结核分枝杆菌早期分泌抗原ESAT-6的高效表达及其在结核分枝杆菌特异细胞免疫检测中的应用

目的 获得纯化的MTB早期分泌抗原ESAT-6,并对其抗原性及在MTB特异性细胞免疫检测中的应用价值进行评价.方法 采用基因工程技术表达MTB ESAT-6蛋白,通过Western blot法分析ESAT-6与特异性抗体的反应性.以纯化ESAT-6为抗原,用酶联免疫斑点技术(Elispot)检测肺结核患者、健康医务工作者、自然村居民外周血γ-干扰素的应答水平,同时与用于隐性结核感染及结核病诊断的QFT-G检测法进行平行比较,对其在MTB感染细胞免疫检测中的应用价值进行评价.结果 成功表达和纯化了 ESAT-6重组蛋白,所表达的蛋白能被特异性抗ESAT-6抗体识别,同时与肺结核外周血单核细胞反应,刺激后者产生γ-干扰素.Elispot技术检测肺结核患者、健康医务工作者、自然村居民的阳性率分别为36/49(73.5%)、11/62(17.7%)、17/194(8.8%),同时用QFT-G法对肺结核患者和健康医务工作者进行检测阳性率分别为38/49(77.6%)、14/58(24.1%),两种检测方法比较敏感度(73.5%,77.6%;χ2=0.381,P>0.05)和特异度(82.3%,75.9%;χ2=0.406,P>0.05),差异无统计学意义.结论 利用pET原核表达系统可成功地表达和纯化MTB ESAT-6重组蛋白,以ESAT-6为抗原建立的Elispot外周血IFN-γ检测技术与QFT-G的特异性和敏感性相当,可用于结核病的辅助诊断.     

三种结核分枝杆菌分泌抗原的血清学诊断价值

目的 研究3种结核分枝杆菌分泌抗原（相对分子质量分别为81000和38000的抗原、CF-10抗原）在结核病血清学诊断中的价值。方法 收集安徽省2002年3月至2005年4月结核病患者的血清标本149例，其中痰涂片阳性结核病患者108例，痰涂片阴性结核病患者41例；非结核性肺部疾病患者血清标本24例；健康对照170例。取指数生长中晚期结核分枝杆菌培养液，纯化38000天然抗原，以和6个组氨酸融合的形式表达，镍离子螫合的层析柱亲和纯化81000抗原和C-10抗原，通过酶联免疫吸附测定方法检测3种结核分枝杆菌分泌抗原的抗原性与特异性。结果 纯化的抗原具备较高的纯度（〉95％）和检测特异性（〉98％）。结核病患者的81000抗原、38000抗原和CF-10抗原阳性检出率分别为64．4％（96／149）、57．0％（85／149）和37.6％（56／149），阴性符合率均大于98％。3种抗原联合使用对结核病患者的阳性检出率达到81．2％（121／149），阴性符合率大于98％。结论 3种抗原均具有较好的特异性，3种抗原联合使用具有良好的敏感性与特异性，明显优于任何一种抗原单独使用的效果，将多个抗原联合使用是进行高质量的结核分枝杆菌血清学诊断切实可行的手段。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6-CFP10的融合表达及纯化

目的在原核表达系统融合表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6和培养滤液蛋白CFP10的融合蛋白(rE6C)并纯化,测定抗原性和特异性。方法用将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(﹢)中,构建pET32c(﹢)-linker。PCR法扩增ESAT-6、CFP10基因。将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(﹢)的linker前,CFP10克隆入linker后,构建E6C融合基因,转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠杆菌BL21中表达,纯化rE6C蛋白,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其抗原性和特异性。结果重组质粒pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物,纯化的表达产物具备较高的纯度、抗原性和特异性。结论pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达,rE6C融合蛋白具有良好的抗原性和特异性,有望用于结核分枝杆菌感染的临床诊断。     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒，获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）技术扩增目的基因片段；通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c，经序列测定证实正确，双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT，转化入大肠杆菌DH5α中，再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白；用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因，构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c，转化入大肠杆菌DH5α中，经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析，在80kD处出现新生蛋白带，凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23．7％。该融合蛋白以包涵体的形式存在，用Ni^2＋-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物，为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能，以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌14000抗原基因的克隆、表达纯化及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌14 000抗原基因进行克隆表达及纯化,并评价其抗原性。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;进SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原14 kD基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分枝杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:52.5%、96.7%和67.2%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论14 kD重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

结核分枝杆菌重组蛋白Rv0222的表达及血清学鉴定

目的 构建Mtb重组蛋白Rv0222的重组质粒,评价其用于结核病血清学诊断的价值。方法 通过PCR从Mtb染色体基因组中扩增出Rv0222基因片段,插入pMD18-T载体后,再亚克隆入表达载体pET30a中,诱导表达重组菌,组氨酸标签（His-tag）亲和层析纯化蛋白,通过免疫印迹法分析重组蛋白的免疫反应性,通过间接ELISA方法检测142例血清样本,来自82例结核病患者（痰涂片或痰培养阳性,抗结核治疗症状减轻者）,28例非结核病患者（8例肺癌、15例肺炎和5例肺气肿）和32例健康体检者,检测数据通过专业医学软件MedCalc 11.5.0分析ROC曲线下面积和最佳阳性判定值。 结果 成功构建重组载体,重组蛋白Rv0222经电泳后显示相对分子质量约为27 000,镍柱纯化后蛋白纯度达95%以上,通过蛋白免疫印迹法证实重组蛋白Rv0222与结核病患者血清能特异性结合。酶联免疫检测ROC曲线下面积为0.893,最佳阳性判定值为0.12时,结核病患者组抗体检测敏感度为69.5%（57/82）,非结核病患者和健康体检者抗体检测特异度为90.0%（54/60）,结核病患者与非结核病患者及健康体检者相比,差异有统计学意义（t=25.78,P＜0.0001）。结论 成功构建pET30a-Rv0222表达载体,获得高纯度的重组蛋白Rv0222,ELISA结果显示Rv0222蛋白有望成为结核病血清学诊断的有效抗原之一。     

人结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌差异蛋白质组学的研究

目的 探讨人MTB标准株H37Rv与牛分枝杆菌标准株卡介苗株的亚细胞蛋白质组学差异.方法 应用密度梯度离心法分离H37Rv和卡介苗株的细胞壁、细胞膜和细胞质蛋白,利用二维液相色谱分离技术进一步获得H37Rv和卡介苗株亚细胞蛋白质组,采用酶联免疫吸附试验分别检测H37Rv和卡介苗各组分与结核病患者和健康人各5例血清的免疫学反应.组间比较采用t检验.结果 共获得26个特异性引发免疫反应的H37Rv菌株蛋白组分.细胞膜组分M3Fr18与结核病患者的血清免疫学反应的吸收光度(A450值)为(721±3)×10-3,明显高于健康人[(356±6)×10-3],也明显高于卡介苗株细胞膜相应组分与健康人的血清免疫学反应强度[(414±7)×10-3],差异均有统计学意义(t值分别为1.852和1.037,均P＜0.01).细胞膜组分MI0Fr21与结核病患者的血清免疫学反应的A450值为(954±6)×10-3,明显高于健康人[(415±6)×10-3],也明显高于卡介苗株细胞膜相应组分与健康人的血清免疫学反应强度[(315±4)×10-3],差异均有统计学意义(t值分别为2.113和2.550,均P＜0.01).结论 二维液相色谱和酶联免疫吸附试验联合应用,有助于检测人MTB感染的相关抗原蛋白.M3Fr18和M10Fr21蛋白质组分可引起结核病患者的特异性免疫反应,提示其可能是人MTB感染的特异抗原.

Abstract：

Objective To compare the proteome of Mycobacterium tuberculosis (MTB) H37 Rv strain with Bovine mycobacterium (Bacillus Calmette-Guerin, BCG) strain at the sub-cellular level. Methods Proteins of the cell wall, membrane and cytolymph of H37 Rv and BCG were extracted by density gradient centrifugation. Sub-cellular proteome of H37 Rv and BCG were analyzed using 2-dimensional liquid chromatography. The immunity reactions of H37 Rv fractions with sera from patients ( n = 5 ) and healthy controls ( n = 5 ), as well as BCG fractions with sera from healthy controls ( n = 5 ) were analyzed by ELISA.Data was analyzed by t test. Results Twenty-six fractions of H37 Rv were found to elicit specific antibody response. Fraction M3Fr18 of H37 Rv reacted with sera from patients. The A450 [ (721 ± 3 ) × 10-3] was higher than that with sera from healthy controls [ ( 356 ± 6) × 10 - 3 ] , as well as the A450 of the corresponding fractions of BCG with sera from healthy controls [ (414 ± 7) × 10-3 ]. The differences between the patient group and the 2 healthy control groups were significant ( t = 1. 852 and 1. 037, all P ＜ 0. 01 ). Moreover,fraction M10Fr21 of H37Rv reacted with sera from the patients. The A450[ (954 ±6) × 10 -3 ] was higher than that with sera from the healthy controls [ (415 ± 6 ) × 10-3 ], as well as the A450 of the corresponding fractions of BCG with sera from the healthy controls [ ( 315 ± 4 ) × 10-3 ]. The differences between the patient group and the 2 healthy control groups were significant ( t = 2. 113 and 2. 550, all P ＜ 0. 01 ).Conclusions The combination of 2-dimensional liquid chromatography and immunology technology is useful in finding antigens associated with MTB infection. Fractions M3Fr18 and M10Fr21 can elicit specific immune reaction among MTB patients, suggesting that they may be specific antigens of MTB infection.     

结核分枝杆菌Rv0867c基因的克隆表达及其纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv0867c基因的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增目的基因片段;通过克隆载体pUC19构建质粒载体pUC19-Rv0867c,经序列测定证实正确,双酶切后连接于表达载体pPRO-EXHT,转化入大肠杆菌DH5α中,再经IPTG诱导表达带His标签的Rv0867c融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式。结果成功扩增出了结核分枝杆菌Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的表达载体pPRO-EXHT-Rv0867c,转化入大肠杆菌DH5α中,经诱导产生高水平的表达产物。经SDS分析,在80 kD处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量约占菌体蛋白的23.7%。该融合蛋白以包涵体的形式存在,用Ni²⁺-NTA纯化柱在变性条件下进行纯化。结论成功克隆了结核分枝杆菌Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的研究

目的 建立并评估快速鉴定结核分枝杆菌复合群（MTBC）与非结核分枝杆菌（NTM）的多重PCR方法。 方法 应用分别针对MTBC的oxyR-ahpC基因间隔区、MTBC和NTM的rpoB基因可变区的3对分枝杆菌特异性引物进行多重PCR扩增,扩增产物分别为473 bp、235 bp和136 bp。应用该多重PCR方法对6株MTBC标准株、50株NTM标准株、312株MTBC临床分离株和300株NTM临床分离株进行了初步菌种鉴定。 结果 经多重PCR 扩增后进行凝胶电泳,MTBC标准株473 bp和235 bp片段均可见,NTM标准株仅见136 bp片段。312株MTBC临床分离株中,310株扩增出473 bp和235 bp片段,敏感度为99.36%（310/312）,特异度为99.32%（294/296）;300株NTM临床分离株中,294株扩增出136 bp片段,敏感度为98.00%（294/300）,特异度为100.00%（310/310）。 结论 该多重PCR方法可检测并鉴别MTBC及NTM,具有高度的特异度和敏感度,有可能作为鉴别MTBC与NTM的有价值的检测手段。     

淋巴细胞部分结核分枝杆菌DNA检测的临床意义

目的 判别淋巴细胞部分ＴＢ－ＤＮＡ检测的临床意义。方法 将淋巴细胞分离液血细胞方法与ＰＣＲ方法结合，对１５０例活动性结果、５０例非结核、３０例结核病已于三年前治愈者，３０例健康对照者同步检测外周血淋巴细胞部分和血浆部分的ＴＢ－ＤＮＡ１２３ｂｐ和２４５ｂｐ；并３０例初治肺结核病人外周血淋巴细胞部分ＴＢ－ＤＮＡ转阴时间。整个研究采取双盲法。结果 确立有ＴＢ－ＤＮＡ存在于活动性肺结核病人淋巴细胞部分而不     

结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及酶学性质研究

目的获得具有生物学活性的结核分枝杆菌重组异柠檬酸裂解酶蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增该菌株的异柠檬酸裂解酶基因ic l,克隆入原核表达载体pET-28 a(+)中,通过在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得以镍离子螯合型琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白,并对其酶学性质进行测定分析。结果纯化出具有生物学活性的重组结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶。酶学性质测定分析表明,重组异柠檬酸裂解酶ICL的比活力为7.657×102μmol.mg-1.m in-1,反应最适pH值约为7.4。重组蛋白经高效液相色谱及质谱鉴定,测得相对分子质量为50 603.347。在5 mmol/L Tris-C l缓冲液、pH值7.8、25℃条件下,重组ICL的二级结构中相对有43.8%的α螺旋、31.9%的β折叠、3.4%β转角、20.9%无规则卷曲。结论本研究成功克隆表达结核分枝杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因,酶学性质鉴定获得了具有生物学活性的重组蛋白,为该酶免疫学研究及新型抗结核药物的筛选奠定了基础。     

结核分枝杆菌IS6110序列在石蜡组织中的检测、克隆与测序

目的：探讨套式-聚合酶链反应（Nested-PCR)检测石蜡组织中结核分枝杆菌的特异性和敏感性。方法：采用套式-PCR检测石蜡包埋组织中结核菌复合体特异插入序列IS6110,并对部分标本的PCR产物进行克隆和测序。结果：31例结核标本石蜡组织检出结核菌DNA共28例,套式-PCR的敏感度为90.3%,特异度为100%。阳性预测值为100%。随机选取两例PCR产物没是序结果与结核菌标准株H37Rv同源性分别为97%和95.3%。结论：套式-PCR检测常规石蜡包埋组织中结核菌IS6110序列具有特异性强和敏感性高的特点,可应用于临床诊断,尤其是对那些常规苏木精-伊红染色和抗酸染色无法确诊的病例更具意义。     

深圳地区结核分枝杆菌耐药及广泛耐药分离株的分子特征

目的 研究2007-2008年深圳地区MTB耐药和广泛耐药分离株的分子特征.方法 参照世界卫生组织和同际防痨与肺部疾病联盟的标准,使用改良罗氏药敏培养基,用1%比例法药敏试验,筛选出针对异烟肼、利福平、链霉素、氧氟沙星和卡那霉素5种药物耐药或敏感的临床分离株,通过PCR扩增筛选菌株的rpoB、katG、rpsL、rrs~((1))、gyrA/B和rrs~((2))基因的相关序列,运用DNAStar和Blastn进行序列分析.结果 筛选出实验菌株123株,其中耐药株73株,全敏感株50株.异烟肼耐药株katG基因突变率为44/52,突变位点全部为S315T或S315N.利福平耐药株rpoB基因突变率为44/47,突变位点主要集中在S531L(30/44)、H526D(9/44)和H526R(1/44).链霉素耐药株以rpsl基因突变为主,突变位点为K43R(19/28)和KS8Q(6/28);rrs(1)基因突变较少见,仪有491C→T(2/28)和513A→C(1/28),2个基因突变率合计为28/41.氧氟沙星耐药株突变率为11/11,以gyrA基因突变为主,突变位点包括D94A(2/11)、S91P(4/11)和A90V(3/11),3个突变位点总突变率为9/11;     

应用多重聚合酶链反应法检测并鉴别结核分支杆菌与非结核分支杆菌DNA

OBJECTIVE: To improve the specificity and sensitivity of polymerase chain reaction (PCR) technique for detecting and identification of DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis. METHOD: Three pairs of oligonucleotide primer were used in triplex-PCR. A 383 bp DNA fragment encoding part of the 65,000 mycobacterial surface antigen, a 123 bp fragment corresponding to a specific M. tuberculosis complex sequence which was the insertion sequence 6110 (IS 6110) and a 268 bp fragment for human beta-globin were amplified by triplex-PCR respectively. RESULT: The sensitivity of the triplex-PCR-electrophoresis for the DNA of mycobacterium was 0.6 pg. The specific bands of 383 bp and 123 bp among the amplified DNA from M. hominis, M. bovis, BCG and M. simiae were present in the agarose gel. By contrast, only a band of 383 bp was found among the M. nontuberculosis which contained M. avium, M. chelonae, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. kansasii, M. intracellulare and M. smegmatis. Compared with the standard strains, there was an additional 268 bp band in simulated clinical samples infected by Mycobacterium. The above 3 specific bands were found neither in other 15 bacterial species tested nor in Mycoplasma pneumoniae. 182 clinical samples were examined by culture, smear and triplex-PCR. 72 nontuberculous clinical samples were all negative. In 110 tuberculosis clinical samples, the positive rates were 2.7%, 13.6% and 32.7%, respectively. CONCLUSION: The triplex-PCR possesses a high specificity and sensitivity. This method could detect and identify the DNA of M. tuberculosis and M. nontuberculosis except M. simiae. It is a valuable tool for early diagnosis and differentiation for infection of M. tuberculosis and M. nontuberculosis.     

AmpliSensor-聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌及临床应用

目的探讨Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ－聚合酶链反应（ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ）在结核病诊断中的价值。方法采用ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ对７８４例结核病患者及１６０例肺癌患者的标本进行检测，并与ＰＣＲ（凝胶电泳后，经溴化乙锭染色）、涂片、培养等法比较。结果ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ的敏感性显著高于涂片及培养（Ｐ＜０．０１）。特异性较ＰＣＲ法高。结论ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ可以通过标准曲线划定检出下限，并可换算出标本中原始的靶ＤＮＡ值，同时具有较高的特异性和敏感性，对肺结核尤其是肺外结核的诊断有一定的临床意义。     

结核分枝杆菌RD1区编码蛋白ELISPOT辅助诊断活动性结核病的应用价值

目的 比较E/C联合Rv3879c蛋白作为抗原的ELISPOT和T-SPOT.TB试剂盒,探讨其在活动性结核病诊断中的应用价值.方法 选取初治结核病患者106例作为结核组,43例肺部其它疾病患者做为疾病对照组和48例健康者做为健康对照组,应用T-SPOT.TB和ELISPOT检测受试者外周血单个核细胞的斑点形成细胞数量,同时对受试者行T研.结果 T-SPOT.TB和ELISPOT在结核病组中的敏感度分别为92.5％和93.4％,TST阴性对照组中的特异度均为91.5％,在健康者中的阳性率分别为18.8％和16.7％,且两种方法差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 E/C联合Rv3879c蛋白作为抗原的ELISPOT能够诊断活动性结核病,并为结核感染诊断提供一定的依据.     

TaqMan聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌DNA及其临？…

目的 探讨ＴａｑＭａｎ聚合酶链反应（ＴａｑＭａｎ－ＰＣＲ）技术在肺结构诊断中的价值。方法 对１６８例活动性肺结核、５７例肺癌患者的痰和外周血及３４－例健康对照外周血,同时应用ＴａｑＭａｎ－ＰＣＲ、ＰＣＲ检测,并与痰涂片法、ＢＡＣＴＥＣ法及改良罗氏培养法结果进行比较。结果 ＴａｑＭａｎ－ＰＣＲ检测痰和外周血总的阳性率分别为５３．０％和６１．３％,显著高于ＰＣＲ、痰涂片法、ＢＡＴＣＴＥＣ法及改良罗氏培