胞种类、分化潜能及在再生医学中的应用和优势。方法广泛查阅近年关于BMSCs、脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)和去分化脂肪(dedifferentiated fat,DFAT)细胞的实验研究及临床研究文献,并进行整理、综合与分析。结果从脂肪基质成分可以分离得到ADSCs,ADSCs具有多向分化潜能,可分化为脂肪、骨、软骨、内皮、肌以及神经细胞等,并已较成功地应用于再生医学各领域。成熟脂肪细胞经过天花板培养法可以去分化为成纤维样细胞,即DFAT细胞,获得了多向分化潜能,也可以像ADSCs一样分化为脂肪、骨、软骨、内皮、肌以及神经细胞等。相比较目前常用的成体干细胞BMSCs,ADSCs、DFAT细胞来源广泛、取材更容易;而相对于ADSCs,DFAT细胞均一性高,增殖能力强。结论脂肪组织作为人体干细胞的重要来源,可能会给临床组织缺损的修复与再生带来新希望。     

大鼠雪旺细胞对两种来源的成骨细胞增殖分化影响的研究

目的 研究应用雪旺细胞(SCs)对两种来源的成骨细胞(OB)的增殖与分化的影响,为构建神经化组织工程骨提供体外实验理论依据.方法 通过采用股骨、胫骨髓腔冲洗法获得SD大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),采用胰蛋白酶消化新生鼠颅骨获得OB及采用消化后组织块法获得SCs.将BMSCs在成骨诱导液作用3周,鉴定BMSCs向OB分化.采用96孔共培养板将第2代SCs种植于上室,颅骨来源OB种植下室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组.将诱导分化的OB种植于下室,第2代SCs种植于上室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组,分别于共培养后1、3、5、7、9d采用甲基噻唑基四唑(MTT)进行增殖比较.采用6孔共培养板,实验组上室种植SCs,下室分别种植颅骨来源及BMSCs来源的OB,不加SCs的两种来源的OB作为对照组,分别共培养后于3、7 d检测两种来源OB的碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2 mRNA表达.结果 SCs对颅骨来源的OB在共培养3、5、7、9 d 4个时间点均有明显促增殖作用,在碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2mRNA在各个时间段均起到抑制作用.SCs对大鼠BMSCs来源的OB在共培养1、3 d无明显促增殖作用,在5、7、9 d有明显促增殖作用,在成骨培养基的环境里,SCs可促进BMSCs诱导的OB分化.结论 选择BMSCs来源的OB 与 SCs共培养更适合用于构建神经化组织工程骨.     

大鼠雪旺细胞对两种来源的成骨细胞增殖分化影响的研究

目的 研究应用雪旺细胞(SCs)对两种来源的成骨细胞(OB)的增殖与分化的影响,为构建神经化组织工程骨提供体外实验理论依据.方法 通过采用股骨、胫骨髓腔冲洗法获得SD大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),采用胰蛋白酶消化新生鼠颅骨获得OB及采用消化后组织块法获得SCs.将BMSCs在成骨诱导液作用3周,鉴定BMSCs向OB分化.采用96孔共培养板将第2代SCs种植于上室,颅骨来源OB种植下室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组.将诱导分化的OB种植于下室,第2代SCs种植于上室,共培养为实验组,无SCs干预共培养为对照组,分别于共培养后1、3、5、7、9d采用甲基噻唑基四唑(MTT)进行增殖比较.采用6孔共培养板,实验组上室种植SCs,下室分别种植颅骨来源及BMSCs来源的OB,不加SCs的两种来源的OB作为对照组,分别共培养后于3、7 d检测两种来源OB的碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2 mRNA表达.结果 SCs对颅骨来源的OB在共培养3、5、7、9 d 4个时间点均有明显促增殖作用,在碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨形态发生蛋白-2mRNA在各个时间段均起到抑制作用.SCs对大鼠BMSCs来源的OB在共培养1、3 d无明显促增殖作用,在5、7、9 d有明显促增殖作用,在成骨培养基的环境里,SCs可促进BMSCs诱导的OB分化.结论 选择BMSCs来源的OB 与 SCs共培养更适合用于构建神经化组织工程骨.     

生长分化因子7体外促进BMSCs向肌腱细胞分化的研究

目的探讨生长分化因子7(growth differentiation factor7,GDF-7)在体外能否促进BMSCs向肌腱细胞分化,为改善BMSCs修复肌腱疗效提供依据。方法采用密度梯度离心法从绿荧光大鼠骨髓组织中分离培养BMSCs,通过成骨、成脂和成软骨分化鉴定其多向分化能力。取第3代BMSCs根据成肌腱培养液中加入不同浓度GDF-7(0、12.5、25.0、50.0ng/mL),分为A、B、C、D组。体外诱导培养2周后,实时荧光定量PCR检测各组scleraxis、tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原mRNA表达,免疫细胞化学染色观察tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原蛋白表达,Western blot法检测A、C组tenomodulin蛋白的表达。结果经鉴定,分离培养的BMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化的多向分化能力。实时荧光定量PCR检测结果示,B、C、D组的tenomodulin mRNA表达分别较A组增加了2.85、3.41、3.07倍(P<0.05),scleraxis mRNA表达增加了2.13、1.50、2.56倍(P<0.05),tenascin C mRNA表达增加了2.45、2.86、1.88倍(P<0.05),但B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。B、C组Ⅰ型胶原mRNA表达较A组分别增高了1.92和2.45倍(P<0.05);D组较A组有所增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。免疫细胞化学染色示,B、C、D组均有tenomodulin、tenascin C和Ⅰ型胶原蛋白表达,而A组均未表达;除C组Ⅰ型胶原表达高于B、D组外,其他蛋白表达B、C、D组间无明显差异。Western blot检测示C组比A组有更高的tenomodulin蛋白表达。结论 GDF-7在体外能促进大鼠BMSCs向肌腱细胞分化。