聚合酶链反应检测日本血吸虫DNA的实验研究

目的探索核酸检测在日本血吸虫病诊断中的应用。方法根据日本血吸虫基因设计特异性引物,采用PCR方法对日本血吸虫的成虫、虫卵、日本血吸虫感染家兔的肝组织、粪便、外周血清标本中的DNA进行扩增,并将虫卵和粪便的模板DNA倍比稀释后进行扩增,以测定PCR扩增法的敏感性。结果从日本血吸虫的成虫、虫卵、日本血吸虫感染家兔的肝组织、粪便和外周血清中均扩增到分子量为230bp的阳性条带,扩增产物经测序并在基因库中匹配,证实为日本血吸虫基因中的一个片段,其同源性为98%。其PCR扩增敏感性检测结果表明,0.021个虫卵DNA模板即可扩增出该特异性阳性条带。结论聚合酶链反应检测日本血吸虫DNA有较高的敏感性,尤其是能从日本血吸虫感染宿主血清中检测出特异性DNA,具有潜在的诊断应用价值。     

基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫 基因检测方法的建立

目的　建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（Recombinase?aided amplification, RAA）。方法　以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系。分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性。结果　建立的荧光RAA法可在39 ℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL。以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DNA检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好。     

环介导等温扩增法检测粪样中日本血吸虫虫卵DNA的效果评估

目的评估环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)法检测粪样中日本血吸虫(Schistosoma japonicum)虫卵DNA的效果,并评价其检测流行区现场牛野外粪样的效果。方法取1 g新鲜的日本血吸虫虫卵阴性牛粪,分别加入5个新鲜日本血吸虫虫卵、50μl日本血吸虫虫卵排泄分泌产物(egg secretion product,ESP)制备人工模拟阳性粪样。用粪DNA提取试剂盒分别提取加入虫卵的未经研磨或研磨2 min后的人工模拟阳性粪样、加入虫卵ESP的粪样和阴性粪样的DNA,以日本血吸虫28S核糖体DNA(r DNA)为检测靶基因,用LAMP法、PCR法检测,评估LAMP法检测粪样中日本血吸虫虫卵DNA的效果。收集2012-2014年湖南、湖北、江西、安徽等4省日本血吸虫病流行区的牛野外粪样221份,研磨后同法提取DNA,用LAMP法检测,并与PCR法、孵化法的检测结果进行比较,评价其检测流行区现场野外粪样的效果。结果LAMP法检测加入虫卵粪样并经研磨后提取的DNA、加入虫卵ESP粪样提取的DNA均为阳性反应,呈绿色;而加入虫卵粪样未经研磨提取的DNA、阴性粪样DNA则为阴性反应,呈棕色;PCR检测的结果与LAMP法检测结果相近。LAMP法、PCR法和孵化法检测血吸虫病流行区牛野外粪样的阳性率分别为5.43%(12/221)、4.52%(10/221)、0.90%(2/221)。LAMP法的阳性率明显高于孵化法(P0.05),LAMP法与PCR法阳性率差异无统计学意义(P0.05)。结论 LAMP法可用于检测流行区现场野外粪样的日本血吸虫虫卵DNA,其现场应用价值有待进一步验证。     

检测日本血吸虫感染性钉螺PCR方法的建立

目的 建立灵敏、特异的检测日本血吸虫感染性钉螺的PCR方法。 方法 根据日本血吸虫18S小亚基单位核糖体核酸（18S-rRNA）基因设计1对引物，建立检测日本血吸虫感染性钉螺的PCR方法。测定PCR产物的DNA序列，稀释血吸虫毛蚴DNA进行PCR方法的灵敏性试验，扩增单尾尾蚴感染的钉螺DNA进行交叉反应试验，并根据不同稀释度的感染性钉螺DNA的扩增结果来验证PCR的群体检测效果。 结果 PCR扩增日本血吸虫感染性钉螺，得到了与靶DNA片段位置相同的产物，测序片段长度为469 bp，与靶DNA相同且序列一致，并将序列登录GenBank(注册号：DQ442999)。扩增阴性钉螺无产物出现。灵敏性试验提示，PCR可检出日本血吸虫毛蚴DNA的最低浓度为40 pg/μl；交叉反应试验显示，PCR方法不能扩增出单尾尾蚴感染钉螺的DNA；群体检测试验表明，PCR可检出感染性钉螺提取的DNA最高稀释度为1∶640。 结论 初步建立的检测日本血吸虫感染性钉螺的PCR方法灵敏、特异且具有良好的群体检测效果。     

基于重组酶聚合酶扩增的曼氏血吸虫核酸可视化检测技术的建立及初步评价

目的 结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧流层析试纸条(LFD)，建立一种快速、便捷的曼氏血吸虫核酸可视化检测方法，并初步评价其检测效能。方法 以曼氏血吸虫细胞色素c氧化酶亚基1(SmCOX1)基因为靶序列，利用Primer Primer 5软件结合手工辅助，设计特异性引物和探针并进行筛选，建立曼氏血吸虫核酸LFD-RPA检测方法。制备不同浓度(1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl、0.1 fg/μl)的曼氏血吸虫成虫基因组DNA和含有不同拷贝数浓度(10~5、10~4、10~3、10~2、10~1、10~0、10^-1拷贝/μl)的SmCox1重组质粒DNA，评价所建立方法的敏感度。以曼氏血吸虫成虫、日本血吸虫成虫、埃及血吸虫虫卵、感染曼氏血吸虫双脐螺(阳性双脐螺)和阴性双脐螺、感染日本血吸虫钉螺(阳性钉螺)和阴性钉螺、华支睾吸虫成虫、大片形吸虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫基因组DNA为模板，评价所建立方法的特异性。将30只雌性BALB/c小鼠随机分为40尾感染组、80尾感染组和健康...     

用多聚酶链反应检测人体粪便和血清中曼氏血吸虫DNA

曼氏血吸虫感染的确诊要求在粪便中检测到虫卵 ,Kato- Katz法是目前公认的既经济又方便的诊断法 ,但在流行率及感染度较低地区 ,这一方法的敏感性较低。此外 ,对新感染虫体尚未产卵阶段亦无法检出 ,因而存在一定的局限性。作者研究和开发了多聚酶链反应 ( PCR)的诊断技术 ,首次从人体粪便与血清中检测曼氏血吸虫 DNA。运用样本抽提技术和二步快速反应来扩增粪便和血清中的曼氏血吸虫的 DNA。收集1 0 0个曼氏血吸虫尾蚴感染 4 5天的小鼠肝脏中的曼氏血吸虫虫卵 ,贮存于 - 2 0℃的 0 .9%盐水中备用。将含有 2 0 0个虫卵的盐水液1 0 μl加…     

重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立

目的 建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（RAA）。方法 以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系。应用此方法与聚合酶链式反应（PCR）同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性。结果 建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成。以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为0.01 ng/μL。建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。结论 本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值。     

重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增 方法的建立及评价

目的　建立一种可用于隐孢子虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增（RAA）方法，并对其检测敏感性和特异性进行评价。方法　以隐孢子虫属特异性18S rRNA核酸序列作为检测靶标，采用Amplfix软件设计、合成引物及荧光检测探针，构建并优化RAA荧光反应体系；分别以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测，以评价其敏感性；分别以隐孢子虫卵囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测，以评价其特异性。结果　成功建立了隐孢子虫检测RAA法，该方法可在39 ℃、20 min内得到隐孢子虫属18S rRNA基因片段的有效扩增。以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板，该方法最低检出限分别为102拷贝/μL、1 pg/μL和1个/50 μL；以蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于检测隐孢子虫卵囊DNA的RAA法，该方法操作简便、反应快速，敏感性和特异性均较好。     

结合重组酶介导的核酸等温扩增和荧光探针快速检测日本血吸虫基因片段

目的结合重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)和荧光探针方法建立日本血吸虫特异性基因片段的快速检测方法。方法以日本血吸虫G28 (Sj G28)基因片段作为靶序列,应用DNAMAN 7.0软件设计合成引物及荧光探针,建立荧光RAA反应体系。扩增不同拷贝数的Sj G28重组质粒,评价荧光RAA检测的敏感性;分别以日本血吸虫、曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫基因组为模板进行荧光RAA检测,以评价该方法的特异性。采用荧光RAA分别检测500、 200和50条日本血吸虫尾蚴感染的兔粪中虫卵DNA。分别在50只阴性钉螺中混入1、 2、 3、 4、 5、 10只阳性钉螺,并提取DNA进行荧光RAA检测。结果以不同拷贝数的Sj G28重组质粒为模板进行荧光RAA扩增,在5 min时即可观察到明显的荧光信号,随着拷贝数的不断降低,检测到荧光信号的时间也随之延长,不同拷贝数的扩增均在10 min内完成,最低可检出的质粒浓度为10拷贝/μl。以曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。不同数量尾蚴感染的兔粪中提取的DNA样品经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在15 min内完成。含不同数量阳性钉螺的50只阴性钉螺提取的日本血吸虫DNA经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在10 min内完成。结论本研究建立的可检测日本血吸虫核酸片段的荧光RAA方法,反应快捷,敏感性和特异性均较高。     

SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫感染的敏感性研究

目的建立快速、敏感、特异的检测日本血吸虫感染的SYBR Green荧光定量PCR法,准确评估其敏感性。方法将计数的日本血吸虫虫卵掺人健康水牛粪样中,制备人工阳性粪样。采用改良QIAamp DNA Stool Kit粪样DNA提取方法,提取人工阳性粪样DNA,进行SYBR Green荧光定量PCR,建立Ct值与粪样中克粪虫卵数（EPG）的关系;提取单独（不与牛阴性粪样混合）日本血吸虫虫卵DNA与虫卵生理盐水冲洗液DNA,行定量PCR检测,以对本方法进行严格质量控制。结果每200mg粪样仅含1个虫卵时,荧光定量PCR仍呈阳性,人工阳性粪样EPG的对数与PCR的Ct值存在线性关系。结论SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫虫卵DNA敏感性高,EPG对数与PCR的Ct值存在线性关系。     

检测水体日本血吸虫毛蚴PCR方法的建立

目的建立一种灵敏、特异的痕量检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法。方法取感染6～8w日本血吸虫的小鼠肝脏,碾磨后沉淀,孵化并利用间接连续离心法富集毛蚴,采用蛋白酶K-苯酚法提取毛蚴基因组DNA。登陆GenBank查询获得日本血吸虫保守序列18S小亚基单位核糖体脱氧核酸(18SrDNA)基因,利用引物设计软件PrimerPremier5.0和Oligo6自主设计一对引物,建立检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法。梯度稀释血吸虫毛蚴基因组DNA进行PCR方法的灵敏性试验,设置阴性对照,PCR产物通过电泳鉴定。结果 PCR扩增日本血吸虫毛蚴得到特异性DNA片段,片段长度为463bp,阴性对照组无扩增产物。PCR法可检测出日本血吸虫毛蚴DNA的最低浓度为62.5pg/μL。结论建立的检测日本血吸虫毛蚴PCR方法灵敏、特异,具有一定的预警作用。     

荧光实时定量PCR定量水体中日本血吸虫尾蚴方法的建立

摘要：目的 建立快速、高效、特异的定量水体中尾蚴的数量和检测水体中日本血吸虫尾蚴残余基因组DNA的方法,来评估水体受日本血吸虫尾蚴污染的程度。方法 根据日本血吸虫基因组DNA中的三个多拷贝序列Sjrh1.0（序列号：U92488.1）、18S小亚基单位核糖体核酸基因(18SrRNA)序列（序列号：AY157226.1）和逆转录转座子SjR2的G55A序列（G55A）（序列号：AF412221.1）,设计常规PCR引物和荧光PCR引物,比较选取较好的靶序列建立SYBR GreenI 实时定量PCR方法,绘制尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线,并对疫水中日本血吸虫尾蚴残余的基因组DNA进行检测。结果 尾蚴数的对数与Ct值的标准曲线有良好的线性关系,相关系数r2为0.9186,和重复实验的变异系数小于3%。结论 本方法特异性高,灵敏,可定量水体中尾蚴数,重复性好,对疫水检测有一定的预警作用。     

重组酶介导的隐孢子虫属特异性等温核酸扩增 方法的建立及评价

目的　建立一种可用于隐孢子虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增（RAA）方法,并对其检测敏感性和特异性进行评价。方法　以隐孢子虫属特异性18S rRNA核酸序列作为检测靶标,采用Amplfix软件设计、合成引物及荧光检测探针,构建并优化RAA荧光反应体系;分别以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其敏感性;分别以隐孢子虫卵囊、蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板进行RAA荧光法检测,以评价其特异性。结果　成功建立了隐孢子虫检测RAA法,该方法可在39 ℃、20 min内得到隐孢子虫属18S rRNA基因片段的有效扩增。以不同拷贝数的含18S rRNA靶序列的重组质粒、不同浓度隐孢子虫卵囊基因组DNA及不同数量隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板,该方法最低检出限分别为102拷贝/μL、1 pg/μL和1个/50 μL;以蓝氏贾第鞭毛虫包囊、日本血吸虫虫卵、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫虫卵、沙门氏菌、志贺氏菌基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于检测隐孢子虫卵囊DNA的RAA法,该方法操作简便、反应快速,敏感性和特异性均较好。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10 拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列，设计、合成、筛选特异性引物和探针，建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测敏感性；分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测特异性；通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增，初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法，其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板，该方法最低检出限为10 拷贝/μL；以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板，该方法最低检出限为3 pg/μL；以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板，检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本，具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的克隆

目的比较日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的差异。方法提取东方田鼠、SD大鼠、C57BL/6小鼠和KM鼠肝脏DNA,根据东方田鼠特异性DNA序列片段(GenBank登录号:AF277394)设计引物,PCR方法扩增以上4种鼠的基因组特异性DNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定特异条带,纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体,进行DNA序列分析。结果 PCR扩增东方田鼠、SD大鼠DNA分别得到520bp左右的特异扩增片段,同源性为99%。C57BL/6小鼠和KM鼠没有扩增出此特异片段。结论日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠之间特异性DNA序列有高度的同源性。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因的克隆及序列分析

[目的]分离日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区 (VL)基因并测定其序列。 [方法 ]根据鼠免疫球蛋白轻链可变区基因FR1和FR4序列的保守性 ,化学合成用于体外扩增Ig轻链可变区基因的数对引物。以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株基因组DNA为模板 ,扩增VL 基因 ,将其克隆入 pUC19载体 ,重组子用Sanger的双脱氧链终止法测定序列 ,将序列与GenBank中已发表的抗体序列比较。 [结果 ]VL 基因全长 318bp ,属鼠免疫球蛋白κ轻链第IV亚类 ,由种系基因V与Jκ4 重排而来。该VL 基因序列已被GenBank收录 (accessionNo AF2 0 6 72 0 )。 [结论 ]该VL 基因为日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链可变区基因。