核酸疫苗免疫帕金森病小鼠加重黑质炎性反应

目的:探讨α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)核酸疫苗免疫帕金森病小鼠后黑质免疫炎性反应的变化.方法:将本实验室成功构建的α-syn核酸疫苗-pVAX1-hα-Syn140用Qiagen试剂盒大量制备α-syn质粒;24只MPTP慢性帕金森病小鼠随机分为3组:实验组、空质粒对照组和PBS对照组,各组小鼠分别肌注pVAX1-hα-Syn140重组质粒,pVAX1空质粒和PBS各100 μl,共免疫3次,每次间隔3周,末次免疫后2周,观察小鼠中脑黑质CD11b和TNF-α表达变化.结果:pVAX1-hα-Syn140核酸疫苗免疫组小鼠中脑黑质CD11b表达较对照组增加约36%～37%(P＜0.01);TNF-α表达较对照组增加约28%～32%(P＜0.01).结论:pVAX1-hα-Syn140核酸疫苗具有一定的炎性副反应,可在下一步的实验中进行优化,减轻其有害的细胞毒副反应.     

pVAX1-IL4/SYN-B核酸疫苗预防接种对慢性鱼藤酮损害小鼠的神经保护作用

目的探讨优化人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)核酸疫苗(pVAX1-IL4/SYN-B)预防接种对慢性鱼藤酮损害小鼠的神经保护作用。方法将小鼠随机分为3组:核酸疫苗组、空质粒组、PBS对照组,在小鼠双侧后肢胫前肌部位分别注射pVAX1-IL4/SYN-B核酸疫苗,空质粒pVAX1,PBS各100μl,共免疫3次。末次注射3周后全部小鼠背部皮下注射鱼藤酮1 mg/kg,1次/d,连续注射40 d。最后一次注射后,观察小鼠行为学变化;免疫组化方法检测小鼠中脑黑质致密部α-syn表达和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞数目变化;RT-PCR检测α-syn mRNA表达情况。结果行为学观察发现,各组小鼠自由活动实验显示核酸疫苗组,空质粒组,PBS对照组小鼠移动格子数及下肢站立次数明显改善,并有显著差异(P<0.05)。免疫组化发现核酸疫苗组小鼠与空质粒组、PBS对照组相比,TH阳性细胞数增加63.27%、55.34%(P<0.05),α-syn表达减少55.68%,55.34%(P<0.05)。RT-PCR发现核酸疫苗组α-syn mRNA相对表达水平0.38±0.03较空质粒组0.77±0.05及PBS对照组0.73±0.01明显减少(P<0.05)。结论 pVAX1-IL4/SYN-B核酸疫苗能有效防止鱼藤酮神经毒素对黑质多巴胺能神经元的损害,对多巴胺能神经细胞具有保护作用。     

不同表位Aβ亚单位疫苗引起免疫反应类型及疫苗安全性评价

为了研究不同表位Aβ亚单位疫苗接种Tg2576鼠引起的免疫反应类型和疫苗的安全性,本研究选用32只5月龄Tg2576小鼠,并随机分成对照组、Aβ42组、Aβ1-15组和Aβ36-42组,5月龄时开始分别接种相应疫苗,接种7个月,间接ELISA法测定血液及脑匀浆上清液中抗Aβ42的抗体滴度。分别取4组小鼠的脾细胞进行培养,用刀豆蛋白(ConA)和各自抗原刺激,ELISA法检测培养液中IFN-γ,IL-2,IL-4和IL-10的含量,免疫组化法检测脑内小胶质细胞的增生情况,组织化学法检测脑、肝、脾、肺、肾组织有无病理性改变。结果显示:(1)与对照组相比,疫苗免疫组血清和脑组织匀浆上清液中抗Aβ42抗体的滴度明显有所增高(P<0.01);(2)脾细胞培养,经ConA或各自抗原刺激后,3组疫苗免疫组细胞增殖显著高于对照组(P<0.01)。培养液中免疫因子检测显示Aβ42组IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10均较高,Aβ1-15组中IL-4和IL-10较高,Aβ36-42组IFN-γ和IL-2较高。免疫组织化学法显示4组小鼠大脑皮质与海马部位均有大量OX-42阳性小胶质细胞,疫苗免疫组OX-42细胞数量更多,但4组之间无显著性差异(P>0.05);(3)HE及组织特异性染色显示在疫苗接种组鼠的重要器官未见病理性改变。上述结果表明,Aβ42疫苗可引起Th2和Th1免疫反应,Aβ1-15亚单位主要引起Th2免疫反应,Aβ36-42疫苗主要引起Th1免疫反应。3种疫苗均可进一步激活脑内小胶质细胞,增强其Aβ清除能力,未发现疫苗接种引起的毒副作用。因此,本实验结果提示Aβ1-15亚单位疫苗更符合AD免疫治疗的要求。     

α-突触核蛋白的生物学功能及其在帕金森病中的作用

α-Synuclein is identified as a constant component of dopaminergic neuronal pale eosinophilic inclusions "the Lewy bodies" in Parkinson’s disease. In fact, normal α-synuclein has lots of biological functions, which regulates synaptic plasticity, integrates presynaptic signaling, regulates dopamine level in the synapse, modulates microglial activation and lipid metabolism, and exerts heat shock protein-like function. However, abnormal α-synuclein leads to pathological lesion. Many studies show that pathological α-synuclein levels are elevated under the condition of its gene mutation, certain posttranslational modifications, dysfunction of molecular chaperones or ubiquitin proteasome system. The pathological α-synuclein plays an important role in neurodegeneration, in particular, Parkinson’s disease because it interrupts integrity of synaptic vesicles, ER-Golgi traffic and axonal transport, inhibits histone acetylation and chaperone-mediated autophagy, stabilizes itself against proteasomal degradation, and leads to neuroinflammation and abnormal phosphorylation of tau.     

转染α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞增强对鱼藤酮毒性的耐受

目的探讨α-突触核蛋白(α-synuc le in)在鱼藤酮处理的人类多巴胺能SH-SY5Y细胞内的作用。方法用脂质体转染的方法将-αsynuc le in基因转染入SH-SY5Y细胞内,并筛选稳定表达-αsynuc le in的细胞。经过不同浓度的鱼藤酮处理后,测定细胞活力、细胞内氧化应激和抗氧化能力。结果经鱼藤酮处理后,所有的细胞均表现为细胞活力下降和细胞内氧化应激增强。与正常SH-SY5Y细胞相比,过表达-αsynuc le in的细胞表现为较高的细胞活力和抗氧化能力(P<0.01)。结论α-synuc le in过表达可能通过增强SH-SY5Y细胞活力和抗氧化能力,来部分对抗鱼藤酮的毒性作用。     

优化核酸疫苗对慢性MPTP帕金森病小鼠的免疫作用

目的评价优化核酸疫苗(pVAX1-IL-4/SYN-B)预防接种对小鼠MPTP损害的免疫保护作用。方法将C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、PBS模型组、空质粒模型组、优化核酸疫苗模型组4组,分别在小鼠双后肢胫前肌注射PBS、PBS、空质粒、pVAX1-IL-4/SYN-B各100μl,共3次。末次注射3周后,后3组注射MPTP构建慢性帕金森病小鼠模型,正常对照组注射同体积的PBS。末次给药后观察小鼠行为学变化;免疫组织化学、Western blot检测小鼠黑质部酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达情况;RT-PCR检测小鼠黑质TNF-α、IL-1β的mRNA水平。结果与PBS模型组、空质粒模型组相比,优化核酸疫苗模型组小鼠运动症状明显改善;TH丢失减少;TNF-α、IL-1β的mRNA水平表达降低;差异有统计学意义。结论优化核酸疫苗预防接种对小鼠的慢性MPTP损害有一定的神经保护及抗炎作用。     

羊种布氏杆菌核酸疫苗的制备及其免疫效果

目的：构建羊种布氏杆菌基因组DNA表达文库,并研究其免疫效果。方法：将羊布氏杆菌基因组DNA经限制性内切酶Hind Ⅲ消化后,克隆入pSV-β-Gal质粒,构建含羊布氏杆菌基因组DNA酶切片段的表达文库,用构建的表达文库经股四头肌免疫小鼠,结果：从文库中筛选了26个含羊种布氏杆菌基因组DNA片段的细菌克隆。免疫小鼠,可以刺激小鼠产生羊种布氏菌凝集抗体,并使淋巴细胞转化率明显增高,结论：构建的羊布氏杆菌基因组DNA表达文库可以刺激小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答。此工作为制备有效的布氏杆菌及其它胞内寄生菌疫苗提供了实验基础。     

核酸疫苗与蛋白疫苗的免疫特点及其联合免疫的研究进展

核酸疫苗和蛋白疫苗具有各自的免疫特点,分别诱导以细胞免疫和体液免疫为主的免疫应答,并能通过联合免疫提高机体预防病原体的免疫保护力,而核酸疫苗和蛋白疫苗的免疫特点以及联合使用核酸疫苗与蛋白疫苗协同免疫可以提高疫苗免疫效果。     

电穿孔增强核酸疫苗免疫反应的研究进展

核酸疫苗自诞生以来在肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等方面显示出其独特的优越性。目前,研究如何增强核酸疫苗的免疫原性是一大热点,在众多方法中,电穿孔通过增加细胞对DNA的摄取,使表达的目的抗原增多,从而明显地增强了核酸疫苗诱导的免疫反应。就电穿孔技术在核酸疫苗研究领域的应用作一综述。     

α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的研究进展

帕金森病（PD）是最常见的神经系统退行性疾病,路易小体（LBs）是其最典型的病理改变。LBs的主要成分是α-突触核蛋白（α-syn）,其被认为是PD的致病因子。传递假说认为,病理性α-syn可由受损神经元转运到正常神经元,导致受体神经元中α-syn也产生病理性错误折叠和聚集,导致级联式神经细胞受损。肠脑轴假说认为,病理性α-syn可由肠道产生,经由迷走神经上传至中枢神经系统。本文就α-syn在PD发病机制中的作用进行概述,以期为PD的干预靶点的研究提供参考。     

α-突触核蛋白在帕金森病中的作用

帕金森病(PD)患者的路易小体中存在大量α-突触核蛋白寡聚体.目前认为,寡聚体的形成和增多与氧化应激损伤及氧化修饰息息相关.氧化修饰包括硝化修饰和多巴胺氧化加合.α-突触核蛋白作为分子标志物,可能成为临床治疗帕金森病的新途径.     

氯胺酮对MPTP诱导的帕金森病小鼠α-synuclein及星形胶质细胞的影响

目的:探究亚麻醉剂量氯胺酮(ketamine)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠α-突触核蛋白(α-synuclein)及星形胶质细胞的影响。方法:将36只SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为3组(每组12只):NaCl组(腹腔注射生理盐水)、MPTP组(腹腔注射MPTP)和ketamine组(腹腔注射MPTP和ketamine)。悬尾实验和步态分析实验检测3组小鼠间的行为学差异;免疫荧光染色以及Western blot检测小鼠黑质(SN)、纹状体尾壳核(CP)及视皮层(CX)内α-synuclein和胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果:悬尾实验和步态分析实验结果显示,与NaCl组相比,MPTP组小鼠悬尾不动时间延长,步距减小(P<0. 05);与MPTP组相比,ketamine组小鼠悬尾不动时间缩短,步距增大(P<0. 05)。免疫荧光染色及Western blot结果显示,MPTP组小鼠SN、CP及CX内α-synuclein和GFAP的表达较NaCl组显著增多(P<0. 05),ketamine...     

MPTP对小鼠中脑α-突触核蛋白线粒体表达和线粒体形态改变的影响

目的:观察MPTP对中脑黑质神经元线粒体表达α-突触核蛋白及线粒体形态改变的影响。方法:运用腹腔注射MPTP诱导C57/BL小鼠中脑黑质神经元损伤,以生理盐水腹腔注射小鼠作为对照组。运用线粒体纯化结合Western Blot分析线粒体α-突触核蛋白的水平,运用免疫组织化学标记结合激光共聚焦方法观察线粒体结构的改变。运用MPP+干预原代培养的多巴胺能神经元,观察线粒体形态的改变。结果:MPTP可以诱导小鼠中脑线粒体α-突触核蛋白的水平升高,并导致线粒体出现碎片化,碎片化的线粒体结构与α-突触核蛋白共定位。运用MPP+处理原代培养的中脑腹侧神经元,发现MPP+可以选择性地诱导多巴胺能神经元的线粒体碎片化。定量研究显示:多巴胺能神经元经MPP+处理后,线粒体的长度显著降低(P0.01)。结论:MPTP可以在体诱导多巴胺能神经元的线粒体碎片化,线粒体α-突触核蛋白水平的升高可能与其碎片化密切相关。     

细胞因子佐剂对核酸疫苗免疫效果的影响及作用机制

细胞因子佐剂包括白细胞介素、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、趋化因子等,其作为佐剂可显著增强抗原的免疫原性,调节机体的体液免疫和细胞免疫应答水平.在核酸疫苗的研究中,细胞因子佐剂已被证实具有重要的调节作用.现就细胞因子佐剂对核酸疫苗免疫效果的影响及作用机制进行综述.     

猫α-synuclein蛋白的表达纯化及生物学特征分析

目的对猫突触核蛋白(α-synuclein)进行克隆、表达及纯化,并探讨其生物信息学特征。方法在Genebank中α-synuclein基因的保守区域内设计引物,从猫脑c DNA文库中PCR扩增得到猫的α-synuclein基因,再将此基因双酶切后克隆到p ET28a原核表达载体中,构建重组质粒,测序正确的重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌,采用IPTG诱导表达。然后对猫α-synuclein氨基酸的同源性和疏水性进行分析。结果实验成功从猫脑c DNA文库中扩增出α-synuclein基因,基因全长381个碱基,编码126个氨基酸。获得的全长基因成功克隆进入p ET28a,最后转染大肠杆菌BL21(DE3),获得可溶性表达的α-synuclein蛋白质,蛋白质分子量为13.12k D,与预期分子量一致。生物信息学分析显示猫α-synuclein蛋白与人源及鼠源α-synuclein氨基酸具有很高的同源性,分别为87.35%和83.15%,但是与鼠和人的氨基酸序列比较,猫α-synuclein氨基酸缺失41~54位氨基酸。蛋白质结构预测显示猫α-synuclein具有很好的疏水性,有助于诱导表达时形成可溶性蛋白,这一结果在本研究中得到证实。结论本研究首次克隆了猫α-synuclein基因,并在大肠杆菌中实施了可溶性表达,为后期研究α-synuclein的进化、蛋白晶体结构、生物学功能和帕金森动物模型的构建奠定了一定的基础。     

α-突触核蛋白磷酸化参与小鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的　研究α-突触核蛋白(α-SYN) 129位点磷酸化修饰是否具有神经元保护作用。方法　应用反转录病毒感染小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D,通过实时定量PCR检测各组细胞内α-SYN过表达情况,并通过免疫细胞化学方法检测野生型α-SYN (WT/α-SYN)及129位点磷酸化α-SYN (S129D/α-SYN)过表达后α-SYN在细胞内聚集情况,应用CCK-8检测细胞活力,观察WT/α-SYN及S129D/α-SYN对MN9D的细胞毒性,从而明确S129D/α-SYN对多巴胺能神经元的影响。 结果　实时定量PCR结果显示,WT/α-SYN及S129D/α-SYN在MN9D细胞内均过表达（P<0.01）。WT/α-SYN过表达组细胞活力明显下降（P<0.01）,共聚焦显微镜观察未见明显的α-SYN聚集;S129D/α-SYN过表达组细胞内可观察到明显的α-SYN聚集体,同WT/α-SYN组相比细胞活力有明显提高（P<0.01）。结论　129位点丝氨酸的磷酸化修饰在一定程度上减轻了WT/α-SYN过表达所引起的细胞毒性。     

汉滩病毒核酸疫苗滴鼻及肌注免疫小鼠效果的比较研究

观察汉滩病毒DNA疫苗滴鼻及肌注免疫诱导机体产生的免疫应答,探索汉滩病毒DNA疫苗新的免疫途径。以pcDNA3.1B-S1.3进行肌肉注射及滴鼻免疫小鼠,采用ELISA、淋巴细胞转化试验及特异性CTL杀伤活性测定等方法检测其诱导的系统和黏膜免疫反应的差异。实验结果表明,滴鼻组粪IgA滴度明显高于肌注组(P<0.05);而肌注组血IgG滴度均值虽高于滴鼻组,但两者统计上无显著意义(P>0.05);滴鼻组及肌注组小鼠脾细胞分别经ConA刺激后,其刺激指数作统计分析,结果无显著性差别(P>0.05);肌注组与滴鼻组效应细胞对靶细胞的杀伤力用方差分析进行比较,无显著性差异(P>0.05)。这些均表明,滴鼻免疫对特异的黏膜免疫激发作用明显优于肌肉注射,疫苗的滴鼻免疫途径较肌注途径有着明显的优势。     

pVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒的构建及表达

目的构建含人白介素4(human IL-4,hIL-4)基因与人α-突触核蛋白(humanα-synuclein,hα-syn)B细胞表位基因的真核表达质粒,并研究其在COS-7细胞内的表达。方法RT-PCR扩增人IL-4基因后,通过基因重组技术将其与α-synuclein蛋白B细胞表位基因融合,在两者之间引入柔性短肽(GSGGGSG)。将融合产物克隆到真核表达载体PVAX1上,利用电泳和测序鉴定融合质粒的大小、方向和序列。采用脂质体转染法,将融合质粒转入COS-7细胞中,用Western blotting技术检测其表达。结果电泳和测序结果与预期一致,并命名为PVAX1-IL-4/SYN-B;质粒转染COS-7细胞株成功,并且能在细胞内高效表达。结论成功构建PVAX1-IL-4/SYN-B融合质粒,并在哺乳动物COS-7细胞中高效表达,为研究融合质粒在帕金森病动物模型中的免疫效果奠定了基础。     

GM-CSF增强DNA疫苗免疫效果的研究进展

DNA疫苗因既能诱导体液免疫应答，又能诱导细胞免疫应答而受到广泛关注，但作为治疗性疫苗其免疫效果尚需进一步提高。细胞因子作为DNA疫苗免疫佐剂受到了广泛重视，特别是GM—CSF，由于在细胞因子网络中占有重要地位，在免疫反应中具有重要作用，而成为研究的热点之一。本文就GM—CSF增强DNA的免疫效果及其作用机理作一简要综述。     

α-突触核蛋白各结构域与MN9D细胞线粒体的关系

目的 探讨α-突触核蛋白(α-synuclein)各结构域与MN9D细胞线粒体的关系.方法 用PCR方法获得α-synuclein/1～65(N),α-synuclein/61～95(A)及α-synuclein/96～140(C)基因片段,克隆入真核表达质粒pLNCX2,经测序正确后以脂质体转染PT-67细胞,挑取单克隆并扩增,收集上清感染MN9D细胞,分别用Real Time PCR检测细胞基因表达水平,免疫组织化学染色检测蛋白表达,激光扫描共焦显微镜检测蛋白与线粒体共定位,流式细胞术检测细胞状态及线粒体膜电位状态.结果 成功构建了pLNCX2/N、pLNCX2/NAC及pLNCX2/C基因片段的重组真核表达质粒,获得了可稳定表达α-synuclein各基因片段的MN9D细胞株.通过激光扫描共焦显微镜观察,可见α-synuclein/N端与线粒体存在共定位关系;α-synuelein/NAC主要在核内聚集表达;α-synuclein/C端在胞质和胞核内均有表达.JC1染色流式细胞术检测显示,过表达α-synuclein/N实验组细胞线粒体膜电位降低.结论 α-synuclein的N端可能定位于线粒体,并参与调节线粒体功能;α-synuclein/NAC虽具有疏水性但却能穿过核膜,聚集在核仁周围;α-synuclein的C端定位于胞质和核内可能参与多种细胞功能.