表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用研究

目的探讨表皮葡萄球菌生物膜形成相关基因——胞间黏附素A(intercellular adhesion A,ica A)基因、纤维蛋白原结合蛋白(fibrinogen binding protein,fbe)基因、聚集相关蛋白(accumulation-associated protein,aap)基因在表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生物膜形成中的作用。方法实验分为3组,用表皮葡萄球菌标准株ATCC35984(表葡组)及白假丝酵母菌标准株ATCC10231(白念组)分别培养及混合培养(混合组),建立表皮葡萄球菌、白假丝酵母菌及二者混合生长的体外生物膜模型。于培养2、4、6、8、12、24、48、72 h,采用结晶紫染色法半定量检测生物膜形成能力,二甲氧唑黄[(2,3 bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)5〔(phenylamino)Carbonyl〕2H-tetrazolium hydroxide assay,XTT]比色法评价生物膜体外生长动力学;24、72 h扫描电镜观察生物膜超微结构。荧光定量PCR分析培养72 h表葡组及混合组ica A、fbe、aap基因表达情况。结果结晶紫染色法生物膜半定量检测示,混合组和表葡组均在培养12 h生物膜明显增厚,72 h混合组超过表葡组,组间比较除72 h外,其余各时间点两组比较差异均有统计学意义(P0.05);白念组12 h出现生物膜的生长,在整个培养周期白念组生物膜厚度均低于混合组(P0.05)。XTT比色法生长动力学检测示,混合组整体生长速度快于白念组,且48 h后超过表葡组;混合组与表葡组除12 h差异有统计学意义(P0.05)外,其余各时间点比较差异均无统计学意义(P0.05);混合组培养2、4 h时A值低于白念组,但比较差异无统计学意义(P0.05);6 h后各时间点A值均显著高于白念组(P0.05)。扫描电镜观察示,随培养时间延长各组均形成结构复杂、成熟的生物膜。培养72 h荧光定量PCR检测示,与表葡组相比,混合组fbe、ica A、aap基因表达量分别增高1.93、1.52、1.46倍,差异均有统计学意义(P0.05)。结论表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌混合生长能形成比单一微生物结构更复杂的混合生物膜;混合生物膜较单一微生物生物膜更厚,可能与表皮葡萄球菌ica A、aap、fbe基因表达增加有关。     

溴代呋喃酮对胸心外科聚氯乙烯材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响

目的探讨溴代呋喃酮对胸心外科聚氯乙烯(PVC)材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响,为生物材料表面改性研究及临床生物材料植入感染的防治提供新思路。方法选用化学结构具有代表性的三种溴代呋喃酮分为3组,呋喃酮1组:3,4-二溴基-5-羟基-呋喃酮;呋喃酮2组:4-溴-5-(4-甲氧基苯基)-3-(甲氨基)-呋喃酮;呋喃酮3组:3,4-二溴基-5,5-二甲苯基-2(5H)-呋喃酮;对照组:PVC材料用酒精浸泡5min;分别对4组PVC材料进行表面涂层改性,将改性过的PVC材料与表皮葡萄球菌共同培育;分别于培养6h、12h、18h和24h时用激光共聚焦显微镜动态观察PVC材料表面细菌群落及细菌生物膜厚度的形成,扫描电子显微镜观察PVC材料表面细菌生物膜表面结构。结果激光共聚焦显微镜观测结果显示:呋喃酮2组各时间点PVC材料表面表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度明显小于对照组(P0.05),呋喃酮1组、呋喃酮3组表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。扫描电子显微镜观察显示:与对照组比较,呋喃酮2组6h时PVC材料表面细菌群落附着数量较少;18h时对照组PVC材料表面细菌生物膜结构初步形成,而呋喃酮2组无明显细菌生物膜结构形成。结论不同溴代呋喃酮对PVC材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响不同,呋喃酮2可以抑制PVC材料表面表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度的形成。     

人血清白蛋白在体外心血管生物材料细菌黏附中的作用

目的观察人血清白蛋白(HSA)对涤纶(Dacron)和膨体聚四氟乙烯(PTFE)细菌黏附的影响,探讨其在心血管生物材料细菌黏附中的作用,为临床防治心血管生物材料植入后感染提供有效的方法. 方法根据生物材料处理的方式不同分为两组,实验组用HSA预处理涤纶和PTFE;对照组用生理盐水预处理.使用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)标记的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌,对两组的涤纶和PTFE进行动态细菌黏附实验,使用β-液闪测量仪(β-LSC)、扫描电子显微镜(SEM)观察材料上细菌黏附情况. 结果实验组金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌对涤纶和PTFE的黏附均较对照组少(P＜0.05). 结论用HSA预处理心血管生物材料可抑制某些细菌的黏附.     

金属蛋白酶对涤纶材料表面金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响

目的观察不同浓度下金属蛋白酶(A ur)对金黄色葡萄球菌在涤纶材料表面细菌生物膜形成的影响。方法90片涤纶片按随机数字表法分成3组,每组30片。3组均将涤纶片放入有金黄色葡萄球菌液(105CFU/m l)的无菌瓶中,A组再加入含400ng/m l浓度的A ur,B组再加入含80ng/m l浓度的A ur。3组均置入电热恒温水浴箱(98.6°F)中培育,分别于培育后6h、16h、24h、30h和48h用扫描电子显微镜(SEM),激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察细菌生物膜的厚度和单位面积内细菌生物膜群落数量。结果对照组涤纶片细菌生物膜的厚度和群落数呈时间依赖性明显增加,A组涤纶片金黄色葡萄球菌生物膜的厚度和群落数在各时间点均明显低于B组和对照组(P<0.05),B组生物膜的厚度和群落数在各时间点亦明显低于对照组(P<0.05)。结论A ur对金黄色葡萄球菌在涤纶片上细菌生物膜的形成有抑制作用,其抑制作用的强度与A ur剂量呈正相关。     

表皮葡萄球菌生物膜蛋白在假体周围感染诊断中的应用

目的探讨表皮葡萄球菌生物膜蛋白作为抗原诊断假体周围感染的临床价值。方法制作表皮葡萄球菌感染的假体周围感染动物模型，并收集临床假体周围感染患者的血清。以从表皮葡萄球菌444生物膜中提取的蛋白为抗原，用ELISA方法检测感染动物和临床假体周围感染患者的血清中IgG水平。蛋白印迹杂交寻找特异性抗原蛋白。结果感染动物和感染患者血清中的IgG水平明显高于各自对照组，Western—blot结果显示，表皮葡萄球菌生物膜蛋白大小在15KD-37KD之间具有良好的抗原性。结论表皮葡萄球菌生物膜蛋白成份具有良好的抗原性，是引起机体免疫的重要成份。进一步纯化这些蛋白组分并作为诊断假体周围表皮葡萄球菌感染的抗原，具有重要的临床价值。     

表皮葡萄球菌附属基因调节子C特异结合多肽对聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成作用的体外研究

目的探讨表皮葡萄球菌附属基因调节子C(accessory gene regulator C,agr C)特异结合多肽(简称为N1)对聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成作用的体外研究。方法以表皮葡萄球菌ATCC35984(生物膜表型阳性)和ATCC12228(生物膜表型阴性)作为研究对象。首先将两菌株分别加入浓度为100、200、400、800、1 600μg/mL的N1培养,以相同浓度agrC特异结合无关肽(简称为N0)培养作为对照;24 h后测定吸光度(A)值,确定N1最佳抑菌浓度。两菌株与最佳抑菌浓度的N1及N0分别培养,6、12、18、24、30、48 h测定A值,观察N1对表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响;在此基础上与PVC材料片培养6、12、18、24、30 h,扫描电镜观察PVC材料表面生物膜的表面结构;另取与ATCC35984菌株培养6、12、18、24 h的PVC材料片,激光共聚焦显微镜观察生物膜厚度。结果 A值测定显示,N1对ATCC35984菌株最佳抑菌浓度为800μg/mL。ATCC12228菌株与N1及N0培养后均未形成明显生物膜;ATCC35984菌株与N1及N0培养12 h时,生物膜形成能力差异有统计学意义(P0.05),6、18、24、30、48 h时差异无统计学意义(P0.05)。扫描电镜观察,ATCC35984菌株与N1及N0培养后,随时间延长均见成熟生物膜结构;而ATCC12228菌株培养后均未见生物膜形成。激光共聚焦显微镜观察,ATCC35984菌株与N1培养12 h时细菌量明显少于与N0培养,且以死细菌居多;6、18、24 h时两种培养条件下细菌数量未见明显差别,均以活细菌居多;同时,N1培养12、18 h时生物膜厚度明显小于N0培养(P0.05)。结论 N1抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的强度有量效关系;其在聚集期阻碍细菌的增殖和聚集,抑制生物膜形成,对成熟生物膜抑制作用不明显。     

肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其在生物膜形成中的作用

目的：构建肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白基因（crp基因）缺失突变株与回补株,了解crp基因在肺炎克雷伯菌生物膜形成中的作用。方法设计位于crp基因（566 bp）上游698 bp片段及下游576 bp片段的两对引物,分别扩增出相应片段并通过融合PCR构建一个1274 bp片段的突变盒,利用双酶切克隆的方法将突变盒克隆至温度敏感性自杀载体pKO3-Km的NotⅠ位点间,电转化至肺炎克雷伯菌中构建肺炎克雷伯菌crp基因无痕缺失突变株（Δcrp）。扩增包含crp基因编码、启动子结合区及转录终止区的2063 bp基因片段并克隆至pGEM-T-easy质粒上,将此质粒电转至crp基因缺失突变株中构建crp基因回补株（C-crp）。采用RT-PCR方法检测crp基因在基因缺失株与回补株的表达情况,确定crp基因缺失突变株与回补株构建成功。利用结晶紫染色法检测crp基因对肺炎克雷伯菌生物膜形成的影响,并通过酵母凝集试验检测crp基因对肺炎克雷伯菌的菌毛形成影响。结果成功构建了肺炎克雷伯菌crp基因缺失突变株与回补株,RT-PCR结果显示,crp基因在缺失突变株中无表达,在回补株重新表达。体外试管静止培养48 h后,crp基因缺失株无明显生物膜形成,而在野生株及回补株的液体培养基表面形成宽厚生物膜。结晶紫染色定量发现,crp缺失突变株的生物膜相对形成量显著低于野生株（0.063±0.011 vs 1.020±0.056,P＜0.001）。酵母凝集试验发现在crp基因缺失突变株中细菌菌毛生成能力下降,提示crp基因影响肺炎克雷伯菌菌毛的生成。结论肺炎克雷伯菌crp基因可能通过调控肺炎克雷伯菌菌毛生成而正调控细菌生物膜的形成。