结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价。方法以结核分枝杆菌标准株H₃₇R_v为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上。重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5μg/ml重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml)等效。结论重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的克隆表达及效价测定

目的 在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区CFP10-ESAT6融合蛋白,测定融合蛋白对结核分枝杆菌致敏豚鼠的效价.方法 以结核分枝杆菌标准株H37Rv为模板,采用Overlap PCR方法扩增CFP10-ESAT6融合基因,并克隆入pET-30a质粒,IPTG诱导工程菌表达融合蛋白,离子层析柱分离纯化融合蛋白.以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定. 结果 结核分枝杆菌融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,融合蛋白占总菌体蛋白的30%以上,经离子层析柱纯化纯度达95%以上.重组蛋白可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,2.5 μg/ml 重组蛋白诱导豚鼠皮试反应与TB-PPD(50 IU/ml) 等效.结论 重组融合蛋白有望成为结核感染皮试诊断用新试剂.     

CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究

目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值。方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断,将其先后克隆入pET-28a表达载体。优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制备兔多克隆抗体,建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以健康者血清为对照,检测170例结核患者血清的抗体。结果 重组质粒 pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致。融合蛋白在E.coli BL21(DE3)工程菌中均为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40%。利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白,纯度达到95%以上。Western blot分析表明,重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应,与健康者血清不发生反应。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000,CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002 μg/mL,患者血清的最佳稀释度为1∶500。检测结果与临床诊断的符合率,ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>ELISA(kit)。结论 CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性,有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原,对结核的诊断具有重要参考价值。     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因穿梭表达载体的构建及在BCG中的表达

目的　构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法　以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重组 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG ,将rBCG培养 2 3天 ,于收菌前 3天每天 4 5℃热诱导 4 5min ,对表达产物作SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果　重组质粒 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6经酶切及测序证实构建成功 ,并在BCG中经热诱导成功表达出了具有CFP10及ESAT6抗原性的CFP10 -ESAT6融合蛋白。结论　成功构建能表达CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组BCG ,为发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。结论 成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白。该重组蛋白具有特异的免疫原性。     

重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备及应用研究

目的 制备重组培养滤液蛋白10和6000早期分泌性抗原靶的融合蛋白(rCFPlO-ESAT-6)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 用基因拼接(Gene SOEing)法扩增lhp-ESAT-6融合基因、并克隆人pQE30质粒，表达、纯化rCFPl0-ESAT-6蛋白，通过Western blot分析其抗原性。建立豚鼠BCG免疫模型和结核分枝杆菌强毒株(H37Rv)感染模型，建立以融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测豚鼠血清中的抗结核分枝杆菌抗体，并与以纯化蛋白衍生物(PPD)为抗原的ELISA法比较。结果 重组质粒pQE30-CFPl0-ESAT-6靶基因的测序结果与预计序列(lhp-linker-ESAT-6)完全一致。融合蛋白在DH5α菌中以可溶性非包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的40％，分子质量为26000，纯化后的蛋白纯度为98％，浓度为1.2g／L。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患血清、兔抗CFP10血清和兔抗ESAT-6血清都能发生特异性免疫反应。以10只生理盐水处理豚鼠血清的平均吸光度(A)值 2s为正常界限值，以融合蛋白为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应；以PPD为抗原，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11份BCG免疫豚鼠血清也全部呈阳性反应。结论 pQE30-CFPl0-ESAT-6 DH5α菌能高效表达rCFPl0-ESAT-6融合蛋白，该蛋白兼具CFPl0和ESAT-6两种蛋白的抗原性，能特异性区分豚鼠因H37Rv感染和BCG免疫后产生的抗结核分枝杆菌抗体。本研究为rCFPl0-ESAT-6融合蛋白在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础。     

重组耻垢分枝杆菌Msmc^2-CFP10-ESAT6的构建

目的构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pB-CG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,构建耻垢疫苗株Msmc2155-CFP10-ESAT6,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,Western blot分析其免疫原性。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,并在耻垢分枝杆菌中经热诱导表达出分子质量单位约为22 ku的CFP10-ESAT6蛋白,该蛋白可被结核病患者血清、鼠抗ESAT6血清和鼠抗CFP10血清识别。结论结核分枝杆菌lhp-ESAT6融合基因在耻垢分枝杆菌中成功表达。     

结核分枝杆菌CFP32蛋白的原核表达及其细胞免疫学检测价值评价

目的 克隆、表达与纯化结核分枝杆菌CFP32蛋白,并对其进行细胞免疫学特性评价。方法 PCR扩增cfp32基因片段,与pET-30a(+)构建重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,对融合蛋白进行纯化,ELISPOT试验测定其细胞免疫应答,通过牛结核外周血IFN-γ释放试验,评价其作为刺激原的能力。结果 构建了正确基因序列的重组质粒,并在BL21(DE3)中高效可溶性表达,融合蛋白大小为32 ku,纯度达91.8%。ELISPOT显示CFP32蛋白刺激机体分泌IFN-γ和IL-4的细胞数相当,呈现Th1/Th2的平衡。在牛结核外周血IFN-γ释放试验中,其阳性符合率和阴性符合率分别为40%和73.3%,与牛型PPD刺激结果的相关系数为0.684。结论 成功构建CFP32蛋白重组表达菌,该蛋白引起的免疫应答趋向于Th1/Th2的平衡,并且有作为刺激原用于牛结核病检测的潜力。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白的表达与纯化

目的克隆表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白并纯化,测抗原的免疫原性,为结核病的临床诊断提供有效的候选抗原。方法利用生物信息学分析免疫优势位点,设计不同引物,采用聚合酶链反应（PolymeraseChain Reaction,PCR）扩增出相应基因片段,插入pET30a表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达目的蛋白,亲和纯化后用H37Rv免疫的兔血清进行间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定其免疫原性。结果 PCR扩增的CFP10、ESAT6和Rv33425基因片段与基因文库（Genbank）报道的完全一致。三者在大肠杆菌BL21（DE3）中融合表达的产物约为22kDa,与预计大小相吻合。Ni-NTA亲和纯化出目的蛋白。ELISA显示该蛋白具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425融合基因片段的融合表达纯化后,可作为结核病免疫诊断的一个候选抗原。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6-CFP10的融合表达及纯化

目的在原核表达系统融合表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6和培养滤液蛋白CFP10的融合蛋白(rE6C)并纯化,测定抗原性和特异性。方法用将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(﹢)中,构建pET32c(﹢)-linker。PCR法扩增ESAT-6、CFP10基因。将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(﹢)的linker前,CFP10克隆入linker后,构建E6C融合基因,转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠杆菌BL21中表达,纯化rE6C蛋白,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其抗原性和特异性。结果重组质粒pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物,纯化的表达产物具备较高的纯度、抗原性和特异性。结论pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达,rE6C融合蛋白具有良好的抗原性和特异性,有望用于结核分枝杆菌感染的临床诊断。     

结核分枝杆菌CFPl0-ESAT6-TB7．7的融合表达及其在小鼠上的细胞免疫学特性

目的构建结核分枝杆菌CFPl0-ESAT6-TB7．7融合蛋白的表达质粒,利用大肠杆菌表达系统获得原核蛋白,在小鼠模型上评价其细胞免疫学特性。方法通过PCR扩增出lhp—linker-esat6-linker和linker-Rv2654c片段,构建正确的pET32a（＋）-lhp—linker-esat6-linker—Rv2654e原核表达质粒,转化BL21（DE3）后在IPTG诱导下表达,并纯化该融合蛋白,westernblot验证蛋白的免疫原性,通过T细胞增殖实验和夹心ELISA评价其细胞免疫学特性。结果成功构建pET32a（＋）-lhp-linker—esat6-linker-Rv2654e原核表达质粒,SDS-PAGE显示在45kDa处出现目的条带,Westernblot证明融合蛋白对anti—ESAT6,ant-CFPl0,anti-His单抗和rGST—TB7．7多抗血清均有反应,说明该融合蛋白具有良好的免疫反应性,T淋巴细胞增殖实验显示该蛋白能明显引起小鼠的T细胞免疫反应。夹心ELISA实验也表明,融合蛋白刺激产生的IFN-7和IL-4水平与对照组相比均有显著性差异,同时融合蛋白诱导产生的IFN-7水平明显高于IL-4。结论CFPl0-ESAT6-TB7．7融合蛋白在大肠杆菌系统中实现可溶性表达,并获得免疫反应性良好的纯化产物,该融合蛋白能引起明显的T细胞增殖,具有诱导Th1型免疫应答的特性。     

结核分枝杆菌培养滤液蛋白21(CFP21)的基因克隆、表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌培养滤液蛋白21 (Culture filtrate protein 21, CFP21)原核表达载体,获得CFP21蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,PCR 扩增cfp21基因,质粒PET28a ( + )为表达载体,构建PET28a（+）/cfp21质粒,转化入大肠埃希菌DH5α中,抽提质粒,PCR扩增,测序,转化到大肠埃希菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS PAGE分析,并用His Bind 蛋白纯化试剂盒纯化CFP21。结果构建、表达和纯化了CFP21,分子量约为24kD,主要以包涵体形式存在。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,纯化得到CFP21蛋白,为CFP21的进一步研究奠定基础。