野三七鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达

目的:对野三七中可能参与三萜皂苷合成的关键酶鲨烯环氧酶基因(Pvf SE)进行克隆,并对其进行生物信息学分析和原核表达。方法:采用Trizol法提取野三七根的总RNA并反转录为c DNA第一链,基于野三七的转录组数据,设计Pvf SE基因序列特异性引物,克隆基因全长,利用相关软件对该基因进行生物信息学分析,构建p Mal-c2X-Pvf SE原核表达载体,在大肠埃希菌中诱导表达重组蛋白。结果:Pvf SE开放阅读框为1 887 bp,编码628个氨基酸,蛋白相对分子质量为68. 8 k Da,理论等电点为9. 28,脂肪系数为95. 18,亲水性系数为-0. 060,不稳定指数为40. 36,属于不稳定蛋白。生物信息学分析表明,Pvf SE具有2个跨膜结构域,无信号肽,可能定位在叶绿体或细胞质膜上,具有FAD/NAD(P)结合域和鲨烯环氧酶结构域,属于混合型蛋白。Pvf SE与西葫芦和芒柄花中参与三萜皂苷合成的鲨烯环化酶(Cp SE1,Cp SE3,Os SE1,Os SE2)亲缘关系较近。此外,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达Pvf SE的重组蛋白。结论:克隆得到Pvf SE基因,并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白,为进一步研究Pvf SE的功能和解析野三七中三萜皂苷生物合成途径奠定了基础。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。     

牛樟芝鲨烯环氧酶基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆牛樟芝三萜合成途径中鲨烯环氧酶基因(AcSE),并进行生物信息学和表达差异分析。方法以牛樟芝菌丝体cDNA为模板,利用快速末端扩增(RACE)进行AcSE序列扩增,利用生物信息学分析AcSE基因的理化性质并预测其蛋白二级结构、三级结构及其功能;同时利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)测定不同培养时间的液体牛樟芝菌丝体及子实体中AcSE基因的表达情况。结果 AcSE的cDNA全长1 446 bp(Gen Bank编号:KT070558),编码481个氨基酸,相对分子质量为53 300,等电点为6.36。结构域分析表明AcSE内含3个跨膜的结构域,无卷曲螺旋结构,且疏水区和亲水区交替存在。AcSE的g DNA全长为1 607 bp,含4个外显子和3个内含子。AcSE在液体培养7 d的牛樟芝菌丝体中表达量最高,为子实体的7.89倍,且随着培养时间的延长逐渐下降。结论首次从牛樟芝中克隆了AcSE基因,为进一步阐明该基因在牛樟芝三萜合成途径中的作用奠定基础。     

药用植物鲨烯环氧酶基因研究进展

鲨烯环氧酶在角鲨烯合成2,3-氧化鲨烯的过程中起催化作用,继而影响以2,3-氧化鲨烯为前体的三萜皂苷、甾体皂苷等药用植物次生代谢产物的生物合成。鲨烯环氧酶被认为是萜类、甾醇类物质生物合成途径中的关键酶,已在多种药用植物中被广泛研究。概述鲨烯环氧酶基因的克隆提取材料与生物信息学分析、组织特异性与茉莉酸甲酯（MeJA）诱导调控、亚细胞定位、基因功能分析几个方面的研究进展。     

茯苓鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析

目的：从茯苓中克隆参与茯苓三萜合成路径中的潜在关键限速酶鲨烯环氧酶（SE）,并对其进行生物信息学及表达分析。方法：采用试剂盒提取总RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,以cDNA为模板,进行SE基因的克隆,对该基因进行生物信息学分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检查茯苓鲨烯环氧酶基因（PcSE）在茯苓神舟10号、湘靖28、5.78菌株中的表达。结果：PcSE的基因全长为1 571 bp,包含4个外显子,3个内含子。获得编码区域（CDS）序列长为1 413 bp,编码470个氨基酸。该蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,有2个跨膜结构域,具有FAD/NAD(P)结合域和鲨烯环氧酶结构域,定位于线粒体或质膜上。与多孔菌科真菌的同源序列比对一致性为80.92%;系统进化树显示PcSE蛋白与美国茯苓的亲缘关系最近。Real-time PCR结果显示,PcSE基因在3个菌株中均有表达,在5.78菌株中的表达量最高,3个菌株的PcSE表达差异不存在统计学意义。结论：首次从茯苓中克隆并分析茯苓PcSE基因,为进一步研究茯苓PcSE的功能及解析茯苓三萜生物合成途径提供了基础...     

太子参鲨烯环氧酶基因的克隆及其表达分析

目的对太子参三萜类皂苷生物合成关键调控酶鲨烯环氧酶1(SQE1)基因进行全长c DNA克隆和功能分析。方法基于其他植物SQE基因的同源序列设计简并引物,以太子参块根总RNA为模板,RT-PCR结合RACE技术克隆太子参SQE1基因的全长c DNA,并进行生物信息学分析。利用农杆菌叶盘转化法将SQE1基因转化烟草,研究其对烟草总三萜量的影响。结果获得太子参SQE1基因全长c DNA序列2 038 bp,该序列包含1 554 bp的开放阅读框,编码517个氨基酸,相对分子质量为5.67×104,等电点为8.8,与其他药用植物的SQE蛋白具有较高的同源性,含有FAD结合结构域和4个跨膜区域,转太子参SQE1基因的烟草的总三萜量明显高于非转基因植株。结论首次克隆获得太子参SQE1基因的全长c DNA,该基因的异源表达可一定程度提高转基因植物的总三萜量,为阐明与应用太子参三萜类成分生物合成途径提供科学依据。     

金铁锁鲨烯环氧酶基因的克隆与表达北大核心CSCD

目的:从金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法:在转录组数据分析的基础上,利用RTPCR方法获得金铁锁SE基因的两个克隆的全长c DNA序列及进行生物信息学分析;并进行Real-time PCR实验,测定SE在不同组织中的表达量。结果:得到2条SE c DNA,SE-1全长1 642 bp,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸;SE-2全长1 552 bp,开放阅读框1 446 bp,编码481个氨基酸;构建了p EASY-E1-SE-1及p EASY-E1-SE-2重组质粒,获得稳定的原核表达体系,SDS-PAGE结果表明所表达的蛋白与预测的蛋白大小一致。Real-time PCR结果表明SE-1、SE-2基因在根中的表达量均高于茎和叶。结论:从金铁锁中成功克隆了SE基因,可为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关建酶表达模式奠定基础。     

刺五加鲨烯环氧酶基因cDNA的克隆及序列分析

目的:对刺五加鲨烯环氧酶基因的cDNA进行克隆及序列分析。方法:采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参SE基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SE基因的cDNA序列。结果:克隆了2个序列不同的cDNA(SE1和SE2),开放阅读框分别长1 665,1 629 bp,分别编码554,542个氨基酸。SE1,SE2间的核苷酸和氨基酸一致性分别为91.49%,92.55%,两者与三七SE1的氨基酸序列相似性最高,分别为93.45%,94.87%。SE1,SE2均含有1个FAD结合区域,SE1,SE2推测的氨基酸分别存在2个和4个跨膜螺旋。结论:首次分离并报道了刺五加的2个SE基因cDNA序列,为刺五加的次生代谢工程研究奠定了基础。     

桑黄鲨烯环氧酶基因原核表达及过表达载体的构建

目的构建桑黄三萜生物合成途径中的关键酶——鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因的原核表达和过表达载体。方法将克隆到的桑黄SE基因构建到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),使用异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达2~10 h后,通过SDS-PAGE进行检测。根据Gen Bank中提交的香菇3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子序列设计引物,利用PCR技术克隆获得香菇gpd启动子片段,以植物双元表达载体p CAMBIA1301为基础载体,通过酶切、连接等方法将其中的35 S启动子替换为香菇gpd启动子,再将SE基因编码区序列构建到gpd启动子下游,构建桑黄SE基因的过表达载体。结果成功构建了SE基因的原核表达载体p ET-32a-SE,SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约为55 000,与预测的蛋白相对分子质量基本一致。PCR检测、酶切鉴定和测序分析可知,成功构建了适宜食用菌遗传转化的中间载体p CAMBIA1301-gpd-gpd及SE基因的过表达载体p CAMBIA1301-gpd-gpd-SE。结论为后期研究SE基因在桑黄三萜生物合成方面所发挥的功能奠定基础。     

桑黄鲨烯环氧酶基因克隆与序列分析

目的对参与桑黄三萜合成途径的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)进行基因全长克隆和生物信息学分析。方法以桑黄总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆桑黄SE基因的全长c DNA和DNA序列,并通过Ex PASy在线分析等方法对其进行生物信息学分析。结果序列分析表明,SE基因全长2 145 bp,包含6个外显子和5个内含子;所克隆的c DNA全长为1 856 bp,包含1个1 452 bp的开放阅读框,编码483个氨基酸的蛋白,命名为Ib SE1,预测该蛋白的相对分子质量为5.3×104,等电点(p I)为8.41,无信号肽。结论首次克隆并获得桑黄鲨烯环氧酶基因全长序列,为进一步阐明桑黄三萜代谢途径和改善中药材品质奠定基础。     

人参中核黄素激酶基因的克隆与原核表达

目的从人参中克隆出核黄素激酶基因,进行相关的生物信息学分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌诱导表达。方法根据人参转录组数据库筛选出序列comp61599_c0_seq12,经相关软件对其进行序列分析;该序列3’末端缺失,利用3’RACE技术获得3’端序列;通过PCR技术获得人参核黄素激酶基因的全长c DNA序列,并构建原核表达载体p ET-32a-Pg RFK,通过热激法转化到大肠杆菌BL-21中进行诱导表达。结果从人参中成功克隆出1条长度为1 200 bp的核黄素激酶基因,其编码399个氨基酸,同时成功构建该基因的原核表达载体,SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白大小与预测蛋白相对分子质量一致。结论成功克隆了人参核黄素激酶基因,并在大肠杆菌中成功表达。     

基于稳定同位素技术的竹节参产地识别研究

目的 利用稳定同位素质谱测定6个产区的竹节参Panax Japonicus中碳、氮、氢、氧4种同位素比率。方法 采用基于机器学习分类器的线性判别法（LD）,高斯核支持向量机（SVM）和基于神经网络工具箱的模式识别反向传播学习算法（BPN）对竹节参的产地进行判别。结果 结果表明,稳定同位素碳（d¹³C）具有明显的地域特征,可有效地区分竹节参产地;LD法和BPN法均能区分6个产地的竹节参,判定准确率均达100%。结论 基于稳定同位素技术并结合LD和BPN法能有效进行竹节参的产地溯源。     

珍稀药用植物珠子参的转录组测序及分析

药用植物珠子参的根茎在中国西南区域已有上千年的药用历史,三萜皂苷为珠子参最主要的活性成分。为了探索珠子参根茎中皂苷物质生物合成的分子基础,该文采用Illumina HiSeq 2000高通量测序获得珠子参根茎的转录组数据;使用Trinity和TGICL软件实现Unigene的de novo拼接;基于BLAST完成Unigene的蛋白功能注释、KOG功能注释、GO分类和KEGG代谢通路分析。最终获得了短读序15.6 Gb,通过de novo拼接注释得到Unigene 62 240个。研究发现,珠子参根茎部表达的19个Unigene与三萜碳环骨架合成相关;69个Unigene与介导三萜碳环骨架的氧化和羟基化等修饰的CYP450相关,18个Unigene与负责三萜碳环骨架的糖基化的糖基化转移酶相关。该研究发现的三萜皂苷合成相关候选基因对于阐明珠子参三萜皂苷合成方式研究提供了重要的基础。     

藏药川西獐牙菜中SmMK基因的克隆及生物信息分析

目的了解川西獐牙菜Swertia mussotii Franch甲羟戊酸途径中的关键酶甲羟戊酸激酶基因(MK)的功能,并进一步推进川西獐牙菜中的甲羟戊酸途径的研究。方法根据川西獐牙菜的转录组信息,获得了川西獐牙菜MK(SmMK)基因的全长c DNA序列,并且设计了特异性引物,利用RT-PCR对该基因进行了克隆;利用生物信息学方法,对Sm MK基因的序列进行分析;构建原核表达载体MBP-SmMK,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,然后对Sm MK基因进行了原核表达,并对其进行了纯化。结果 Sm MK基因cDNA全长为1 164 bp,共编码387个氨基酸。SmMK与其他植物中的MK具有较高相似性。对其信号肽、跨膜区域、蛋白定位及二级结构和三维构象进行了预测分析。SDS-PAGE检测表明所纯化蛋白与预期蛋白的大小相一致,为40970。结论为进一步研究川西獐牙菜中MK的功能奠定了基础,并为进一步研究川西獐牙菜中的甲羟戊酸途径,提高川西獐牙菜中类异戊二烯化合物的产量提供了依据。     

基于ITS2序列的人参及同属易混品西洋参种子的分子鉴定

目的基于DNA条形码技术建立人参与西洋参种子的分子鉴别方法。方法采用生药鉴定方法研究其性状、显微特征,并结合DNA条形码技术,基于中药材DNA条形码数据库,通过ITS2序列比对、遗传距离比较和构建临接(NJ)系统发育树,对人参与西洋参的种子进行鉴别研究。结果人参与西洋参种子的种内遗传距离分别小于种间遗传距离,系统发育树图中各物种均聚为一支,来自9个产地的42份人参及西洋参的种子均为正品,且容易区分。结论基于ITS2序列DNA条形码技术可以快速、准确、有效地鉴别人参与西洋参种质资源。     

人参质体ATP/ADP转运蛋白基因PgAATP1的克隆及表达分析

目的克隆人参Panax ginseng中质体ATP/ADP转运蛋白基因(ATP/ADP transporter protein,AATP),为深入研究其在人参中的生物学功能奠定基础。方法利用人参14个组织部位转录组测序的转录组数据库,通过与NCBI下载的其他植物中AATP的m RNA序列进行本地Blast比对,从中筛选出质体ATP/ADP转运蛋白基因。利用PCR技术克隆获得该基因的全长,通过生物信息学软件分析该基因编码蛋白的信息。利用人参14个组织部位的转录组数据库分析该基因在人参不同组织中的表达模式,并利用实时荧光定量PCR检测茉莉酸甲酯处理条件下该基因的表达模式。结果获得人参AATP1基因全长c DNA,命名为Pg AATP1,该基因长度为1 866 bp,编码621个氨基酸,蛋白质相对分子质量为67 897.23,等电点为9.58。该蛋白与其他物种中的质体ATP/ADP转运蛋白比较类似,分析发现Pg AATP1在人参中所有组织中表达量均比较高,在果肉和叶片中表达量最高。实时荧光定量PCR检测发现Pg AATP1基因在茉莉酸甲酯处理条件下表达持续上调。结论获得Pg AATP1基因全长cDNA序列,该基因在淀粉合成旺盛的组织中表达量较高,且响应茉莉酸甲酯处理。     

降解组测序技术对人参miRNA靶基因的分析鉴定

目的分析鉴定人参miRNA靶基因。方法采用降解组测序技术对石柱参(Shizhu ginseng)、园参(Yuan ginseng)的miRNA及靶基因进行检测;利用公共数据库KEGG/NR/GO数据库对降解组基因进行功能注释;通过荧光实时定量PCR(q RT-PCR)技术验证石柱参、园参的miRNA及靶基因表达量。结果共得到8个miRNA家族的13个靶基因;利用KEGG/NR/GO数据库分析发现该miRNA的靶基因类型主要是转录因子、应答因子及信号转导通路等。对5个差异表达mi RNAs:aqc-miR-159、bdi-miR162、cpa-miR319、pgi-miR4376、smo-mi R396及其靶基因进行的q RT-PCR验证结果与降解组测序结果一致。结论明确了部分人参miRNA的靶基因,为进一步研究人参miRNA的可能功能奠定基础。     

三七中花色苷合成结构基因的克隆及表达分析

目的克隆三七Panax notoginseng的花色苷合成结构基因(anthocyanin biosynthesis structural genes,ABSG),研究ABSG的表达模式及其与相关表型的关联性。方法利用RT-PCR技术克隆三七ABSG,进行生物信息学和表达模式分析;使用pH示差法分析三七紫根的花色苷含量,并通过qRT-PCR技术进行相关结构基因的关联性研究。结果克隆获得6类共8个三七ABSG,其开放阅读框(open reading frame,ORF)长度在600～1500 bp,均含有花色苷生物合成相关的保守结构域。进化树分析显示,8个基因被分为5个分支,且与其他物种有较高的同源性。顺式作用元件分析表明,三七ABSG启动子序列中含有多种元件,其中光响应和转录因子类元件的数量最多。表达模式显示,8个基因主要分为在花发育前期阶段(花蕾期)高丰度表达基因和在根部高量表达基因。此外,对三七紫根的分析发现,相比于普通型黄白根,其花色苷含量提高约3倍,PnF3’H1基因和PnUFGT基因表达显著增强,表明它们可能是参与紫根三七中花色苷形成的关键结构基因。结论克隆获得8个三七ABSG,为该类基因的功能机制研究和三七种质创新利用奠定基础。     

竹节参总皂苷通过NLRP1和NLRP3炎症小体途径减轻衰老大鼠神经细胞凋亡的作用研究

目的基于核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(NLRP1)和NLRP3炎症小体途径探讨竹节参总皂苷(SPJ)减轻衰老大鼠神经细胞凋亡的作用。方法以自然衰老大鼠为研究对象,将SPF级SD雄性大鼠随机分为对照组(9月龄)、模型组(24月龄)和SPJ低、中、高剂量组,从18月龄开始,SPJ低、中、高剂量组分别ig给予SPJ 10、30、60 mg/kg,衰老模型组ig等量生理盐水,给药至24月龄,每周停药2 d,持续给药6个月。TUNEL法检测衰老大鼠皮层和海马区神经细胞凋亡情况,Western blotting法检测衰老大鼠皮层和海马区白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-18、凋亡相关微粒蛋白(ASC)、NLRP1、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)表达量的变化。结果 TUNEL实验结果显示,对照组中仅见极少数凋亡细胞;与对照组相比,模型组中凋亡细胞数明显增加。与模型组相比,SPJ组大鼠大脑皮层和海马CA1、CA3、DG区凋亡细胞数明显下降。Western blotting结果表明,大鼠大脑皮层和海马组织中IL-1β、ASC、NLRP3、NLRP1、Caspase-1、IL-18的蛋白表达水平均随着年龄的增长而逐渐上调;给药6个月后,SPJ各剂量组均能下调IL-1β、IL-18、ASC、NLRP3、NLRP1、Caspase-1蛋白的表达水平。结论 SPJ对衰老大鼠脑组织(皮层和海马)神经元损伤具有保护作用,其机制可能与其调节NLRP1和NLRP3炎症小体途径,从而减轻炎症反应有关。