套式PCR扩增特定SSUrDNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的：用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸（SSUrDNA）基因为靶基因,选用1对疟原属特异性引物,建立套式PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果：从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp,102bp和115bp预测大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为100％,并查出镜检漏诊的2例P.v.和P.m.的混合感染及1例P.v.、P.F.和P.m.的混合感染病例,结论本系统特异、灵敏,稳定、简便,可在诊断疟疾的同时判定混合感染,故对疟疾的诊断,大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的　采用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。　方法　采用已建立的套式 PCR系统扩增 SSU r DNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的 6份血样 ,并设阳性与阴性对照。　结果　间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 10 4 bp、10 2 bp和 115 bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫 DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。 6份血样中检出 4份 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染 ,1份 P.v.和 P.f .及 1份 P.f .和 P.m.的混合感染。　结论　该系统特异、灵敏、稳定 ,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染 ,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究

根据间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）小亚单位核糖体核糖核酸（ＳＳｒＲＮＡ）基因序列，设计并合成两对特异引物，采用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出一条长１２０个碱基对（ｂｐ）的间日疟原虫ＳＳｒＲＮＡ基因特定片段，并用于云南间日疟患者的血样检测。结果表明：该系统特异性强，除间日疟原虫外，恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）、三日疟原虫（Ｐ．ｍ．）及正常人血ＤＮＡ样本均无此扩增带出现。该系统检测原虫的敏感度为０．１个疟原虫／ｌμｌ血，大大高于常规镜检。在进行间日疟检测中，该系统与镜检的阳性符合率为１００％，更重要的是发现镜检漏诊的４例Ｐ．ｖ．和Ｐ．ｆ．的混合感染病例。鉴于该系统具有特异、敏感、稳定、简便的特点和鉴别疟原虫种类、判定混合感染等优点，故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控具有应用价值     

巢式PCR扩增SSU rRNA基因确诊1例三日疟原虫感染

目的 通过巢式PCR扩增18SSU rRNA基因片段确诊三日疟原虫的感染,减少三日疟的漏诊和误诊.方法 采用18SSU rRNA基因片段,通过巢式PCR方法,用镜检确诊的间日疟和恶性疟滤纸血样本进行对照,检测1例可疑疟疾患者滤纸血样本.结果 通过种间特异性引物的巢式PCR扩增后,间日疟及恶性疟确诊样本均扩增出相应的12...     

套式PCR扩增特定SSUrDNA片段诊断恶性疟的研究

设计2对针对恶性疟原虫（P．f.）小亚单位核糖体核糖核酸基因（SSUrDNA）的特异引物，采用双温度点套式聚合酶链式反应（PCR）技术，从用煮沸法快速萃取的样本DNA中，扩增P．f.SSUrDNA片段，进行恶性疟原虫的检测。结果表明，该系统扩增样本DNA片段大小恒定，经限制性酶切进一步分析，证实均为P．f.SSUrDNA目的片段，其检测原虫的灵敏度为0．8×10-6，较常规镜检敏感，并具有鉴别红内期早期阶段疟原虫种类和确认有无混合感染的潜力。因而认为该系统是灵敏、准确、简易、快速的疟疾诊断新方法，值得推广使用。     

套式PCR检测滤纸干血滴中恶性疟原虫的研究

目的：建立简易、实用的套式ＰＣＲ检测恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）的方法。方法：以小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）为目的片段的双温度点套式ＰＣＲ扩增滤纸干血滴中Ｐ．ｆ．ＤＮＡ，并将结果与镜检法进行比较研究。结果：１４３例标本中两法均阳性和均阴性分别有５５份和５１份，镜检阴性而ＰＣＲ阳性者３４份，镜检阳性而ＰＣＲ法阴性３份。套式ＰＣＲ总阳性率为６２％，显著高于镜检法的４１％，两者符合率为７４％。结论：本法简便、快速，敏感性高、特异性强，具有一定的现场应用价值。     

套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究

目的：采用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法：采用已建立的套式PCR系统扩增SSUrDNA特定片段检测云南金县恶性疟镜检阳性患者的6份血样，并设阳性与阴性对照。结果：间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104bp、102bp和115bp预期大小的特定扩增带。正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带。6份血样中检出4份p.v.、p.f.和p.m.的混合感染1份p.v.和p.f.及1份p.f.和p.m.的混合感染。结论：该系统特异、灵敏、稳定，在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染，对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值。     

恶性疟原虫SSUrDNA特定片段的体外扩增及鉴定

根据已知疟原虫、其它寄生人体原虫及人的小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）编码区序列，借助计算机核酸序列软件分析，设计出一对用于恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）ＳＳＵｒＤＮＡ特定片段扩增的引物。采用双温度点聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，从我国Ｐ．ｆ．ＦＣＣ／ＹＮ茅芽株红内期基因组ＤＮＡ中，扩增出约５７０个碱基对（ｂｐ）的ＤＮＡ片段，与预期长度相符；而间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）、利什曼原虫（Ｌ．ｄ．）、弓形虫（Ｔ．ｇ．）及人白细胞ＤＮＡ样本均无此扩增带出现。扩增片段经限制性内切酶消化和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交分析，证实为Ｐ．ｆ．ＳＳＵｒＤＮＡ目的片段。     

套式聚合酶链式反应诊断恶性疟原虫及混合感染的研究

为了建立一种特异、敏感、简便的疟疾诊断方法,设计并合成两对针对恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）小亚单位核糖体核糖核酸（ＳＳＵｒＲＮＡ）基因特异的引物,采用套式聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术,扩增恶性疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ基因特定片段。利用该系统诊断云南及海南疟疾患者血样,并随机选取扩增产物进行克隆测序鉴定。结果显示,恶性疟原虫模板均扩增出长度为２０５ｂｐ的特定基因片段,经Ｔ－载体克隆测序与恶性疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ特定基因片段序列完全符合。该系统特异性强,除恶性疟原虫外,间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）、三日疟原虫（Ｐ．ｍ．）、卵形疟原虫（Ｐ．ｏ．）、正常人血ＤＮＡ样本及空白对照均无此扩增带出现。该系统检测原虫的敏感度为１．５个原虫／μｌ,大大高于常规镜检。６１份Ｐ．ｆ．镜检阳性标本在进行ＰＣＲ检测时亦均呈阳性,同时联合应用套式ＰＣＲ扩增间日疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ特定基因片段的检测系统,发现６１例恶性疟病人中２３例是Ｐ．ｆ．和Ｐ．ｖ．混合感染。该检测系统具有特异、敏感、稳定、简便的特点,对疟疾的诊断、混合感染的判定具有一定的临床应用价值     

套式PCR法检测间日疟原虫的研究

以滤纸采集间日疟原虫患者血样，煮沸法萃取ＤＮＡ模板，用间日疟原虫ＳＳＵｒＤＮＡ特异序列为内外引物，进行双温度点套式ＰＣＲ扩增，其检测原虫率水平为０．８４×１０＾－６，特异性强。检测云南疟区发热患者血样１６６份，检出率为６３．９％，显著高于镜检法的４８．２％。以镜检法为参照，本法的敏感性为９７％，特异性为６１％，阳性预期值和阴性预期值分别为６５％和９７％，表明是检测间日疟原虫感染的一个良好手段，可作     

云南省间日疟原虫SSUrRNA基因片段的体外扩增、克隆及序列分析

根据已知间日疟原虫、其它相关原虫及人小亚单位核糖体核糖核酸(SSUrRNA)基因序列,借助计算机程序分析,设计一对寡聚核苷酸引物。采用聚合酶链式反应(PCR)技术,从云南省两例间日疟患者血样DNA抽提物中,均扩增出长约641个碱基对(bp)的SSUrRNA基因特定片段;双脱氧链末端终止法测序结果表明,两份样本扩增片段DNA序列完全相同,但与背景序列比较,在第269位出现碱基置换由G变为A,而在第630位则缺失一碱基C,从而导致该两处限制性内切酶位点的改变。     

疟疾病人血样中特异性乳酸脱氢酶检测的研究

应用直接电泳法和多克隆抗体捕捉法检测恶性疟和间日疟病人血样各４０份，正常对照血样２０份中恶性疟原虫特异性乳酸脱氢酶（ＬＤＨ－ｐ）。结果表明，两种方法检测恶性疟病人血样的阳性率分别为９０％和９５％；而间日疟和正常人血样中皆未检出ＬＤＨ－ｐ的活性。结果还表明，蛋白酶抑制剂可有效地保护ＬＤＨ－ｐ，而反复冻融则可使ＬＤＨ－ｐ受到破坏，检出率降低。应用直接电泳法和多克隆抗体捕捉法，在蛋白酶抑制剂存在的条件下，检测新鲜血样中ＬＤＨ－ｐ是诊断恶性疟的理想方法。     

PCR检测Pf60.1基因诊断恶性疟实验方法研究

为探讨通过PCR技术检测Pf60.1基因来诊断恶性疟的可行性,采用PCR技术检测了4年前采集贮存的20例疑似疟疾病人的血样。阳性对照为恶性疟原虫FCC1／HN培养株;阴性对照为食蟹猴疟原虫、间日疟原虫及非疟区的正常供血员血样。结果为FCC1／HN株、12例镜检定为恶性疟和2例混合感染的血样扩增出长度为313bp～320bp的特定Pf60.1基因片段;而阴性对照均未产生DNA带型。此结果说明检测Pf60kD中的Pf60.1基因片段的方法稳定性好,特异性强和敏感性高,是恶性疟诊断的理想方法之一。     

PCR扩增环子孢子蛋白基因3’ 端片段用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 :建立 PCR检测恶性疟原虫的新方法。方法 :作者采用自行设计并合成的一对恶性疟原虫特异引物 ,经 PCR扩增环子孢子蛋白 ( CSP)基因 3 端保守区序列 2 4 5bp片段 ,观察了它的特异性、敏感性和稳定性。结果 :1从 4株培养的恶性疟原虫和 2例恶性疟患者血样中均扩增出约 2 4 5bp的 DNA目的片段 ,用业已鉴定的 CSP基因序列作模板再行扩增证实其为恶性疟原虫CSP基因片段 ;2对间日疟原虫、利什曼原虫、弓形虫和健康人血样进行 PCR反应 ,均未见扩增条带 ;3本检测系统可检出恶性疟原虫感染血样中 0 .18个原虫所含的 DNA模板 ;4采用不同方法制备模板及不同反应方式均能获得满意结果 ;结论 :PCR扩增恶性疟原虫 CSP基因 3端片段用于恶性疟原虫检测具有灵敏、高度特异且稳定性好等优点。     

PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究

目的 :在同一反应体系中建立能鉴别诊断间日疟与恶性疟的 PCR检测方法。方法 :根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 3个引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,在同一反应体系中 ,间日疟原虫和恶性疟原虫分别预期被扩增出 34 1bp和 4 31bp的 DNA条带。结果 :间日疟原虫和恶性疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小的 DNA片段 ,并经限制性酶切证实 ;杜氏利什曼原虫、弓形虫、健康人血及空白对照均无特异性扩增条带 ;以该检测体系至少可检出原虫血症为 2 .56× 10 ^-7间日疟原虫感染和 1.0 8× 10 ^-5恶性疟原虫感染 ;69份镜检阳性的间日疟和 2份恶性疟患者血样 PCR检测均为阳性 ,1例发热待查患者PCR诊断为间日疟 ,与镜检复查结果一致 ,所有疟疾阳性标本中未检出混合感染 ,2 0份健康人血 PCR均为阴性。结论 :该检测体系灵敏、特异 ,对于诊断间日疟和恶性疟以及鉴别间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有一定的应用价值。