PI3K/Akt信号通路在异丙酚后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的 评价磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路在异丙酚后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用.方法 体外培养SD乳鼠心肌细胞,接种于96孔板(细胞密度1×105/ml,200 μl/孔)或6孔板(细胞密度5×105/ml,2 ml/孔)中,采用随机数字表法,将细胞随机分为4组(n=24):常规培养组(C组)细胞常规培养6h;缺氧复氧组(H/R组)细胞行缺氧2h,复氧4h;缺氧复氧+异丙酚组(H/R+P组)于缺氧结束时行异丙酚(终浓度50 μmol/L)后处理;H/R+异丙酚+ PI3K抑制剂组(H/R+ P+W组)于缺氧结束时加入PI3K抑制剂渥曼青霉素(终浓度100nmol/L)和异丙酚(终浓度为50μmol/L).复氧结束时,采用MTT法测定细胞活力,应用生化自动分析仪测定培养液LDH活性;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blot法检测心肌细胞磷酸化Akt(p-Akt)、Bcl-2及Bax表达水平.结果 与C组相比,H/R组细胞活力降低,LDH活性和细胞凋亡率升高,p-Akt和Bax表达上调,Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax降低(P＜0.05).与H/R组比较,H/R+P组细胞活力升高,LDH活性和细胞凋亡率降低,p-Akt和Bcl-2表达上调,Bax表达下调,Bcl-2/Bax升高(P＜0.05).与H/R+P组比较,H/R+ P+W组细胞活力降低,LDH活性和细胞凋亡率升高,p-Akt和Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax降低(P＜0.05).结论 异丙酚后处理减轻心肌细胞缺氧复氧损伤的机制与激活PI3K/Akt信号通路有关.     

肾上腺髓质素对缺氧复氧诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨肾上腺髓质素(ADM)对缺氧复氧(HR)诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡的影响及其机制.方法 体外培养的NRK-52E细胞,随机分为4组:正常对照组、HR组、空质粒+HR组、ADM质粒+HR组.采用Fugene HD转染试剂,将pcDNA3.1-myc-his B空质粒和ADM真核表达质粒分别转染至NRK-52E细胞内,应用免疫细胞化学的方法检测转染效率,转染成功48 h后制作HR模型.锥虫蓝摄取法进行细胞计数并计算细胞存活率,分光光度法检测上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量评价细胞活力;Annexin V和PI染色结合流式细胞仪技术检测细胞凋亡率;RT-PCR法检测ADM、Bax、Bcl-2、Fas的mRNA表达;Western印迹法检测活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8、9(Caspase-3、8、9)的蛋白表达.结果 HR组ADM的表达显著高于正常对照组(P＜0.05).ADM质粒+HR组的ADM表达显著高于空质粒+ HR组(P＜0.05).与正常对照组相比,HR组活细胞计数和细胞存活率显著降低,LDH含量及细胞凋亡率显著升高,Bax、Bcl-2、Fas、活性Caspase-3、8、9表达显著上调,Bax上调更明显,故Bax/Bcl-2升高(均P＜0.05).与HR组相比,ADM质粒+HR组活细胞计数和细胞存活率显著升高,LDH含量及细胞凋亡率显著降低,Bax、Fas、活性Caspase-3、8、9表达显著下调,Bcl-2表达进一步上调,Bax/Bcl-2降低(均P＜0.05).空质粒+HR组和HR组比较,上述各指标差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 ADM在NRK-52E细胞中的高表达可以减轻HR诱导的细胞凋亡,其机制至少部分是通过抑制线粒体通路和死亡受体通路实现的.     

PI3K/Akt信号转导通路在二氮嗪预处理减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中的作用

目的 探讨PDK/Akt信号转导通路在二氮嗪预处理减轻大鼠海马缺氧复氧损伤中的作用.方法 新生SD大鼠,出生时间<24 h,体重5-6 g,断头取海马组织,胰蛋白酶消化后,将神经元接种于96孔板或直径35 mm培养皿中,培养12 d后,随机分为6组:对照组(C组)、缺氧复氧组(HR组)、二氮嗪100μmol/L预处理组(Dz组)、二氮嗪100 μmol/L预处理+5-羟癸酸100μmol/L预处理组(DZ+HD组)、5-羟癸酸100 μmol/L预处理组(HD组)和二氮嗪100 μmol/L预处理+LY294002 50μmol/L预处理组(Dz+LY组),每组48孔或12皿.C组不给予任何处理,其余5组每天给予相应药物预处理l h,连续3 d,然后缺氧4 h,复氧24 h,测定神经元活力、凋亡率、Akt、Bcl-2和Bax的表达水平.结果 与C组比较,其余各组海马神经元活力降低.凋亡率升高,Akt和Bcl-2和Bax表达上调(P<0.01);与HR组比较.DZ组海马神经元活力升高.凋亡率降低,Altt和Bel-2表达上调,Bax表达下调(P<0.01);与Dz组比较,DZ+HD组、HD组和Dz+LY组海马神经元活力降低,凋亡率升高.Akt和Bel-2表达下调,Bax表达上调(P<0.01).结论 二氮嗪预处理可能通过激活PDK/Akt信号转导通路,上调Bel-2表达,下调Bax表达,抑制神经元凋亡,从而减轻大鼠海马缺氧复氧损伤.     

瘦素预先给药对L02肝细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响

目的 探讨瘦素预先给药对L02肝细胞缺氧复氧时细胞凋亡的影响.方法 L02肝细胞接种于6孔培养板中,孵育24 h后,随机分为6组,每组6孔:对照组(C组)、缺氧复氧组(HR组)和不同浓度瘦素预处理组(L_(1～4)组).HR组于37℃95%N_2-5%CO_2培养箱中缺氧12 h,然后于37℃95%O_2-5%CO_2培养箱中复氧12 h;L_(1～4)组先分别加入瘦素100、200,400和800 μg/L,再进行缺氧复氧.取细胞上清液,采用赖氏法测定谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的浓度;采用Hoechst 33342/PI双染色法测定细胞捌亡情况,计算细胞凋亡率;采用荧光定量PCR法测定Bax mRNA和Bcl-2 mRNA的表达.结果 与C组比较,HR组和L_(1～4)组ALT和AST的浓度升高,早期凋亡率和晚期凋亡率升高,Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表达上调(P<0.01);与HR组比较,L_(1～4)组ALT和AST的浓度下降,早期凋亡率降低,L_3组Bax mRNA表达下调,L_2组和L_3组Bcl-2 mRNA表达上调(P<0.01);L_(1～4)组间ALT和AST的浓度、早期凋亡率和晚期凋亡率、Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 瘦素预先给药可抑制L02肝细胞缺氧复氧时细胞凋亡,其机制与上调肝细胞Bcl-2 mRNA的表达,下调Bax mRNA的表达有关.     

血红素加氧酶-1对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响

目的 探讨血红素加氧酶-1(HO-1)对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响.方法 新生SD大鼠8只,日龄1～3 d,原代培养心肌细胞,随机分为4组:正常对照组(C组)常规培养8 h;缺氧复氧组(HR组)采用缺氧2 h,复氧6 h的方法制备心肌细胞缺氧复氧模型;血晶素组(Hemin组)缺氧前24 h及缺氧即刻,培养基中加入Hemin,终浓度为20 μmol/L;血晶素+锌原卟啉组(Hemin+ZnPP组)缺氧前24 h及缺氧即刻培养基中同时加入Hemin及ZnPP,终浓度均为20 μmol/L.各组细胞均接种于35 mm培养皿(2 ml/皿)或50 ml培养瓶(3 ml/瓶),每组45皿和3瓶.于复氧结束后采用蛋白印迹法测定心肌细胞HO-1表达,台盼蓝染色法测定心肌细胞存活率,应用全自动生化分析仪测定细胞培养液乳酸脱氧酶(LDH)活性,超声破碎细胞离心后取上清,采用硫代巴比妥酸法测定细胞MDA水平,黄嘌呤氧化酶法测定细胞SOD活性.结果 与C组比较,其余3组培养液LDH活性、心肌细胞MDA水平及HO-1表达升高,心肌细胞存活率及SOD活性降低(P＜0.05).与HR组比较,Hemin组培养液LDH活性、心肌细胞MDA水平降低,HO-1表达、心肌细胞存活率及SOD活性升高(P＜0.05),Hemin+ZnPP组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).HR组和Hemin+ZnPP组细胞缺氧复氧损伤明显,Hemin组细胞缺氧复氧损伤减轻.结论 HO-1可减轻乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤.     

二氮嗪后处理对缺氧/复氧成年大鼠心肌细胞存活率及磷酸化糖原合成激酶-3β、Bcl-2和Bax表达的影响

目的 研究线粒体ATP-敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP通道)开放剂二氮嗪(diazoxide,DZ)后处理对成年大鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)后细胞存活及对磷酸化糖原合成激酶-3β(phospho glycogen synthase kinase-3β,pGSK-3β),Bcl-2,Bax表达的影响. 方法 体外培养原代成年大鼠(30只)心肌细胞建立H/R损伤模型,按随机数字表法随机分为5组(每组6只):①Normal组:在二氧化碳(CO2)培养箱中持续培养6h组;②H/R组:缺氧3h复氧3h组;③DZ组:缺氧3h复氧3h,复氧5 min时给予100 μmol/L DZ组;④DZ+5-HD组:缺氧3h复氧3h,缺氧末给予100 μmol/L 5-羟葵酸盐(5-hydroxydecanoate,5-HD),复氧5 min时给予100μmol/L DZ组;⑤5-HD组:缺氧3h复氧3h,缺氧末给予100 μmol/L 5-HD组.复氧3h末通过计数细胞长杆率测定存活率,免疫印迹法测定心肌细胞内pGSK4β,Bcl-2和Bax的表达. 结果 复氧3h末,Normal组单个心肌细胞收缩幅度为(13.12±0.19)％,与Normal组比较,其他各组单个心肌细胞收缩幅度明显降低[H/R组为(7.97±0.22)％,DZ组为(10.48±0.20)％,DZ+5-HD组为(7.97±0.19)％,5-HD组为(8.22±0.22)％](P＞0.05),心肌细胞内Bcl-2表达水平降低,Bax表达水平升高(P＜0.05).DZ后处理组心肌细胞存活率为(64±5)％,与H/R组比较明显增高(P＜0.05),心肌细胞内Bcl-2、pGSK4β表达水平升高,Bax表达水平降低,而缺氧末即刻给予5-HD可以逆转DZ后处理的这些作用(P＜0.05);5-HD组与H/R组比较差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 DZ后处理可能通过激活mitoKATP通道、上调pGSK-3β及Bcl-2,下调Bax的表达增加H/R后成年大鼠心肌细胞的存活.     

PEP-1-血红素加氧酶-1融合蛋白转导对大鼠H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的影响

目的 探讨PEP-1-血红素加氧酶(HO)-1融合蛋白转导对大鼠H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的影响.方法 构建含人HO-1基因的原核表达质粒pETl5b-PEP1-hHO-1,质粒转化后诱导目的 蛋白PEP-1-HO-1表达.用含15%胎牛血清高糖DMEM培养基培养H9c2心肌细胞,随机分为4组(n=4):正常对照组(C组)常规培养;缺氧复氧组(H/R组)细胞缺氧22 h,复氧8 h;低浓度融合蛋白组(L-HO组)缺氧前用终浓度为1.0 μmol/L PEP-1-HO-1融合蛋白孵育细胞;高浓度融合蛋白组(H-HO组)缺氧前即刻用终浓度为2.0 μmol/L PEP-1-HO-1融合蛋白孵育细胞.复氧结束后收集细胞及培养液上清,采用2,4-二硝基苯肼显色法检测培养液乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸比色法检测细胞MDA含量,黄嘌呤氧化酶法检测细胞SOD活性.结果 与C组比较,H/R组、L-HO组、H-HO组心肌细胞SOD活性降低,MDA含量升高,培养液LDH活性升高(P＜0.05);与H/R组比较,L-HO组和H-HO组心肌细胞SOD活性升高,MDA含量降低,培养液LDH活性降低(P＜0.05);与L-HO组比较,H-HO组心肌细胞SOD活性升高,MDA含量降低,培养液LDH活性降低(P＜0.05).结论 PEP-1-HO-1融合蛋白转导入大鼠H9c2心肌细胞可减轻细胞缺氧复氧损伤.     

咪达唑仑对新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧时细胞凋亡的影响

目的 探讨咪达唑仑对新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧时细胞凋亡的影响.方法 分离、培养出生2～4 d的Wistar大鼠心肌细胞,将培养融合的心肌细胞随机分为7组(n=7):正常对照组(C组)、缺氧/复氧组(HR组)、外周型苯二氮革类受体(PBR)拮抗剂PK 11195组(P组)、PBR激动剂Ro 5-4864组(R组)、咪达唑仑组(M组)、PK 11195+Ro 5-4864组(PR组)和PK 11195+咪达唑仑组(PM组).HR组缺氧30 min复氧2 h建立缺氧/复氧模型.P组、R组、M组、PR组、PM组在培养皿中分别加入终浓度为10-4mol/L的PK 11195、Ro 5-4864和咪达唑仑及相应混合药物共同孵育,30 min后行缺氧/复氧.复氧2 h时收集细胞,采用HTC-Annexin V/PI双标法检测细胞凋亡情况,计算细胞凋亡指数(AI);Western blot法测定心肌细胞蛋白激酶C(PKc)表达水平;Meta Flour单细胞内钙测定系统测定细胞内钙离子浓度.结果 与C组比较,其余各组AI升高,除R组外其余各组细胞内钙离子浓度升高,PKC表达下调(P<0.01);与HR组比较,R组AI和细胞内钙离子浓度降低,PKC表达上调,M组和PM组AI降低(P<0.01);与P组比较,R组AI和细胞内钙离子浓度降低,PKC表达上调(P<0.01),PR组、PM组差异无统计学意义(P>0.05);与R组比较,M组、PR组、PM组Al和细胞内钙离子浓度均升高,PKC表达下调(P<0.01).结论 咪达唑仑10-4mol/L可减轻新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧时细胞凋亡,其作用机制可能是非PBR依赖性的,且与细胞内钙离子浓度和PKC表达无关.     

缺氧后处理和二氮嗪后处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧时钙网蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧后处理和二氮嗪后处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧时钙网蛋白(CRT)表达的影响.方法 健康雄性SD大鼠,4～5月龄,分离心肌细胞,培养18 h后,随机分为6组(n=8):对照组(C组)、缺氧复氧组(HR组)、缺氧后处理组(HP组)和二氮嗪后处理组(DP组).C组细胞于5%CO2培养箱内继续培养2 h;HR组细胞于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧45 min,然后于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h;HP组细胞于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧45 min,然后复氧3 min,缺氧3 min,重复3次,再于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h;DP组细胞于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧45 min,然后给予50 μmol/L二氮嗪处理10 min,再于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h.测定心肌细胞caspase-3活性、CRT表达和游离钙离子浓度.结果 与C组比较,其余各组caspase-3活性升高,HP组和DP组CRT表达上调,HR组游离钙离子浓度升高(P＜0.05或0.01);与HR组比较,HP组和DP组caspase-3活性降低,CRT表达上调,游离钙离子浓度降低(P＜0.01).结论 缺氧后处理和二氮嗪后处理可上调CRT的表达,减轻细胞内钙超载,减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤.     

不同浓度七氟醚预处理对大鼠海马神经元缺氧复氧时细胞凋亡的影响及线粒体ATP敏感型钾通道在其中的作用

目的 探讨不同浓度七氟醚预处理对大鼠海马神经元缺氧复氧时细胞凋亡的影响及线粒体ATP敏感型钾通道(mito-KATP通道)在其中的作用.方法 新生(出生＜24 h)SD大鼠,雌雄不拘,体重5～6 g,原代培养海马神经元,接种于培养孔或培养皿中,采用随机数字表法,将其随机分为7组,每组48孔和12皿,正常对照组(C组):不予任何处理;缺氧复氧组(HR组):缺氧4 h复氧24 h;6%七氟醚预处理组(S1 组)、4%七氟醚预处理组(S2 组)、2%七氟醚预处理组(S3 组):分别经6%、4%、2%七氟醚预处理后行缺氧复氧;5-羟葵酸100 μmol/L预处理组(5-HD组):经mito-KATP通道阻断剂5-羟葵酸(终浓度100 μmol/L)预处理后进行缺氧复氧;5-羟葵酸100 μmol/L+6%七氟醚预处理组(5-HD+S组):同时行5-羟葵酸和6%七氟醚预处理后进行缺氧复氧.各组以上处理结束后,测定神经元活力、凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平.结果 与C组比较,其余6组海马神经元活力降低,细胞凋亡率升高,Bcl-2和Bax蛋白表达上调(P＜0.01);与HR组比较,S1组～S3组海马神经元活力增强,细胞凋亡率降低,Bcl-2蛋白表达上调,Bax蛋白表达下调(P＜0.01),5-HD组和5-HD+S组上述指标比较差异无统计学意义(P＞0.05);与S1组比较,S2组、S3组和5-HD+S组海马神经元活力降低,细胞凋亡率升高,Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调(P＜0.01);与S2组比较,S3组海马神经元活力降低,细胞凋亡率升高,Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调(P＜0.01).结论 七氟醚预处理可抑制大鼠海马神经元缺氧复氧时细胞凋亡,从而减轻神经元损伤,且呈浓度依赖性,机制可能与开放神经元mito-KATP通道,上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达有关.

Abstract：

Objective To investigate the effect of preconditioning with different concentrations of sevoflurane on hypoxia-reoxygenation(H/R)-induced apoptosis in rat hippocampal neurons and the role of mitochondrial KATP(mito-KATP)channels.Methods Primary cultured hippocampal neurons isolated from newborn SD rats(＜24h)of both sexes,weighing 5-6 g,were randomly divided into 7 groups with 48 wells and 12 dishes in each one:control group(C group),H/R group,preconditioning with 6%,4%and 2% sevoflurane groups(S1-3 groups),5-hydroxydecanoate(5-HD,mito-KATP channel blocker)100 μmol/L preconditioning group(5-HD group)and preconditioning with 5-HD 100 μmol/L+6% sevoflurane group(5-HD+S group).The neurons were exposed to 4 h hypoxia followed by 24 h reoxygenation. In S1-3 groups, preconditioning was performed with 6% , 4% and 2% sevoflurane respectively before H/R. In 5-HD group, preconditioning was performed with 5-HD (final concentration 100 μmol/L) before H/R. In 5-HD + S group, preconditioning was performed with 5-HD 100 μmol/L and 6% sevoflurane before H/R. The neuronal viability, apoptosis rate and expression of Bcl-2 and Bax were determined after 24 h reoxygenation.Results The neuronal viability was significantly lower,while the apoptosis rate and expression of Bcl-2 and Bax were significantly higher in the other 6 groups than in group C(P＜0.01).The neuronal viability and expression of Bcl-2 were significantly higher,while the apoptosis rate and Bax expression were lower in S1-3 groups than in group H/R. There was no significant difference in the parameters mentioned above between 5-HD and 5-HD + S groups(P＞0.05).The neuronal viability and expression of Bcl-2 were significantly lower, while the apoptosis rate and Bax expression were higher in S2, S3 and 5-HD + S groups than in group S1, and in group S3 than in group S2(P＜0.0l) .Conclusion Sevoflurane preconditioning can inhibit H/R-induced apoptosis in rat hippocampal neurons and reduce the injury to neurons in a concentration-dependent manner, and the underlying mechanism may be related to activation of mito-KATP channels, up-regulation of Bcl-2 expression and down-regulation of Bax expression.