根癌农杆菌对云南红豆杉原生质体的转化

本文介绍了根癌农杆菌T-DNA对云南红豆杉原生质体的转化,分析了转化系的紫杉醇合成能力。实验以生长20 d的云南红豆杉幼茎诱导的淡黄色愈伤组织为材料,经酶解可分离出大量有活力的原生质体。在由B5无机盐、KM有机成分、3.0 mg/L 2,4-D、0.1mg/L KT和0.45 mol/L果糖组成的培养基中培养1周后,原生质体再生细胞持续分裂形成细胞团。根癌农杆菌对原生质体的转化能力与原生质体生长状态及菌株相关。虽然刚分离的或已再生细胞壁的原生质体不能被根癌农杆菌转化,但由10个以上细胞组成的原生质体克隆和根癌农杆菌B6S3菌株共培养后可实现T-DNA转化,高压纸电泳检测转化系具有冠瘿碱的合成,转化率约为5％。HPLC证实转化系具有合成紫杉醇的能力,但不同转化系中紫杉醇含量变异很大,最高含量为0.076％,是对照愈伤组织的6倍,表明T-DNA的插入改变了培养细胞对紫杉醇的合成。获得的高产转化系细胞生长比对照低,但继代培养中其生长和紫杉醇积累基本保持稳定。尽管转化系合成紫杉醇能力远未达到商业化生产的要求,但研究通过T-DNA对原生质体的转化而实现插入诱变,可以为分离高产紫杉醇优良细胞系提供单细胞筛选系统。     

根癌农杆菌对枳壳遗传转化的影响因素

目的：建立一套根癌农杆菌转化枳壳的有效方法,为枳壳新品种选育、引入外源基因奠定基础。方法：以枳壳实生苗的上胚轴为材料,农杆菌菌株为ＥＨＡ１０１,含质粒载体ＰＧＡ４８２ＧＧ,质粒上插入了ＧＵＳ,ＮＰＴⅡ基因。结果：２０ｄ苗龄的外植体转化再生率较高;其感染前先进行２ｄ预培养,对转化有一定促进作用;外植体与农杆菌共培养时间以２～３ｄ为宜;乙酰丁香酮能较大提高转化效率,转化再生频率达２７．５％;外植体与农杆菌共培养后延迟２ｄ选择,抗性芽发生率有所提高。结论：通过探讨根癌农杆菌对枳壳遗传转化的影响因素,获得较高的转化再生频率,建立了有效的转化再生系统。     

根癌农杆菌介导的怀地黄遗传转化研究

目的研究适于怀地黄Rehmannia glutinosa遗传转化的激素质量浓度和潮霉素质量浓度。方法以地黄无菌苗叶片为外植体,以根癌农杆菌介导的叶盘法进行转化,分析了潮霉素和乙酰丁香酮(AS)对抗性愈伤诱导率和再生芽分化效率的影响。结果潮霉素的质量浓度对抗性愈伤和抗性芽的产生影响很大,影响抗性愈伤诱导的临界质量浓度为9 mg/L,影响抗性芽分化的临界质量浓度为6 mg/L,适宜于进行地黄遗传转化的质量浓度为12 mg/L。侵染培养基和共培养培养基中添加100μmol/L的AS可以极显著提高转化效率。PCR扩增和β-葡萄糖苷酶(GUS)染色结果表明,外源基因成功整合到地黄基因组中。结论建立了有效的怀地黄稳定遗传转化再生体系,为地黄的分子生药学研究和遗传改良奠定基础。     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ.根癌农杆菌介导的转基因菘蓝

目的：将外源半夏凝集素基因（PTA）转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性。方法：构建了以CaMV 35S为启动子，新霉素磷酸转移酶（Npt-Ⅱ）为选择标记，带有半夏凝集素基因PTA的pCAMB I A2200植物双元表达载体，应用根癌农杆菌EHA 105遗传转化四倍体菘蓝。结果：菘 外植体植株再生率达到95％以上，转化率有10％。结论：建立了以6－BA和NAA为主要激素组合的四倍体菘蓝离体分化再生系统和农杆菌介导的转化系统。     

根癌农杆菌介导sHSP基因对半夏的遗传转化

目的:建立高效的半夏遗传转化体系.方法:以半夏试管苗的叶柄为外植体,采用根癌农杆菌介导法,探索了酚类物质、农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间等对半夏遗传转化效率的影响.结果与结论:不经过预培养阶段,用含AS 40 mg·L-1的根癌农杆菌菌液侵染15 min后共培养3d时可有效提高遗传转化效率.将转化后的叶柄接到含有100 mg·L-1 Kan和350 mg·L-1Carb的分化培养基上进行筛选培养,30 d左右在叶柄的两端分化出抗性的试管小块茎.对抗性转化植株进行Gus染色和PCR检测,结果表明外源基因sHSP已经整合到半夏基因组中.     

RP-HPLC法测定云南红豆杉提取物中紫杉醇的含量

<正>紫杉醇是从红豆杉科植物中分离出的一种抗癌新药,是迄今为止最有希望的抗癌天然产物,有关紫杉醇含量测定方法很多,我们采用RP-HPLC法,所用的流动相为乙腈:水系统,经过对我所研制的数批云南红豆杉提取物中紫杉醇的含量测定,方法简便,灵敏度高,效果满意。     

农杆菌转化后丹参植株再生

用发根农杆菌15834,LBA9402株和根癌农杆菌C58株感染丹参无菌苗,完成质粒转化后诱导出毛状根和冠瘿瘤。毛状根和冠瘿组织在无激素的培养基上于光照条件下分化出转化后的丹参再生植物,再生植物移植到土壤中能够成活。用发根农杆菌转化后的再生植物的具有节间缩短,植株矮化、地下部毛状须根发达等特征。用根癌农杆菌转化后的再生植物生长旺盛,地上部分较原植物高大,根系发达,根产量和丹参酮含量都高于原植物。     

用东北红豆杉培养细胞的原生质体高效生产紫杉醇

作者首次测定了从东北红豆杉 Taxuscuspidata 培养细胞中大量分离有活力的原生质体的适宜条件,通过原生质体的分离培养,定量分析了细胞中紫杉醇的分布,并评价了用原生质体生产紫杉醇的潜力。从该植物种子诱生培养细胞,使用的WP 培养液含2mg/L α-萘乙酸(NAA)、20g/L 葡萄糖,固体培养基除含上述成分外增加200mg/L 琼脂糖凝胶。液、固培养基的传     

云南红豆杉中紫杉醇粗品的提取及测定方法

红豆杉中紫杉醇含量很少,为了更有效地利用有限的植物资源,有关方面都在不断地改进提取方法。用85％乙醇在60℃浸泡过夜,连续提取3次,可提高粗品的产量。紫杉醇粗品纯度测定方法通常采用目视法,为提高其准确性,用紫外吸收光谱法,以氯仿作溶剂,在275±1nm处进行测定可得到较好结果。     

云南红豆杉高紫杉醇含量细胞系的选择

目的 :选择云南红豆杉高紫杉醇含量细胞系。方法 :根据色泽、质地、生长速率和分泌有色物质等性状 ,将不同的小细胞团挑出、单独培养 ,并对其进行生长分析和紫杉醇含量测定。结果与结论 :通过仔细选择 ,可以得到紫杉醇含量高的细胞系 ;颜色深、生长慢、干重 /鲜重比值高的细胞系紫杉醇含量常常较高。     

云南红豆杉心木的化学成分研究

目的进一步了解云南红豆杉心木部位的化学成分。方法云南红豆杉心木的乙醇提取物,经用萃取、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱等方法分离,从其氯仿萃取部位分离鉴定得18个化合物,采用波谱解析(UV、IR、ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR)等方法确定其结构。结果这18个化合物分别为12个紫杉烷:2α,5α,7β,9α,10β,13α-六乙酰氧基-4(20),11-紫杉二烯(Ⅰ)、紫杉素(Ⅱ)、紫杉-4(20),11-二烯-2A,5A,10β-三乙酰氧基-14β,2-甲基丁基(Ⅲ)、10B-羟基-2A,5A,14β-三乙酰氧基-4(20),11-紫杉二烯(Ⅳ)、1-去羟基巴卡亭Ⅳ(Ⅴ)、巴卡亭Ⅳ(Ⅵ)、巴卡亭Ⅵ(Ⅶ)、7,9-去乙酰基巴卡亭Ⅵ(Ⅷ)、10-去乙酰基云南红豆杉素(Ⅸ)、1B-乙酰氧-5-去乙酰基巴卡亭Ⅰ(Ⅹ)、巴卡亭Ⅰ(Ⅺ)、taxuchinA(ⅩⅡ);4个木脂素:开环异落叶松树脂素(ⅩⅢ)、A-conidendrin(ⅩⅣ)、异紫杉脂素(ⅩⅤ)、落叶松脂醇(ⅩⅥ);2个其它化合物:肌醇甲醚(ⅩⅦ)、β-谷甾醇(ⅩⅧ)。其中化合物Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅺ、ⅩⅡ、ⅩⅥ为心木部位首次分得的成分。结论云南红豆杉心木部位的化学成分同云南红豆杉其他部位有一定的差异,但就红豆杉属而言没有什么差异。     

农杆菌介导鱼腥草遗传转化的主要影响因素

目的：研究鱼腥草遗传转化的影响因素,以提高转化效率,获得转基因植株。方法：通过分析GUS报告基因的瞬时表达和外植体愈伤分化情况比较菌株质粒组合、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间、抗生素种类和浓度等因素对转化的影响,应用PCR和Southern blot技术鉴定转基因植株基因组中的外源基因。结果：菌液浓度A600为0.3、26℃侵染15min条件下侵染,添加乙酰丁香酮有利于转化,适宜的预培养时间和共培养时间与菌株/质粒组合有关,农杆菌LBA4404/pBI121优于EHA105/pCAMBIA1305.2组合。经条件优化,转化外植体的GUS染色阳性率在60%～80%之间,经鉴定外源基因已整合到转基因鱼腥草基因组中。结论：通过影响因素的优化研究,获得了鱼腥草转基因植株,为培育鱼腥草基因工程新品种奠定了基础。     

云南红豆杉枝叶中紫杉醇和三尖杉宁碱含量的测定

目的建立云南红豆杉枝叶中紫杉醇和三尖杉宁碱的含量测定方法。方法采用HPLC法,选用AngilentHypersilODS2色谱柱,流动相甲醇-乙睛-水(20∶30∶50),检测波长227 nm,柱温30℃,对云南红豆杉枝叶中紫杉醇和三尖杉宁碱的含量进行了测定。结果紫杉醇和三尖杉宁碱均在0.04~1.2μg之间呈线性关系,紫杉醇平均回收率为96.93%(RSD=1.62%,n=5),三尖杉宁碱平均回收率为96.68%(RSD=1.81%,n=5)。结论该含量测定方法准确可行,重复性好,可以作为测定红豆杉枝叶中紫杉醇和的三尖杉宁碱含量的高效液相色谱方法。     

云南红豆杉中的非紫杉烷类化合物

从怒江产云南红豆杉 Taxus yunnanensis中分得 5个非紫杉烷类化合物:3β- hydroxy- 5 α,8α- epidioxyergosta-6,2 2 diene(),β-谷甾醇(β-sitosterol,),pluviatilol(Ⅱ),α-conidendrin()和 secoisolariciresinol(Ⅱ)。其中 是首次从红豆杉科植物中得到。我们利用核磁共振波谱与质谱等技术确定了它们的结构。     

HPLC法测定云南松松针中莽草酸的含量

目的：建立高效液相色谱法测定云南松松针中莽草酸的含量方法。方法：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6mm×150mm,5μm）,流动相为甲醇-1%磷酸水溶液（3：97）,流速0.8m.lm in-1,检测波长214nm,柱温25℃。结果：莽草酸在0.0312-0.4368ug范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999）,平均加样回收率为99.97%,RSD为1.06%（n=6）。结论：此方法准确、简便,适用于云南松松针中莽草酸的定量分析。     

HPLC法测定不同采收期云南松中莽草酸的含量

目的:建立云南松中莽草酸的高效液相色谱测定方法,以分别考察同一产地不同采收期的云南松中莽草酸的含量.方法:色谱柱为Agilent Eclipse XDB- C18(φ4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为甲醇-1％磷酸水溶液(10:90),流速0.8 mL/min,检测波长214 nm,柱温25℃.结果:莽草酸在0.0312～0.4368 ug范围内与峰面积呈良好的线性关系(r＝0.9999),平均加样回收率为99.97％,RSD为1.06％(n＝6).结论:此方法准确、简便、重复性好,可用于含莽草酸的药材及制剂的质量控制.     

云南松松塔中挥发性成分的气相色谱-质谱联用分析

目的研究云南松松塔中挥发性成分的化学组成。方法采用水蒸气蒸馏法提取云南松松塔中的挥发性成分,并用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对云南松松塔挥发性成分进行分离和鉴定。结果确定了其中20个组分的化学结构,并得到相对含量。结论云南松松塔挥发油中主要含有异长叶烯、石竹烯氧化物、α-蒎烯等物质。     

云南松松针挥发性成分的气相色谱-质谱分析

目的：研究云南松松针挥发油的化学成分,为进一步开发和利用该资源提供科学依据。方法：采用水蒸气蒸馏法提取云南松松针挥发油,经气相色谱-质谱联用技术分析其成分,采用峰面积归一化法测得各组分的相对百分含量。结果：从中鉴定出45个组分,占峰面积的84．14％。结论：云南松松针挥发性成分主要为α-蒎烯（14．74％）,脱氢-4-表松香酸（11．67％）,2,7-二羟基-3,4,6-三甲氧基-9,10-二氢菲（8．41％）,石竹烯（6．91％）,乙酸冰片酯（5．63％）,D-柠檬烯（4．55％）,1,6-杜松二烯（4．16％）等。