人黄体松弛素原基因的克隆及在大肠杆菌中的初步…

为了加速我国基因工程高技术药物的研制，开发新型，具有生物活性功能的人重组松弛素原，利用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术从人黄体组织克隆了松弛素原的编码基因，包括Ｂ和Ａ链以及连接肽（Ｃ肽）。克隆的松弛素原基因进行序列测定后，再亚克隆的原核表达载体ＬＫＢ２，转化大肠杆菌ＢＬ２１，用ＩＰＴＧ诱导表达，结果表明，克隆的松弛素原基因与已发表的基因序列相同，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达蛋白的分子量为２０ｋ     

大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶编码基因的分子克隆及其在 …

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从大肠杆菌染色体ＤＮＡ中克隆了大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶约０．８ｋｂ的编码基因，序列测定表明其序列与已发表资料一致，将此０．８ｋｂ的甲硫氨酸氨肽酶的编码基因克隆到原核高效表达载体ｐＢＶ２２０上，转化大肠杆菌后进行表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明表达产物分子量为３２０００，表达量约占菌体蛋白的２０％左右，活性测定表明其活性中达２０Ｕ／ｍｌ菌液。     

3种新型人肿瘤坏死因子衍生物在大肠杆菌中的表？…

Objective　Studies of novel human tumor necrosis factor-α(hTNF-α) derivatives with increased antitumor activity. Methods　Based on the pervious studies of hTNF-α structure-functional relationship, three mutated hTNF-α genes were generated by PCR. These genes were inserted into E.coli and confirmed by DNA sequencing and Western blot. The antitumor activities were determined by mouse L929 cells. Results　Three genes were highly expressed in E.coli. The in vitro cytotoxicity effects of hTNF-α derivatives on L929 cells were 576, 641, 153 times higher than that of natural hTNF-α. Conclusion　The antitumor activities of hTNF-α derivatives are highly improved. And the derivatives have displayed potential prospect for clinical application.     

人CD4基因在大肠杆菌中的表达

本文设计并化学合成了一对ＰＣＲ引物，以人ＣＤ４ｃＤＮＡ为模板，成功地扩增出人ＣＤ４Ｎ端两个结构域的编码基因（６００ｂｐ），并在此基因两端分别插入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点及起始和终止码。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点将ＣＤ４基因克隆入ｐＵＣ１９质粒，经过ＰＣＲ和酶切鉴定得到ＣＤ４重组克隆ｐＴ４０３。ＤＮＡ序列分析结果表明，所克隆ＣＤ４基因与已发表的人ＣＤ４基因序列完全一致。将ＣＤ４基因     

56609株钩体lipL32基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的初步表达

钩体病是一种临床表现多样的人兽共患疾病 ,致病性钩端螺旋体 (钩体 )根据交叉凝集反应被分为2 5个血清群和大约 2 5 0个血清型。如此多血清型的钩体所引起的临床症状和体征复杂多样 ,经常造成误诊而延误治疗。因此 ,建立一种简单、快捷、敏感、特异的诊断方法很有必要。钩体的诊断或依赖于检测血清中的抗体或检测组织或体液中的病原体。由于分离钩体不但困难而且费时 ,所以血清学的诊断是一种应用最广泛的方法。与经典的MAT等方法相比 ,ELISA方法具有简单、快捷、敏感、特异等优点 ,但是检测用抗原的选择是决定该方法特异性和敏感性的…     

3种新型人肿瘤坏死因子衍生物在大肠杆菌中的表达与活性检测

目的 研制高抗瘤活性的新型肿瘤坏死因子.方法 在总结前人有关hTNF-α结构与功能关系研究的基础上,应用PCR技术构建了3种多位点同时突变的hTNF-α新型编码基因,分别在大肠杆菌中进行表达,并用DNA序列分析和Western blot进行鉴定,L929细胞检测体外抗瘤活性.结果 3种衍生物均在大肠杆菌中获得高效表达,活性测定结果表明,3种衍生物对L929细胞的细胞毒活性分别比原型hTNF-α提高576、641和153倍.结论 3种衍生物的抗瘤活性有了较大的提高,从而显示出潜在的临床应用前景.     

人亲环素A基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

人亲环素Ａ基因的克隆及在大肠杆菌中的表达李芳秋赵权武建国单祥年环孢素Ａ（ＣｓＡ）是防治器官移植免疫排斥及自身免疫病的重要药物，该药发挥作用必须由体内受体蛋白，即亲环素（ＣｙＰ）来介导。ＣｙＰ是一个功能相关的蛋白家族，具有肽基脯氨酸顺／反异构酶（ＰＰＩ...     

人纤溶酶原kringle5功能区基因在大肠杆菌中克隆和表达

目的:构建含有人纤溶酶原kringle5功能区基因的表达质粒,了解在E.coli中表达情况。方法:采用基因工程技术将人纤溶酶原kringle5功能区基因插入载体PBV220E.coRI位点,再转化到E.coliTGI中,SDS-PAGE观察基因表达。结果:构建出表达质粒PBVK5,42℃诱导获得表达。结论:人纤溶酶原kringle5功能区基因表达产物以可溶性蛋白形式存在,表达量占菌体总蛋白9.8%。     

人内皮抑素克隆表达及对血管内皮细胞生长的抑制作用

目的　获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的重组人内皮抑素 (recombinanthumanen dostatin)。方法　从肝细胞中分离总RNA ,经反转录多聚酶链反应 (RT PCR)得到endostatin全基因。用原核细胞表达载体构建了pBV2 2 0 /endostatin重组质粒 ,经DNA测序确认后 ,将其转化大肠杆菌DH5α进行表达、初步纯化及活性测定。结果　经SDS PAGE分析 ,表达产物相对分子质量 (Mr)约 2 0× 10 3,薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的 30 %。结论　经生物学活性测定 ,表达蛋白能够抑制碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对牛毛细血管内皮细胞 (BCEC)的增殖作用     

致肾盂肾炎大肠杆菌papA基因的克隆及序列分析

目的 对致肾盂肾炎大肠杆菌（ＵＰＥＣ）１３２株的ｐａｐＡ基因进行克隆和序列分析。方法 根据Ｆ１３型ｐａｐＡ基因序列设计引物,并在二引物５′端加上限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＢａｎＨⅠ的酶切位点。采用此引物扩增１３２菌株ｐ菌毛粘附基因群的ｐａｐＡ基因,扩增产物克隆人质粒,选取阳性重组质粒进行核苷酸序列分析。结果 ＵＰＥＣ１３２株经ＰＣＲ法扩增获得约７００ｂｐ的ｐａｐＡ片段,经克隆获得阳性重组质粒ｐＣＴ２     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子与HBsAg融合蛋白基因的 …

目的 研究粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）的免疫活性。方法 用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增出粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）３８４ｂｐ的基因片段及ＨＢｓＡｇ８４６ｂｐ基因片段，扩增产物经柱纯化后，由Ｔ４ＤＮＡ酶连结因子１２３０ｂｐ的片段，将此片段命名为ＬＧＨ，克隆到ｐＵＣ１９质粒中，利用菌落ＰＣＲ法快速筛选阳性克隆及限制酶切鉴定片段的大小。结果 该基因全长１２３０ｂｐ，经     

丙型肝炎病毒非结构区NS3基因在大肠埃希菌中的可诱导性表达

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）NS3基因的原核细胞表达载体。实现在大肠埃希菌中的可诱导性表达。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术，以美国HCV-H株全长cDNA质粒为模板，扩增获得NS3基因片段，克隆到原核表达载体pET-30C( )中，构建原核表达载体pET-NS3，转化BL21（DE3）宿主菌，以IPTG诱导，获得NS3蛋白的可诱导性表达，以HCVNS3的单链可变区抗体（ScFv)证实表达的NS3蛋白的特异性，结果 以HCVNS3基因序列特异性引物，PCR扩增获得1893bp的NS3DNA征段，插入pET-30C( )表达载体，转化BL21（DE3）受体菌，经培养，IPTG诱导，获得了重组HCVNS3蛋白的表达，以HCVNS3的ScFv证实了表达的重组蛋白HCVNS3的特异性。结论 以大肠埃希菌表达了HCVNS3的重组蛋白质。     

免疫佐剂分子CTB基因的克隆与表达

我们采用聚合酶链式反应从霍乱弧菌 5 6 9B和 M0 4 5中扩增得到霍乱弧菌 B亚基基因 ,导入载体p UC18,构建重组质粒 p CTB并转化大肠杆菌 JM10 9,并用限制性酶切分析、聚合酶链式反应、序列分析、硫酸十二烷酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹进行鉴定。实验结果表明我们成功地扩增出 376 bp的霍乱弧菌 B亚基基因 ;构建免疫佐剂分子的重组质粒 p CTB;并在原核系统中表达出 12 KD的霍乱弧菌 B亚基抗原区带。     

克隆、表达及测序一体化的原核表达载体pLCM182的构建及在细胞因子表达中的应用

Objective　To simplify the steps of cloning, sequencing and expressing of heterogeneous genes,a new integral plasmid pLCM182 has been designed and constructed. Methods　This new plasmid is characterized with the pL promoter and RBS of phage T7 gene 10 for high expression of the inserted gene,the universal sequencing primer sites for directly sequencing the inserted gene,and a multiple cloning site specified for fitting the optimizing of translation.Thus once cloning of a PCR product into this plasmid,the gene expression and sequencing can be done without the need of subcloning, and much more time can be saved. Results　By use of this plasmid,several genes obtained by PCR,including human IL-17,human IL-4,and human IL-1RA have been cloned,sequenced,and highly expressed. Conclusion　The integrative plasmid is applicable and convenient for cytokines expression.     

HIV核心抗原p24原核系统的高效表达、纯化及活性鉴定

目的　在原核表达系统中对HIVp2 4抗原基因进行克隆和高效表达、纯化并鉴定其活性。方法　利用PCR技术从HIV-1全基因质粒 (B2N)中扩增p2 4抗原基因 ,并克隆入T载体中。通过酶切消化后连接到表达载体pRSET上 ,用此连接产物转化大肠埃希菌BL2 1,经IPTG诱导 ,表达p2 4抗原。利用固定化金属离子 (Ni2 )配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白。并运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳、WesternBlot(WB)及ELISA法分别对插入基因片段的正确性、表达产物的活性及特异性进行检测。结果　PCR产物约为 6 90bp ,与预期p2 4抗原全基因片段大小一致。重组质粒T-p2 4和pRSET-p2 4经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,其插入的外源基因片段均为 6 90bp。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS PAGE电泳 ,均可见一条约 2 4× 10 3的外源基因表达带 ,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA试验 ,证明基因工程表达的p2 4抗原具有较高的特异性及活性。结论　成功构建了HIVp2 4表达载体pRSET-p2 4 ,并在原核细胞中高效表达 ,其表达产物具有良好的特异性及活性     

北京地区TT病毒分离株全基因的克隆及序列测定

目的 克隆和测定北京地区ＴＴ病毒（ＴＴＶ）分离株全基因序列。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从１例临床非甲￣庚型肝炎病人血清中分段扩增ＴＴＶ全基因,获得５个互相重叠的片段,分别长１９９ｂｐ（１－１９９）,１２６７ｂｐ（９０－１３５６,８７８ｂｐ（１３５４－２２３１,１１２９ｂｐ（２１７８－３３０６,４３４ｂｐ（３３０６－３７３９）,用标准的分子生物学方法测定了这５个序列,从而得到全长ＴＴＶ基因     

分子伴侣基因的克隆及表达

用聚合酶链反应方法从大肠杆菌染色体ＤＮＡ中扩增得到２０００ｂｐ的ＤＮＡ片段，并克隆到ＰＧＥＭ３ｚｆ（＋）载体中，经限制性图谱分析和部分ＤＮＡ序列测定，证实２０００ｂｐ的ＰＣＲ产物为ＧｒｏＥ基因全部编序列。将ＰＣＲ产物构建在ＰＬＰＲ启动子控制下的ＰＢＶ２２０表达质粒中，转入大肠杆菌ＤＨ５ａ，经４２℃热诱导，获得ＧｒｏＥ基因的表达产物，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现分子量约６００００（ＧｒｏＥＬ）及１５００