野生型p16基因体外诱导人瘢痕疙瘩成纤维细胞衰老的研究

目的：观察野生型p16基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学效应，探讨对瘢痕疙瘩进行基因治疗的可行性。方法：通过基因转染将含p16 cDNA的真核表达载体pcDNA3-p16导入人瘢痕疙瘩成纤维细胞中，筛选出阳性克隆后用测定细胞生长曲线、细胞周期及细胞超微结构等方法观察细胞的变化，用衰老相关-β-半乳糖苷酶染色法鉴定细胞形态。结果：细胞在转染野生型p16基因后自第3代起形态发生明显变化，细胞增殖明显减慢，细胞周期分析显示有96．7％的细胞处于G1期；电镜分析表明，细胞出现明显的溶酶体超载现象。衰老相关-β-半乳糖苷酶染色证实细胞进入衰老期。结论：野生型p16基因可诱导入瘢痕疙瘩成纤维细胞提前进入衰老阶段，这为瘢痕疙瘩基因治疗提供了实验依据。     

hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响

为了探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位 (hTERT)基因转染对人胚胎成纤维细胞 (hEFs)端粒长度、端粒酶活性及其亚单位的影响 ,采用基因重组技术构建hTERT全长cDNA正义荧光真核表达载体 ,并采用脂质体法将正义重组质粒pIRES2 EGFP hTERT及空载质粒pIRES2 EGFP分别转染原代培养hEFs,检测转染细胞端粒长度、端粒酶活性及端粒酶亚单位的变化。结果显示 ,外源性hTERT基因转染细胞 (hEF hTERT)端粒酶活性较未转染细胞 (hEFs)及空载体转染细胞 (hEF EGFP)显著增加 (P <0 0 1) ,hEF hTERT、hEFs及hEF EGFP端粒长度分别为 6 0kb、5 3kb及 5 4kb ,端粒酶亚单位中除hTERT在mRNA和蛋白水平表达均增加外 ,hTR和TP1mRNA无明显变化。以上结果提示 ,外源性hTERT基因转染能使原代培养的hEFs端粒酶活化 ,端粒长度不再继续缩短 ,hTERT在mR NA和蛋白水平表达增加     

人端粒酶反转录酶基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响

目的 探讨外源性人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染对人胎儿表皮干细胞增殖的影响.方法 采用脂质体转染法,将含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT和卒载体质粒pIRES2-EGFP分别导人体外培养的人胎儿表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选.用RT-PCR和Western blot检测表皮十细胞hTERT mRNA及其蛋白的表达,端粒重复序列扩增法(TRAP)-ELISA检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期.结果 非转染组和空载体质粒转染组表皮干细胞弱表达hTERT mRNA和蛋白,而质粒转染组表皮干细胞强表达hTERT mRNA和蛋白;与非转染组和窄载体质粒转染组比较,质粒转染组表皮干细胞端粒酶活性的表达量显著升高,G_0/G_1期细胞比例明显下降,而S、G_2/M期细胞比例升高,增殖指数增加.结论 外源性hTERT基因转染能有效增强体外培养的人表皮干细胞hTERT mRNA和蛋白的表达及端粒酶活性,细胞增殖能力明显增强.     

端粒酶催化亚基基因表达激活人胚肺成纤维细胞端粒酶活性

目的 :通过端粒酶催化亚基基因转入人胚肺成纤维细胞 ,激活人胚肺成纤维细胞端粒酶活性 ,探讨其在延缓细胞衰老中的作用。方法 :用PCI_hTRT质粒转染人胚肺成纤维细胞 ,G4 18筛选获得稳定表达端粒酶活性的人胚肺成纤维细胞 ,采用RT_PCR和TRAP法分别测定端粒酶催化亚基mRNA和端粒酶活性表达情况。结果 :获得了表达端粒酶活性的人胚肺成纤维细胞 ,其寿限长于正常人胚肺成纤维细胞。结论 :端粒酶催化亚基异位表达可以激活人胚肺成纤维细胞的端粒酶活性 ,并延长人胚肺成纤维细胞的寿命     

Smad3基因siRNA表达载体的构建及在瘢痕疙瘩成纤维细胞的沉默效应

目的构建针对Smad3基因的短片断干扰RNA(small interfer RNA,siRNA)表达载体,观察RNA干扰对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3基因表达的抑制作用。方法根据siRNA设计原则,设计3条针对Smad3基因的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后与载体pRNAT-U6连接,行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染瘢痕疙瘩成纤维细胞,荧光定量PCR和Western-blot方法检测Smad3基因的表达情况。结果经测序鉴定DNA片段确已克隆入载体pLVshRNA-puro,测序结果提示三组碱基序列与靶序列完全相同。经荧光定量PCR和Western-blot方法检测示shRNA-smad3(CA3)沉默效率最高。结论证实实验构建的沉默瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3基因表达的siRNA载体获得成功,为下一步以TGF-β信号转导通路的Smad3因子为靶点的瘢痕疙瘩治疗实验研究奠定了基础。     

P物质对病理性瘢痕成纤维细胞凋亡相关基因表达的影响

目的 探讨P物质(SP)对病理性瘢痕成纤维细胞凋亡相关基因表达的影响。方法 体外培养瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤成纤维细胞．采用细胞爬片免疫组织化学方法检测在SP及SP受体拮抗剂Spantide作用下不同成纤维细胞PCNA、bcl-2、bax的表达。结果 SP可促进不同成纤维细胞PCNA、bcl-2的表达．同时抑制其bax的表达。在SP作用下．瘢痕疙瘩成纤维细胞PCNA、bcl-2表达的增强程度及bax表达的受抑程度显著强于增生性癜痕成纤维细胞和正常成纤维细胞．而增生性癜痕成纤维细胞又强于正常成纤维细胞。Spantide可以完全或部分拮抗SP对不同成纤维细胞的作用,结论 SP通过调控成纤维细胞凋亡相关基因的表达参与病理性瘢痕形成,该作用由SP受体介导。     

hTERT-siRNA表达载体的构建及对MCF-7细胞生长、端粒酶活性的抑制作用

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并研究该载体对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径.方法 设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA,构建重组siRNA表达质粒pGenesil-hTERT,同时构建不针对任何基因的阴性对照重组pGenesiL-HK.两种重组质粒经酶切、电泳分析和测序鉴定后,用脂质体转染法分别转染乳腺癌MCF-7细胞,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP-PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功.转染pGenesil-hTERT的MCF-7细胞,凝胶电泳见端粒酶特征性条带明显减少,端粒酶活性受到明显抑制pGenesil-hTERT转染细胞后凋亡率较对照组明显升高(P＜0.01),且转染48h凋亡率最高,达54.7%±2.41%.结论 hTERT-siRNA可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性、促进细胞凋亡,此法有望应用于肿瘤基因治疗.     

秋水仙碱对人瘢痕疙瘩成纤维细胞MMP-1､MMP-2表达的影响

【摘要】 目的 研究探讨秋水仙碱对体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast, KFB) 内基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)基质金属蛋白酶-2 (MMP-2) 和基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 表达的影响?方法 取7 例患者的瘢痕疙瘩组织进行体外成纤维细胞培养, 待细胞培养至第3 代时, 加入浓度为0.125%的胰蛋白酶消化液浸泡至细胞质回缩?细胞间隙增大后, 转种于75.0 cm2 的培养瓶中继续培养; 待细胞基本融合成片(密度达85%时) 后, 分别将每例患者瘢痕组织的传代培养细胞分为A 组?B 组?C 组?D 组及E组, A 组加入含胎牛血清的DMEM 培养基继续培养备用, B 组?C 组?D 组?E 组加入含胎牛血清的DMEM 培养基及浓度分别为2?4?8?16 μg/ mL 的秋水仙碱继续培养24 h (37℃, 5.0% CO2 ) 后备用?采用逆转录聚合酶链反应(real-time PCR, RT-PPCR) 法检测基质金属蛋白酶mRNA 的表达情况, Western Blot 法检测基质金属蛋白酶蛋白的表达情况?结果 A 组?B 组?C 组?D 组?E 组KFB 中MMP-1 mRNA 的表达水平分别为(0.174±0.016)?(0.282±0.015)?(0.369±0.022)?(0.541±0.027) 及(0.672±0.020), MMP-2 mRNA 的表达水平分别为(0.201±0.033)?(0.371±0.026)?(0.548±0.031)?(0.653 ±0.019) 及(0.796±0.024), MMP-1 蛋白的表达水平分别为(0.127±0.031)?(0.205±0.013)?(0.293±0.027)?(0.349±0.034) 及(0.512±0.035), MMP-2 蛋白的表达水平分别为(0.278±0.023)?(0.395±0.036)?(0.526±0.025)?(0.673±0.014)及(0.792±0.037), 而MMP-9 mRNA 及MMP-9 蛋白均未见表达?与A 组对比, B 组?C 组?D 组及E 组KFB中MMP-1 mRNA?MMP-2mRNA?MMP-1 蛋白及MMP-2 蛋白的表达水平均较高, P均< 0.01, 差异具有统计学意义, 且随着秋水仙碱浓度的增高, B 组?C 组?D 组及E 组KFB 中MMP-1 mRNA?MMP-2 mRNA?MMP-1蛋白及MMP-2 蛋白的表达水平均呈逐渐增高的趋势, P均< 0.01, 差异具有统计学意义?结论 秋水仙碱可提高KFB 中MMP-1 与MMP-2 的表达水平, 从而达到抗纤维化?抑制瘢痕疙瘩形成的目的, 且在一定浓度范围内, 其作用随着秋水仙碱浓度的增加而逐渐增强, 有望成为临床治疗瘢痕疙瘩的一线药物?     

miR-485-5p靶向调节婆罗双树样基因4/莫洛尼白血病毒插入点1对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移及凋亡影响

目的 miR-485-5p靶向调节婆罗双树样基因4(SALL4)/莫洛尼白血病毒插入点1(BMI-1)对瘢痕疙瘩成纤维(KFBs)细胞增殖、迁移及凋亡的影响。方法 选取自2021年5月至2022年5月惠州市中心人民医院收治的21例瘢痕疙瘩患者为研究对象。无菌条件下切取人瘢痕疙瘩组织,分离培养成KFBs细胞。将KFBs细胞分为miR-NC组(空白载体)、KFBs细胞组、miR-485-5p inhibitor组(miR-485-5p低表达)、miR-485-5p mimics组(miR-485-5p过表达)。4组KFBs细胞均以37℃、5%CO₂湿润环境中培养72 h。应用噻唑蓝比色法测定细胞增殖水平;采用流式细胞仪测定细胞凋亡水平;Transwell法评估细胞侵袭能力;实时聚合酶链反应及蛋白印迹法测定细胞miR-485-5p、SALL4、BMI-1 mRNA及蛋白水平。结果 与KFBs细胞组比较,miR-485-5p inhibitor组吸光度(OD)值、存活率、穿膜数、SALL4、BMI-1 mRNA和蛋白水平升高,miR-485-5p mimics组OD值、存...     

P53、MVD在非小细胞肺癌中的表达及其相关性

目的:研究P53、MVD在非小细胞肺癌中的表达及其相关性,探讨其在非小细胞肺癌发生、发展中的作用。方法:采用免疫组织化学SP法检测80例非小细胞肺癌组织、20例肺良性病变组织中P53蛋白的表达,并对肺癌组织中CD34单抗标记的血管计数MVD。结果:肺癌组织P53阳性表达率明显高于肺良性病变组织(P<0.05)。P53表达与肺癌患者的组织学类型无关(P>0.05),与肺癌组织的分化程度、TNM分期及淋巴结转移均有关(P<0.05)。在肺癌组织中,P53蛋白表达阳性组MVD明显高于P53蛋白表达阴性组(P<0.05)。结论:P53可能与肺癌的发生、发展有关。肺癌组织中MVD与P53表达密切相关,突变型p53基因在肺癌血管形成中具有重要作用。     

腺病毒介导凋亡素基因转染对人胆管癌细胞Bcl-2蛋白表达的影响

目的:初步探讨在凋亡素基因转染引发人胆管癌细胞凋亡的同时对Bcl-2蛋白的影响。方法:采用含凋亡素基因的重组腺癌毒感染人胆管癌细胞株QBC939,通过光镜、荧光观察其凋亡情况,在感染后7d收集细胞,采用Western-blot检测其Bcl-2蛋白情况。结果:含凋亡素基因的重组腺病毒感染胆管癌细胞株QBC9397d后其Bcl-2蛋白的表达较空病毒组和空白对照组明显降低。结论:凋亡素基因在诱导人胆管癌细胞凋亡时会导致Bcl-2蛋白的降低,可能有助于凋亡素的作用。     

RNA干扰抑制端粒酶反转录酶联合γ射线对人喉癌细胞的作用

目的 观察人端粒酶反转录酶特异性干扰载体(pshRNA-hTERT)联合放射线在细胞和动物模型水平上对人喉鳞癌Hep-2细胞株的生长抑制作用,研究抑制hTERT在放射增敏中的作用。方法 细胞水平:联合pshRNA-hTERT和γ射线作用于人喉癌细胞Hep-2,用TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,彗星电泳检测DNA损伤;动物水平:建立Hep-2和Hep-2R移植瘤模型,瘤内注射pshRNA-hTERT并联合放射线观察对移植瘤的抑制作用,TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡,免疫组织化学法检测肿瘤内hTERT蛋白的表达。 结果 转染pshRNA-hTERT后Hep-2细胞hTERT的mRNA表达抑制率为60.78%;pshRNA-hTERT不仅能抑制Hep-2细胞的端粒酶活性,而且抑制照射后DNA损伤的修复;在移植瘤模型中,pshRNA-hTERT与放射线有协同抑制移植瘤生长的作用(Hep-2:EPO＝1.79;Hep-2R:EPO＝2.01)。结论 pshRNA-hTERT在细胞和动物实验水平均具有放射增敏作用,表明抑制端粒酶及其亚单位可以增加在体肿瘤的放射敏感性,这为喉癌的基因放疗研究提供了依据。     

A549肿瘤细胞中特异性hTERT-siRNA的干扰作用研究

目的 研究hTERT特异的siRNA对肿瘤细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用。方法 设计和构建由U6启动子驱动的产生特异hTERT的siRNA表达质粒,转染至A549肺肿瘤细胞,以TRAP-ELISA方法观察细胞端粒酶活性,Western blot检测端粒酶蛋白的表达,MTT法检测对细胞生长的影响。结果 构建的针对hTERT基因745靶位点的U6表达质粒具有明显的干扰效果,受到特异hTERT-siRNA干扰的A549肿瘤细胞端粒酶表达下调,细胞生长受抑。结论 应用RNA干扰技术可阻止hTERT基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向。     

辐射联合外源性野生型p53基因对不同p53状态的黑色素瘤细胞系的生物学效应

目的研究辐射结合腺病毒（Ad CMV）载体介导的p53基因转导对不同p53状态的人黑色素瘤细胞系基因转移效率、凋亡和辐射敏感性的影响。方法用复制缺陷的重组腺病毒载体（AdCMV-p53）介导入p53基因转导1Gy X射线预照射的黑色素瘤细胞系A375（wt p53）和WM983a（mu p53），RT-PCR检测mRNA水平，流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况，Tunel法检测细胞凋亡，克隆形成率测定辐射后细胞存活率。用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照。结果1Gy X射线照射可较高地增加AdCMV-p53对A375和WM983a细胞系的基因转导效率，转导的外源性野生型p53可在两种细胞中高效表达，并诱导细胞周期G1期阻滞；单纯转导p53对A375（wt p53）细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应，但可部分诱导WM983a（mu p53）细胞凋亡；而转导p53基因48h后给予X射线辐射，两种细胞的克隆存活率较其对照组均明显减低，外源性p53基因对WM983a（mu p53）细胞的辐射增敏作用较A375（wt p53）细胞明显。结论外源性野生型p53基因过表达可增加黑色素瘤细胞系A375和WM983a的辐射敏感性，但对WM983a细胞系的辐射增敏作用高于A375细胞系。表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的候选基因。     

重组NIS基因腺病毒的制备及在心肌细胞中的特异表达

目的 构建肌凝蛋白轻链-2(MLC-2v)启动子调控的NIS腺病毒载体,探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性.方法 将MLC-2v启动子和NIS基因亚克隆至腺病毒穿梭载体,再与含有骨架质粒(pAdEasy-1)的大肠杆菌(BJ5183)同源重组,经人胚肾细胞(HEK293)包装并扩增得到重组腺病毒Ad-MLC-NIS,同时构建巨细胞病毒(CMV)启动子调控的腺病毒Ad-CMV-NIS、仅含有启动子的腺病毒Ad-MLC和仅含有NIS基因片段的腺病毒Ad-NIS作为对照组.腺病毒体外感染心肌细胞和非心肌细胞,通过Western blot检测NIS蛋白的表达,行动态摄碘及NaClO4摄碘抑制实验观察NIS蛋白的功能和特性.通过台盼蓝染色实验检测腺病毒感染及NIS摄碘情况对心肌细胞活力和增殖的影响.结果 成功构建重组NIS腺病毒.Western blot检测示感染Ad-CMV-NIS的心肌细胞和非心肌细胞均呈NIS蛋白高表达;感染Ad-MLC-NIS的非心肌细胞出现微量蛋白表达,而心肌细胞中NIS蛋白高表达.动态摄碘实验示感染Ad-MLC-NIS的H9C2细胞、A549细胞、U87细胞摄碘峰值分别为5844.0、833.6、846.0放射性计数·min-1.H9C2细胞的摄碘被NaClO4抑制.感染复数(MOI)为100的腺病毒感染心肌细胞,感染和摄碘实验对心肌细胞活力和增殖的影响较小.结论 MLC-2v启动子调控的腺病毒载体可使外源基因NIS在心肌细胞内特异性表达,表达的NIS蛋白具有摄碘功能,为NIS在心肌中作为报告基因的研究奠定了基础.     

亚砷酸钠对人胚胎肺成纤维细胞p53基因表达的诱导作用观察

目的探讨亚砷酸钠(NaAsO2)对体外培养的人胚胎肺成纤维细胞(HELF)p53基因表达的影响。方法以0、3、9、15μmol/L的NaAsO2处理体外培养的HELF24h,然后用Real-ti me PCR检测p53mRNA的表达,免疫组化SABC法检测p53蛋白水平。结果3、9、15μmol/L NaAsO2处理24h后,HELF中p53mRNA及蛋白表达均明显增高(P<0.05),且除9、15μmol/L组间p53mRNA表达无明显差异外,其余各组mRNA及蛋白表达水平均随NaAsO2剂量升高而增加(P<0.05)。直线相关分析显示,HELF中p53mRNA及蛋白表达均与NaAsO2剂量呈正相关(r=0.947,P<0.01;r=0.992,P<0.01)。结论NaAsO2可诱导HELF中p53mRNA和蛋白表达增加,并与剂量呈正相关。