下调VEGF基因表达对乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用

目的利用RNA干扰技术特异性抑制乳腺癌细胞MCF-7的VEGF基因表达,研究乳腺癌的治疗新方法.方法体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VEGF mRNA的siRNA,使用脂质体转染的方法导入细胞,观察转染后乳腺癌细胞MCF-7的增殖变化,MTT法检测细胞存活率,RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化,ELISA检测蛋白表达的下降效果.结果所设计的两个靶位点siRNA能有效抑制乳腺癌细胞生长;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制,明显减少;同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低.阴性对照的错义序列组siRNA则没有这种效果.结论应用RNA干扰技术可以有效抑制肿瘤细胞的增殖.     

RNA干扰缺氧诱导因子2对肾癌786-0细胞的影响

目的：研究RNA干扰缺氧诱导因子2（HIF-2）对肾癌786-0细胞的影响。方法:合成HIF-2 RNAi片段，将RNAi片段定向克隆于RNAi表达载体，测序鉴定；转染人肾癌786-0细胞, RT-PCR、Western 印迹法检测HIF-2 RNAi表达载体对HIF-2基因表达的影响，MTT法检测转染HIF-2 RNAi表达载体对细胞生长作用，裸鼠种植肿瘤观察RNA干扰组对肿瘤生长的影响。结果:RNA干扰组HIF-2mRNA的表达受到抑制，明显低于空载体组和对照组HIF-2mRNA的表达(P<0.01),空载体组HIF-2mRNA的表达没有受到影响；RNA干扰组的HIF-2蛋白表达明显降低，明显低于空载体组和对照组(P<0.01)，空载体组和对照组HIF-2蛋白的表达无显著差异；RNA干扰组细胞生长减慢,RNA干扰组肿瘤体积和瘤重均小于空白组(P<0.01)。结论:RNA干扰HIF-2可以抑制肾癌786-0细胞HIF-2的表达和抑制细胞生长，减慢裸鼠肿瘤的生长；为肾癌的生物治疗提供一定的实验基础。     

CDK2 RNA干扰后HepG2细胞蛋白表达的变化

目的 探讨稳定转染CDK2干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2细胞生物活性及细胞核蛋白质的改变.方法 构建稳定转染pGenesil-1-CDK2的HepG2细胞系,MTT法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期的改变.通过RT-PCR和双向凝胶电泳-质谱技术-数据库搜索,比较转染前后CDK2 mRNA的表达和细胞核蛋白质的变化.并通过Western blot法对显著差异蛋白进行验证.结果 与空质粒组PHK-siRNA-HepG2细胞和未转染组HepG2细胞相比,pCDK2-siRNA-HepG2组细胞的生长速度减慢(P＜0.01),稳定转染CDK2 RNAi组细胞的CDK2 mRNA表达水平显著下降.通过双向电泳-质谱技术得到4个稳定转染CDK2 siRNA的HepG2细胞不表达的蛋白质,Westem blot法证实双向电泳结果的可信性.结论 CDK2干扰RNA可明显降低HepG2细胞CDK2 mRNA的表达,抑制HepG2细胞的增殖,干扰后的HepG2细胞不表达的蛋白质分别是类核糖体蛋白S12、β-肌动蛋白、锌指蛋白276和伴侣蛋白10相关蛋白.     

RNAi沉默DNMT1基因对胰腺癌细胞ppENK甲基化状态的影响

目的观察RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默DNMT1基因的表达对胰腺癌Panc-1细胞的前脑啡肽原(preproen-kephalin,ppENK)基因甲基化状态的影响。方法采用针对DNMT1的Stealth核糖核苷酸干扰(siRNA)胰腺癌细胞,观察DN-MT1信使核糖核酸(mRNA)及DNMT1蛋白的表达;甲基化特异性PCR反应(MSP)检测不同处理组ppENK的甲基化状态。结果 Stealth RNAi转染到胰腺癌细胞Panc-1中48 h后,siRNA-3转染组的mRNA相对表达量和比率分别为0.116和32.9%,与空白对照组(0.352,100%)、脂质体对照组(0.346,98.2%)、RNAi阴性对照组(0.339,96.3%)相比差异有统计学意义(F=2.107 E4,P=0.000 1),转染组的mRNA相对抑制率为67.1%。siRNA-3转染组DNMT1蛋白相对表达量和比率分别为0.179和32.9%,与空白对照组(0.547,100%)、脂质体对照组(0.520,95%)、RNAi阴性对照组(0.535,97%)相比差异有统计学意义(F=2.195 E5,P=0.000 1)。于100 bp和96 bp处可见ppENK基因特异性条带,呈现部分去甲基化状态的特点。结论 DNMT1靶向的Stealth RNA瞬时转染到胰腺癌细胞Panc-1中可明显沉默DNMT1的基因和蛋白的表达,逆转抑癌基因ppENK的高甲基化状态,为胰腺癌的基因治疗提供相关的理论依据。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κB p65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景.利用阳离子脂质体LipofectamineTM000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA表达,Westem blot检测细胞内NF-κB p65蛋白水平.同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用.结果显示在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κB p65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κB p65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κB p65的表达也明显受到抑制.说明RNAi技术可以抑制NF-κB p65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法.     

VEGF基因特异性siRNA转染后对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨利用干扰RNA（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计针对VEGF基因的小干扰RNA（siRNA）,合成DNA模板,体外转录siRNA。以脂质体转染法将双链siRNA导入MCF-7细胞后,用MTT比色法检测siRNA对MCF-7细胞增殖的影响。通过Hoechst33258染色观察MCF-7细胞的凋亡。用流式细胞术检测细胞周期的改变,RT-PCR检测VEGF mRNA表达的变化,免疫细胞化学法检测VEGF蛋白的表达。结果：所设计的两个靶位点siRNA,均能有效地抑制MCF-7细胞的增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,VEGFmRNA及其蛋白的表达明显减少;而作为阴性对照的错义序列组siRNASCR则没有上述效应。结论：体外转录合成的siRNA可抑制MCF-7细胞中VEGF基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

VEGF_(165)真核表达载体的构建及其对白血病细胞增殖和化疗药物敏感性的影响

目的:构建血管内皮细胞生长因子的真核表达载体,探讨其对白血病细胞的增殖以及化疗药物敏感性的影响。方法:应用常规基因克隆方法构建pEGFP-C1-hVEGF165真核表达载体,转染白血病细胞K562,采用CCK8法检测重组质粒对细胞增殖的影响,RT-PCR方法检测细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的表达水平,ELISA方法定量检测细胞培养液和细胞内VEGF蛋白的表达水平,用流式细胞仪检测细胞周期。结果:经酶切鉴定和基因测序证实成功构建了VEGF165真核表达载体。稳定转染pEGFP-C1-hVEGF165的K562细胞较转染pEGFP-C1空质粒的K562细胞增殖加快,VEGF165 mRNA表达明显增加,细胞分泌VEGF蛋白水平上调。转染pEGFP-C1-hVEGF165还可以提高白血病细胞在化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶作用时的细胞存活率。结论:VEGF165真核表达载体可以上调白血病细胞K562的VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达水平,从而促进白血病细胞的增殖,同时可以降低白血病细胞对化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶的敏感性。     

慢病毒介导RNA干扰血管内皮生长因子基因增强K562细胞对STI571敏感性

目的： 探讨慢病毒载体介导RNA干扰（RNAi）抑制血管内皮生长因子（VEGF）基因表达对白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响。 方法： 构建靶向VEGF基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染至293T细胞,包装产生的病毒液感染K562细胞。采用实时荧光定量PCR、Western blotting、ELISA等方法检测RNAi对K562细胞VEGF mRNA和蛋白表达的影响;台盼蓝拒染法和MTT法分析转导VEGF-shRNA对K562细胞增殖的影响;流式细胞术检测经STI571(甲磺酸伊马替尼)作用后细胞凋亡变化情况。 结果： 构建VEGF基因shRNA慢病毒载体(pRNAT-shRNA),并成功将其导入K562细胞。与K562和K562-con（转导空载体）组细胞相比,转导pRNAT-shRNA的K562-shVEGF细胞VEGF mRNA和蛋白表达均显著下降;生长曲线提示K562-shVEGF细胞增殖速度减慢;在STI571作用下,K562-shVEGF细胞凋亡率较K562和K562 -con组细胞明显增高(P<0.05)。结论： 慢病毒载体介导的VEGF基因RNA干扰可有效抑制K562细胞增殖,并能够增强细胞对STI571的敏感性。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Slug基因,观察对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法:构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及SlugsiRNA三组,应用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果,MTT法检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况。结果:转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3,P<0.05)。结论:Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长并促进其凋亡。     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.     

靶向ANG-2的shRNA重组载体抑制人子宫内膜癌Ishikawa生长和侵袭的研究

目的 探讨采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制血管生成素-2(angiopoietin-2,ANC-2)基因的表达对人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞的影响.方法 采用脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法将针对ANG-2基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,ahRNA)表达载体转染到人子宫内膜癌Ishikawa细胞中,逆转录聚合酶链反应及Western印迹法检测ANG-2 mRNA及蛋白的表达;噻唑蓝比色法检测Ishikawa细胞的增殖;荧光显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞周期及凋亡;侵袭实验检测其对侵袭能力的影响.结果 人子宫内膜癌Ishikawa细胞ANG-2 mRNA及其蛋白质表达水平均显著降低;增殖被抑制,抑制率63.11%;细胞凋亡增加,细胞凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比明显增高;细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少;侵袭能力明显下降.结论 靶向ANG-2的shRNA能成功下调ANG-2基因的表达,抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长和侵袭.