铜绿假单胞菌oprD2基因突变及表达量改变与碳青霉烯类耐药的关系

目的 研究铜绿假单胞菌外膜通道蛋白OprD2的表达减弱或缺失,以及OprD2蛋白自身突变是否会影响铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药性.方法 收集分离自临床对亚胺培南(IPM)的最低抑菌浓度(MIC)值≥8μg/m1的铜绿假单胞菌共101株,采用肉汤稀释法检测菌株对比阿培南(BPM)、美罗培南(MEM)、帕尼培南(PEM)的MIC值;荧光定量RT-PCR检测铜绿假单胞菌膜通道蛋白oprD2基因的表达量情况;针对oprD2相对表达量正常并对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌,采用普通PCR的方法扩增oprD2全长基因并测序.结果 根据铜绿假单胞菌的OprD2蛋白相对表达量结果,将101株铜绿假单胞菌分成两组,组1为OprD2相对表达量降低组;组2为OprD2相对表达量正常组;组1与组2相比,对IPM、BPM、MEM、PEM的MIC值≥16μg/ml的菌株比例差异均有统计学意义(P＜0.01).组1中,28株同时对4种药物的MIC均≥16 μg/ml,其中有25株的OprD2的相对表达量明显减低(＜0.4);外膜孔蛋白OprD2转录水平与4种碳青霉烯类药物MICs之间呈负相关趋势.组2中,有16株9prD2基因发生突变,按照突变的类型主要分成4组;与PAO1相比,这些菌株对IPM、BPM、MEM、PEM的MIC值有不同程度的增加.结论 OprD2外膜蛋白的表达量减少或缺失是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制,可能也与其他3种碳青霉烯类药物耐药有密切关系;铜绿假单胞菌的oprD2基因发生突变,可能会降低铜绿假单胞菌对这儿种碳青霉烯类药物的敏感性.     

应用siRNA干扰技术沉默铜绿假单胞菌外排泵基因mexB的蛋白表达

目的 观察siRNA干扰质粒转入铜绿假单胞菌后,MexB蛋白表达量的变化.方法 针对mexB基因设计合成特异性siRNA分子,与pGPU6/GFP/Neo载体连接,构建pGPU6/GFP/NeosiRNA重组质粒.构建重组表达质粒pET22b+/mexB,并转化大肠杆菌BL21( DE3) plysS,诱导表达MexB蛋白,蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体.siRNA质粒分别电转化铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株,运用Western blot观察转化8、12、24h后MexB蛋白表达量的变化.结果 成功构建pGPU6/GFP/Neo-siRNA重组质粒.成功表达铜绿假单胞菌外排泵蛋白MexB,并制备多克隆兔抗.siRNA质粒对铜绿假单胞菌野生株、临床耐药株及mexB基因高表达株的mexB基因均具有良好的沉默效果,而且沉默效果存在时间差异性.结论 siRNA质粒转化3株铜绿假单胞菌后,在8h及12 h时均可观察到MexB蛋白表达量明显减少,而在24 h时MexB蛋白表达量无改变.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

抗铜绿假单胞菌 PcrV 蛋白单克隆抗体的筛选和功能验证

目的:获得能应用于治疗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染的抗PcrV 蛋白全人源单克隆抗体。方法:以铜绿假单胞菌PAO1 基因组为模板,PCR 扩增PcrV 基因并构建重组表达载体pET-28a-PcrV,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG 诱导表达,并通过镍离子螯合树脂亲和纯化PcrV 蛋白。利用噬菌体抗体库筛选PcrV 结合的噬菌体克隆并进行序列测定,以测序正确的阳性克隆质粒为模板,PCR 扩增该抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因并构建重组表达载体转染至293E 细胞,收取培养细胞上清,并利用Protein A 树脂亲和纯化抗体。利用ELISA 实验检测抗体亲和力,并通过小鼠铜绿假单胞菌感染肺炎模型验证抗体活性。结果:获得重组蛋白PcrV,通过噬菌体展示技术筛选并制备了一株全人源抗PcrV单克隆抗体YG5。ELISA 实验结果表明YG5 抗体具有较高的亲和力(EC50 =61 ng/ ml),进一步的实验结果表明,YG5 能有效抵抗铜绿假单胞菌感染,降低小鼠的死亡率。结论:靶向铜绿假单胞菌PcrV 蛋白的全人源单克隆抗体YG5 能够有效地抑制铜绿假单胞菌致病性,降低其对机体感染,有可能成为抗铜绿假单胞菌感染的治疗性抗体。     

多重耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用

目的 探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统（外排泵）在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用.方法 选取25株外科监护室分离的多重耐药铜绿假单胞菌,用实时定量RTPCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况;用PCR分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机理.结果 25株多重耐药铜绿假单胞菌中,14株高表达MexAB-OprM系统（56%）,3株高表达MexXY-OprM系统（12%）,这3株菌同时高表达2种外排泵.在8株mexA高表达的菌株中,5株菌发生mexR基因突变,出现氨基酸替代,1株mexR提前出现终止密码子,2株菌未发现mexR基因突变.2株mexX高表达的菌株均发生基因mexZ突变,出现氨基酸替代.结论 主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达,是此菌多重耐药机制之一;外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关,同时存在其他调控机制.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

铜绿假单胞菌生物被膜形成过程中多糖合成相关基因表达的研究

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugirtosa,Pa)生物被膜形成过程中多糖生物合成相关基因在生物被膜形成中的表达,探讨其在生物被膜形成中的调控作用.方法 分别收集非黏液型铜绿假单胞菌PAO1的浮游菌及生物被膜菌,用实时荧光定量RT-PCR的方法对基因的表达进行相对定量分析.结果 多糖合成相关基因pslA、algD.pelA的mRNA在生物被膜菌中的相对表达量均高于浮游菌.结论 .pslA、algD,pelA的表达与铜绿假单胞菌生物被膜形成密切相关,在生物被膜形成中具有重要作用.     

ATF6调控生殖相关基因HSPA1L表达的分子机制

目的 探究内质网应激活化转录因子6(ATF6)对生殖相关基因热休克蛋白A1样蛋白(HSPA1L)表达的影响并初步阐明其调控分子机制。方法 在人胚肾细胞系HEK-293T中转染ATF6过表达质粒,RT-qPCR和Western blot验证过表达效率;利用雄性ATF6敲除小鼠睾丸组织转录物组测序信息,筛选ATF6下游5个生殖相关基因;双荧光素酶报告基因实验选择启动子活性较高的下游基因并检测过表达ATF6对其启动子活性的影响;通过gene-regulation预测ATF6和下游基因启动子可能的结合位点;RT-qPCR和Western blot检测在HEK-293T细胞中过表达ATF6对于下游基因表达的影响;利用凝胶迁移实验(EMSA)确定ATF6与下游基因启动子是否结合。结果 转染后HEK-293T细胞中ATF6的mRNA(P<0.001)和蛋白(P<0.05)表达水平明显升高。转录物组测序及双荧光素酶报告基因实验筛选出ATF6下游的生殖相关基因HSPA1L。ATF6能够促进HSPA1L的截短启动子活性(P<0.001)。过表达ATF6后,HSPA1L的表达量明显升高(P...     

汕头地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药分析

目的：了解汕头地区对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌（PA）的耐药情况及耐药机制。方法：收集临床分离耐亚胺培南的PA共141株，双纸片协同实验检测金属酶表型，PCR法检测外膜孔蛋白OprD2和金属β内酰胺酶（IMP、VIM、SPM）基因。结果：耐亚胺培南的铜绿假单胞菌均为多重耐药茵，对头孢哌酮／舒巴坦的耐药率较低，未发现产金属酶菌株，仅22株菌株扩增出OprD2基因。结论：头孢哌酮／舒巴坦可作为本地区临床治疗耐亚胺培南铜绿假单胞茵所致感染的首选经验用药，OprDa表达减少或不表达可能是临床分离铜绿假单胞茵对亚胺培南耐药的主要机制。     

TNF及铜绿假单胞菌刺激呼吸道上皮细胞表达NOD2蛋白

目的：通过对TNF及铜绿假单胞菌（PAO1）刺激肺上皮细胞株（A549）表达胞浆蛋白NOD2的研究,进一步了解NOD2在机体天然免疫病原体识别过程中的作用。方法：培养呼吸道肺癌上皮细胞株A549,以TNF、铜绿假单胞菌PAO1刺激细胞,并以未刺激组做对照,通过半定量RT-PCR技术观察胞浆蛋白NOD2的表达变化。结果：与未刺激组比较,TNF、铜绿假单胞菌PAOI都能够上调A549细胞NOD2蛋白的表达。结论：TNFα与铜绿假单胞菌PAO1刺激能增强A549细胞胞装蛋白NOD2的表达,提示细胞内受体NOD2在呼吸道天然免疫病原体识别过程中可能起重要作用。     

抗铜绿假单胞菌外膜蛋白F单克隆抗体制备及夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗铜绿假单胞菌外膜蛋白F(OprF)的单克隆抗体(mAb),并建立双mAb夹心ELISA检测方法。方法:利用分子生物学方法克隆OprF基因,诱导表达并纯化OprF。用OprF免疫BALB/c小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb,并用ELISA法测定mAb的免疫活性;建立检测铜绿假单胞菌的双mAb夹心ELISA方法,并对其敏感性、特异性进行初步评价。结果:成功地克隆OprF基因,经诱导表达获得铜绿假单胞菌的OprF。通过杂交瘤技术筛选出4株mAb:6D8F7、2H2B6、3C2F5和7B5D9,经鉴定mAb 6D8F7可作为捕获抗体,mAb 7B5D9被HRP标记后可作为检测抗体,以这2株mAb建立的双mAb夹心ELISA方法重复性好、特异性强,敏感性高达到1×103集落形成单位(CFU/mL)。检测的线性范围为1×103～108CFU/mL。与传统的细菌分离方法比较,检测临床标本的符合率高达94.7%。结论:通过杂交瘤技术制备抗铜绿假单胞菌OprF的mAb,并建立了高特异性、高敏感性检测铜绿假单胞菌抗原的双mAb夹心ELISA方法,可用于临床检测铜绿假单胞菌的感染。     

10-23脱氧核酶抑制铜绿假单胞菌耐药基因VIM2作用的初步研究

目的 探讨10-23脱氧核酶(DRz)抑制铜绿假单胞菌耐药基因VIM2的表达及其在逆转铜绿假单胞菌耐药中的作用.方法 根据计算机模拟的 VIM2 mRNA 的二级结构设计合成 5 条VIM2特异的10-23DRz(DRz1～DRz5),在无细胞反应体系中鉴定10-23DRz对VIM2 mRNA的切割活性后,将其导入铜绿假单胞菌,利用E-test法检测亚胺培南对处理前后铜绿假单胞菌的MIC值.结果 DRz3、DRz4和DRz5在无细胞反应体系中可对VIM2 mRNA进行有效切割,且其活性具有高度特异性.与对照相比,1O-23DRz可以降低亚胺培南对铜绿假单胞菌的MIC值.结论 实验中所设计的10-23DRz能在细胞外高效特异性的切割VIM2 mRNA;在细胞内能协同业胺培南抑制铜绿假单胞菌耐药.