白细胞介素-24及白细胞介素-12基因治疗小鼠黑色素瘤实验研究

[目的]研究重组质粒pEGFP-N1-白细胞介素(IL)-24基因及pGEG-IL-12基因单独应用与联合应用对小鼠黑色素瘤移植瘤的抑制作用及其机制.[方法]制备黑色素瘤B16细胞荷瘤小鼠模型,并随机分为5个组,分别向瘤体内注射给予脂质体包裹的基因重组质粒pEGFP-N1-IL-24(IL-24组),pEGFP-N1-IL-24和pGEG-IL-12(联合应用组),pGEG-IL-12(IL-12组),pEGFP-N1(空质粒组)及PBS(PBS组).每次给药前测量小鼠背部肿瘤的长径和短径,绘制肿瘤生长曲线.采用HE染色法观察各组肿瘤组织形态;RT-PCR法检测移植瘤组织中IL-24,IL-12,Bax,Bcl-2,VEGF,caspase-3及caspase-12mRNA的表达;Western Blot检测移植瘤组织中Bax,Bcl-2,VEGF,caspase-3及caspase-12蛋白的表达.[结果]肿瘤生长曲线观察结果表明,IL-24组、IL-12组及联合应用组肿瘤体积均明显小于空质粒组和PBS组(P<0.05),联合应用组肿瘤体积最小(P<0.05).HE染色结果显示,空质粒组多数细胞生长差,形态不规则,细胞皱缩,结构稀疏,细胞核溶解、变形,细胞成片坏死.RT-PCR检测结果表明,IL-24组和IL-12组分别有IL-24和IL-12基因mRNA表达,联合应用组同时有IL-24和IL-12基因mRNA表达,而空质粒组和PBS组均未见表达;IL-24组、IL-12组及联合应用组Bax基因mRNA表达水平均明显高于空质粒组和PBS组(P<0.05),联合应用组Bax基因mRNA的表达水平最高,而Bcl-2和VEGF基因mRNA的表达水平则显著降低(P<0.05).Western Blot检测结果表明,IL-24组、IL-12组及联合应用组Bax,caspase-3,caspase-12蛋白的表达水平均明显高于空质粒组和PBS组(P<0.05),联合应用组中Bax,caspase-3,caspase-12蛋白的表达水平最高,而Bcl-2和VEGF蛋白的表达水平则显著降低(P<0.05).[结论]IL-24和IL-12对荷瘤小鼠有治疗作用,二者联合应用治疗效果更强.     

IL-24对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑制作用

[目的]研究携带IL-24基因的真核表达质粒对小鼠黑色素瘤B16细胞的凋亡和体外增殖的影响.[方法]采用重组DNA技术构建含有IL-24基因的真核表达质粒pEGFP-N1-IL-24,用脂质体法将pEGFP-N1-IL-24转染B16细胞,用荧光显微镜观察其表达,在生物显微镜下观察细胞的形态学变化,用吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）法检测细胞凋亡,用MTT比色法检测B16细胞的体外增殖能力.[结果]荧光显微镜下观察到pEGFP-N1-IL-24可在B16细胞中表达;生物显微镜下显示转染IL-24基因的B16细胞皱缩、成团;AO/EB法检测显示转染IL-24的B16细胞核染色质着橘黄色或橙红色,并呈固缩状;MTT比色法显示IL-24明显抑制B16细胞的生长,与对照组相比较差异有统计学意义（P〈0.05）.[结论]外源性IL-24基因在体外对小鼠黑色素瘤B16细胞有显著的诱导凋亡和抑制增殖的作用.     

IL-24对人宫颈癌C33A细胞裸鼠移植瘤的治疗研究

目的利用重组质粒pDC316-hIL-24,探讨IL-24对人宫颈癌C33A细胞裸鼠移植瘤的生长及凋亡作用。方法 15只裸鼠腋窝处皮下接种人宫颈癌C33A细胞,建立宫颈癌荷瘤裸鼠模型。随机分为三组,用脂质体包裹pDC316-hIL24重组质粒、pDC316空质粒和磷酸盐缓冲液（PBS）,分别于瘤体内注射,比较各组移植瘤生长情况;处死裸鼠剥瘤称重,计算抑瘤率。通过RT-PCR检测IL-24转染至移植瘤内,常规HE染色观察组织形态学变化,免疫组化法检测移植瘤组织中Bax、Bcl-2的表达。结果⑴成功建立移植瘤模型,IL-24基因在C33A细胞中表达,重组质粒组移植瘤生长受到明显抑制,移植瘤体积和瘤重均明显小于空质粒组和PBS组（P〈0.05）,平均抑瘤率为36%（P〈0.05）,差异有统计学意义。后两组移植瘤体积和瘤重则无明显差异（P〉0.05）。⑵病理学见重组质粒组癌细胞有不同程度的坏死灶,坏死区周围可见凋亡细胞,核碎裂等。⑶免疫组化结果示重组质粒组Bcl-2表达下调,Bax表达上调,于空质粒组和PBS组差异有统计学意义（P〈0.05）,后两组则无明显差异（P〉0.05）。结论重组质粒pDC316-hIL-24对裸鼠人宫颈癌移植瘤的生长具有显著抑制作用,促进肿瘤细胞凋亡,为宫颈癌基因治疗的提供理论依据和实验基础。     

重组质粒hTERT-siRNA对胰腺癌细胞移植瘤hTERT相关基因及蛋白表达的影响

目的探讨重组质粒pSilencer4.1CMV neo-hTERT-siRNA对胰腺癌细胞BxPC-3裸鼠皮下移植瘤hTERT相关基因及蛋白表达的影响.方法建立人原发性胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为4组：（1）肿瘤对照组,未作任何处理;（2）空载组,即pSilencer4.1-CMV neo空质粒组;（3）T1组,即重组质粒pSilencer4.1-CMV neo-hTERT1-siRNA组;（4）T2组,即重组质粒pSilencer4.1-CMV neo-hTERT2-siRNA组）.荷瘤裸鼠分组处理30d后,RT-PCR检测各组瘤体中hTERT、Bcl-2、Bax mRNA的表达,免疫组织化学检测各组瘤体中Bcl-2、Bax、p53、VEGF、端粒酶蛋白表达,Western blot检测各组瘤体中端粒酶蛋白表达情况.结果 T1组和T2组hTERT和Bcl-2 mRNA表达较肿瘤对照组和空载组明显降低,BaxmRNA表达明显升高（P〈0.01）.与肿瘤对照组和空载组比较,T1组和T2组Bcl-2 Telomerase、p53和VEGF蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达明显升高（P〈0.01）.结论 （1）重组质粒T1和T2能够下调裸鼠移植瘤体内抗凋亡基因hTERT mRNA、Bcl-2 mRNA和蛋白、p53和端粒酶蛋白表达水平,上调促凋亡基因Bax mRNA和蛋白表达水平,其抗胰腺癌作用可能与促进胰腺癌细胞凋亡有关.（2）重组质粒T1和T2能够显著下调裸鼠移植瘤体内VEGF蛋白表达水平,可能具有抑制肿瘤血管生成的作用。     

C57BL/6J小鼠及鸡胚B16细胞移植瘤血管生成拟态的观察及其MMP7和MMP9的表达

[目的]探讨黑色素瘤B16细胞鸡胚和小鼠移植瘤组织中MMP7和MMP9的表达与血管生成拟态形成的关系,初步探讨宿主微环境对肿瘤细胞的影响.[方法]分别建立黑色素瘤B16细胞鸡胚和小鼠移植瘤模型,通过HE切片观察血管生成拟态的分布情况,利用免疫组化方法检测MMP7和MMP9的表达.[结果]B16细胞鸡胚和小鼠移植瘤组织中均可见血管生成拟态,并且前者显著多于后者.鸡胚移植瘤组织和小鼠移植瘤组织中MMP7的阳性细胞百分比分别为34.55±8.98和15.27±4.21,前者显著高于后者(P＜0.01),MMP9的阳性细胞百分比分别为16.38±3.34和10.53±1.95,前者显著高于后者(P＜0.01).[结论]鸡胚移植瘤可用于研究肿瘤生长早期的生物学行为,MMP7和MMP9的表达可能与肿瘤生长早期血管生成拟态的形成有关.     

mtHSP70/HSV-tk 重组沙门菌瘤内注射抗小鼠黑色素瘤实验研究

研究携带结核杆菌热休克蛋白70（mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70, mtHSP70）、人单纯疱疹病毒－胸苷激酶（herpes simplex virus-thymidine kinase ,HSV-TK）双基因的重组沙门菌瘤内注射抗小鼠黑色素瘤的抑瘤效应及机制。方法 将PCMV-mtHSP70-IRES-TK双基因真核共表达质粒电穿孔至减毒沙门菌SL7207,构建重组沙门菌SL7207/PCMV-mtHSP70-IRES-TK,体外感染小鼠黑色素瘤细胞株 B16,观察重组菌对 B16 细胞的侵袭性和 mtHSP70/HSV-TK 双基因的表达;构建小鼠黑色素动物模型,瘤内注射重组沙门菌观察其抑瘤效应,流式细胞术检测治疗后小鼠外周血CD3+\CD4+和CD3+\CD8+T 细胞 NK 细胞的分布,Elisa检测瘤组织中IFN-r的含量。结果 体外实验表明重组沙门菌侵入B16细胞中并表达目的基因;瘤内注射重组沙门菌,实验组抑瘤率显著高于对照组,实验组外周血CD8+T淋巴细胞及瘤组织内IFN-r含量显著高于对照组。结论 减毒沙门菌携带的mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒瘤内注射对B16肿瘤细胞具有侵袭性且能引起强烈的细胞毒性T细胞反应,能显著抑制肿瘤的生长。     

GLS/IL-12对黑色素瘤细胞B16的增殖及凋亡的影响

目的:体外检测人GLS活性肽和小鼠IL-12基因的共表达产物对黑色素瘤细胞B16的增殖及凋亡的影响.方法:用脂质体将含GLS活性肽和小鼠IL-12基因的共表达质粒转染黑色素瘤细胞B16并用RT-PCR检测其表达,再用MTT试验、Hoechst33258染色、AO/EB染色和Annexin V-FITC流式细胞分析检测基因表达产物对B16细胞的增殖抑制与促凋亡作用.结果:GLS活性肽和小鼠IL-12基因能在B16细胞中表达,MTT法观察到表达产物对B16有明显的细胞增殖抑制作用,经Hoechst33258染色、AO/EB染色和流式细胞分析观察到细胞核浓缩、深染、细胞膜改变等凋亡特征,凋亡指数明显高于对照组.结论:GLS活性肽和小鼠IL-12基因的共表达产物对黑色素瘤细胞B16具有明显的增殖抑制作用及促凋亡作用.     

pEGFP-IL-24对B16F0细胞抑制效应的实验研究

目的:构建IL-24真核表达质粒,研究其体内外表达对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-IL-24。用脂质体法将重组质粒及空载体体外转染B16F0细胞后,经激光扫描共聚焦显微镜观察其表达,用MTT法检测B16F0细胞的体外增殖能力。用小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤生长的抑制。结果:pEGFP-IL-24转染B16F0细胞后,LSM可观察到其表达。IL-24基因转染的B16F0细胞体外增殖能力明显受到抑制。转染IL-24的B16F0细胞体内致瘤率降低。结论:IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。IL-24基因转染的肿瘤细胞体内生长能力显著降低。     

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

[目的]构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的重组腺病毒载体并观察其在C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础.[方法]将VEGF165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,获得重组质粒pAdTrack VEGF165,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV VEGF165,转化体外培养的C17.2神经干细胞.通过RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot法检测其在C17.2神经干细胞中的表达.[结果]重组腺病毒AdCMV VEGF165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/mL.病毒上清液经ELISA检测VEGF165表达的量为(1135±138)ng/L.重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达.[结论]成功构建pAd VEGF165重组腺病毒,获得了稳定表达VEGF165的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础.     

软坚散结方对肾透明细胞癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的:探究软坚散结方对肾透明细胞癌(ccRCC)细胞(7860细胞系)裸鼠移植瘤生长抑制作用及对肿瘤组织Notch及凋亡信号通路相关基因蛋白的影响。方法:通过成功建立7860细胞裸鼠移植瘤模型,分为模型组、DAPT组(γ-secretase抑制剂)、软坚散结方组,分别给药4周后,检测各组瘤重,瘤体积;HE染色观察肿瘤细胞的形态变化;免疫组化检测肿瘤组织中Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表达;RT-PCR检测Notch1、Bcl-2、Bax mRNA含量。结果:与模型组比较,软坚散结方组、DAPT组均可显著降低裸鼠体内肿瘤质量,缩小肿瘤体积,降低Notch1、Bcl-2 mRNA表达和Notch1、NICD、Bcl-2阳性率,升高Bax表达及阳性率(P0.05);与DAPT组比较,软坚散结方组可降低裸鼠体内肿瘤质量、瘤体积、Bcl-2表达及NICD、Bcl-2性率,升高Bax表达及阳性率(P0.05),差异有统计学意义。结论:软坚散结方可抑制7860细胞裸鼠移植瘤生长,其机制可能与靶向作用Notch信号通路从而诱导细胞凋亡相关。     

紫杉醇对黑色素瘤细胞Bcl-2／Bax基因和蛋白水平影响及机制研究

目的检测紫杉醇对黑色素瘤细胞B16-F10细胞凋亡相关因子Bcl-2／Bax基因和蛋白水平的影响,探讨紫杉醇治疗黑色素瘤的作用机制。方法采用实时荧光定量PCR和westernblot法检测紫杉醇对B16一F10细胞Bcl-2／Bax基因和蛋白水平的改变,以p—actin作为内参照。结果4pM紫杉醇对B16一F10细胞24h的Bcl-2／Bax基因和蛋白水平表现出明显的改变。与对照组相比,紫杉醇组Bcl-2基因mRNA水平相对量由（0．43土0．09）下降到（0．27士0．08）,两组有显著性差异（P〈0．05）。Bax基因mRNA水平相对量由（O．25士0．06）增加到（O．57士0．05）,两组差异有统计学意义（Pd0．01）。紫杉醇时B16-F10细胞Bcl-2蛋白相对表达量由（O．64士0．03）下降到（0．35士0．04）,两组差异有统计学意义（P〈O．05）。Bax蛋白的相对表达量由（O．41士0．02）增加到（O．73±0．03）,两组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论紫杉醇对可通过改变Bcl-2／Bax基因和蛋白水平发挥促进凋亡的作用。紫杉醇可能作为黑色素瘤治疗的策略之一。     

急性炎症对黑色素瘤血管生成的影响作用研究

目的：研究急性炎症对黑色素瘤血管生成的影响。方法：C57BL小鼠,构建B16F10小鼠黑色素瘤动物模型,待肿瘤生长至0．8cm×0．8cm×0．8cm时构建伤口模型,分为单纯肿瘤组、同侧伤口＋肿瘤组（局部组）和对侧伤口＋肿瘤组（全身组）,比较肿瘤微血管密度（MVD）,免疫组织化学染色检测肿瘤组织VEGF的表达。结果：局部组和全身组肿瘤微血管密度明显低于对照组,结果具有统计学意义（P〈0．05）;VEGF阳性表达率在局部组和全身组均低于对照组（P〈0．05）。结论：急性炎症可影响肿瘤组织VEGF的表达,明显抑制黑色素瘤血管生成。     

白血病细胞株K562中HIF1-α的表达及其对下游基因的影响

目的 探讨白血病细胞株K562中低氧诱导因子1-α（HIF-1α）表达的增加对下游靶基因的影响及意义。方法氯化钴（CoCl2）做化学缺氧诱导剂,加入K562细胞培养基,分别培养0、4、8、16h。Real—TimeRT—PCR及Western印迹法分别检测剧F-1αrnRNA和蛋白水平的表达。Real—TimeRT—PCR检测不同时间HIF-1α下游靶基因VEGF、MDR1／MDR3、survivin、Bcl-2、Caspase-3、Bax等的表达。分析HrF-1α表达的变化对下游基因转录活性的影响和意义。结果随着CoCl2作用时间的增加,K562细胞H伊一JdmRNA水平表达略有增加,但变化不大（P〉0．05）,蛋白水平增加明显。下游VEGF、MDR1／MDR3、survivin、Bcl-2转录活性增加（P〈0．05）,而Bax、Caspase一3表达先增加后减少。结论CoCl2主要增加K562细胞株HIF-1α蛋白的表达。HIF-1α蛋白使VEGF、MDR1／MDR3、survivin、Bcl-2等促肿瘤存活基因的转录活性增加,而最终减少了Caspase-3、Bax等促肿瘤细胞凋亡基因的表达。因此．HIF-1α可能是调控白血病进展的关键调节因子。     

内皮抑素对人肝癌细胞HepG2 VEGF表达的影响及对血管生成的抑制作用

目的探讨内皮抑素(Endostatin)对体外条件下肝癌细胞HepG2血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)表达的影响以及体内条件抑制血管生成的作用。方法采用不同浓度的重组人血管内皮抑制素恩度(Endostar,YH-16)体外作用于肝癌细胞株HepG2,采用RT-PCR和Western blot法检测其VEGF的表达水平。并将肿瘤细胞接种于裸鼠背部皮下,形成裸鼠移植瘤模型,采用瘤周皮下注射的办法将不同浓度的恩度作用于瘤体,通过免疫组化以及超声探测仪检测,观察其对移植瘤生长以及微血管密度的影响。结果 RT-PCR和Western blot结果显示,恩度能在体外抑制肝癌细胞VEGF的表达,且其表达随恩度浓度的增加而呈"V"字型变化,当恩度浓度为25μg/mL时,对肝癌细胞VEGF表达的抑制作用最为明显(P<0.05)。不同浓度的恩度作用于裸鼠移植瘤14d后,瘤体的生长速度均较阴性对照组减慢,且部分瘤体发生退缩(P<0.05),25mg/kg组瘤体的抑制最为明显,瘤体体积为注射前的81.98%;免疫组织化学检测结果提示恩度在体内条件下能抑制移植瘤内肿瘤细胞VEGF的表达,其中25mg/kg组阳性细胞数<30%为阴性(-),并且恩度能抑制瘤体内微血管的生成。结论恩度可以在体外抑制肝癌细胞株HepG2的VEGF表达,且可有效抑制裸鼠移植瘤内新生血管的生长。     

茉莉酸甲酯诱导人肝癌细胞HepG2凋亡作用机制的实验研究

目的探讨茉莉酸甲酯诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡的作用机制.方法琼脂糖凝胶电泳检测HepG2细胞凋亡,RT-PCR检测HepG2细胞中Bcl-2、BaxmRNA表达,免疫细胞化学检测HepG2细胞Bcl-2、Bax蛋白表达.结果MeJA作用HepG2细胞48h后：DNA琼脂糖凝胶电泳可见明显典型＂梯＂状条带;细胞Bcl-2mRNA表达水平明显下降（P〈0.05）而BaxmRNA表达水平明显增高（P〈0.05）;Bcl-2蛋白在胞浆中表达水平明显降低（P〈0.01）而Bax蛋白表达水平显著增加（P〈0.01）.结论茉莉酸甲酯通过降低抑凋亡相关基因Bcl-2mRNA及蛋白的表达,上调促凋亡相关基因BaxmRNA及蛋白的表达,从而诱导HepG2细胞凋亡的发生.     

Ad-IL-24抑制乳腺癌生长的体外实验研究

目的 研究腺病毒介导的IL-24基因(Ad-IL-24)表达对乳腺癌的生长抑制作用.方法 将扩增的Ad-IL-24腺病毒感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,用RT-PCR法、Westernblot法检测IL-24基因在肿瘤细胞中的转录和表达;MTT法和FCM检测IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的生长抑制和凋亡率;半定量RT-PCR检测IL-24基因的表达对乳腺癌细胞的凋亡相关基因Bax、Bcl-2及Survivin转录的影响;ELISA法检测VEGF、Ang-1的分泌水平.结果 IL-24基因可在MDA-MB-231细胞中成功转录及表达,并对乳腺癌细胞增殖有明显抑制作用,并能引起细胞凋亡,其凋亡机制可能与Bax/Bcl-2比值升高、Survivin降低有关;VEGF、Ang-1表达下降.结论 腺病毒介导的IL-24基因在体外可明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长,诱导其凋亡,其机制可能与下调Survivin、VEGF、Ang-1,上调Bax的基因表达水平有关,该研究可为乳腺癌的基因治疗提供一定实验依据.     

白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究

目的探讨白介素-24基因转染对胶质瘤生长的影响。方法将载有人白介素-24eDNA的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胶质瘤细胞系U251,体外观察Ad5F35-IL24对该细胞系生长的影响;建立人胶质瘤动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤生长情况;用流式细胞仪检测其凋亡和Bax／Bel-2的表达情况。结果Ad5F35-IL24感染U251细胞和肿瘤组织后,IL-24蛋白高表达,U251细胞和组织的生长受到明显抑制,其凋亡率明显升高,Bax／Bel-2也明显升高。结论白介素-24具有抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5P35-IL24转导白介素-24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。     

NF-κB特异性抑制剂PDTC对鼠黑素瘤B16细胞增殖及VEGF表达的影响

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对鼠黑素瘤B16细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:不同浓度的PDTC作用于B16细胞不同时间后,MTT法测定其对B16细胞增殖的抑制率,ELISA检测PDTC作用下B16细胞VEGF的表达情况。结果:经PDTC处理的实验组,肿瘤细胞增殖活性明显受到抑制(P0.01);与对照组相比,PDTC作用后B16细胞VEGF表达降低(P0.01)。结论:PDTC具有显著抑制鼠黑素瘤B16细胞生长及VEGF表达的作用,是一种有潜力的抑制黑素瘤增殖的药物。