hdll1~(ext)-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 :构建人dll1ext(humandelta like1extracellularregion) Fc融合蛋白的真核表达载体pEF BOSneo hdll1ext Fc,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta like1胞外段 ,通过DNA重组构建真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。瞬时转染COS 7细胞 ,应用RT PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA ,检测融合蛋白的表达。结果 :成功地构建了真核表达载体 pEF BOSneo hdll1ext Fc。以重组载体转染COS 7细胞后 ,RT PCR结果显示delta like1胞外段与IgG1Fc在mRNA水平正确拼接 ;细胞免疫荧光染色呈阳性反应 ;夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论 :成功地扩增了人delta like1胞外段 ,构建了 pEF BOSneo hdll1ext Fc真核表达载体 ,并在COS 7细胞中获得表达 ,为下一步研究奠定了基础     

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。     

hdll1ext-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人dlll^ext(human delta-likel extraeellular region)-Fe融合蛋白的真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc，并在COS-7细胞中进行表达。方法：从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta-likel胞外段，通过DNA重组构建真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fe。瞬时转染COS-7细胞，应用RT-PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc。以重组载体转染COS-7细胞后，RT-PCR结果显示delta-likel胞外段与IgG1 Fe在mRNA水平正确拼接；细胞免疫荧光染色呈阳性反应；夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地扩增了人delta-likel胞外段，构建了pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc真核表达载体，并在COS-7细胞中获得表达，为下一步研究奠定了基础。     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

IgG Fab—BPI融合蛋白真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建抗抗LPS Fab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法 通过RT－PCR,获得广谱抗LPSmAbC3A3（IgG)的Fd和完整轻链（LC）cDNA片段。在分别构建了pcDCNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPI N端抗LPS活性中心的180bpDNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白（FB）真核表达载体。将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGH polyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞。结果 序列测定表明,重组质粒构建正确。pcDNA3－FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mRNA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗k轻链和抗BPI抗体反应的慢白区带的Mr均为60000左右。交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性。结论 成功地在CHO细胞中表达出了抗LPS Fab-BPI(FB)融合蛋白。FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂。     

HSV-1gC糖蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建单纯疱疹病毒1型(HSV-1)囊膜糖蛋白C(gC)哺乳动物表达载体pCI-mCMV-gC-1-IRES-DHFR-L22R,实现其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中的稳定表达.方法:利用基因重组技术构建同时克隆有gC-1基因和中国仓鼠二氢叶酸还原(DHFR-L22R)基因的真核表达载体pCI-mCMV-gC-1-IRES-DHFR-L22R,按Lipofectamine(TM)2000说明书转染野生型CHO-K1细胞,在G418和氨甲喋呤(MTX)双筛选压力下筛选稳定表达细胞株,Slot blot方法测定重组蛋白的表达,并用His-Ni琼脂糖填料进行目的蛋白纯化,纯化后West-ern blot检测.结果:成功构建了真核表达载体pCI-mCMV-gC-1-IRES-DHFR-L22R.经过两轮筛选获得稳定表达HSV-1型邪基因的细胞系,Western blot成功检测到目的蛋白.结论:HSV-1 gC在CHO-K1细胞中成功表达,并具有良好的特异性结合活性,为进一步的实验研究和临床应用提供了基础.     

人生长激素基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人生长激素的真核细胞表达载体,测定并分析目的 基因序列.方法 用PCR方法扩增出人生长激素基因,连接至T克隆载体,然后分别亚克隆至真核细胞表达载体pCDNA3.1、pCEP4中.使用DNA ssist软件分析序列.结果 所构建真核表达载体的酶切鉴定、PCR鉴定、测序鉴定均正确.结论 成功构建出多个人生长激素基因真核细胞表达载体,验证了基因序列的正确性,为下一步基因治疗研究打下基础.     

人重组pMAGE-A1/EGFP真核表达质粒的构建与表达

目的　特异克隆MAGE A1开放读码框基因,构建以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的包含MAGE A1的真核表达载体并转染人PBMC来源DC细胞。方法　根据MAGE A1特征序列设计PCR扩增引物,从Mel 5 2 6中扩增MAGE A1基因开放读码框,并克隆至pIRES EGFP中,构建人重组pMAGE A1 EGFP真核表达质粒。利用电转染方法将该重组质粒转入人外周血来源DC细胞并检测MAGE A1和EGFP的表达情况。结果　成功构建真核表达质粒pMAGE A1 EGFP ,转染人PBMC来源DC细胞并检测到MAGE A1和EGFP表达,两者表达率分别为(8.8±0 .9) %和(8.4 7±0 .78) % ,无统计学差异。结论　成功构建人重组真核表达质粒pMAGE A1 EGFP ,为开展MAGE A1为基础的免疫治疗提供有利的分子生物学工具。     

大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建大鼠CD36真核表达载体,并在293T细胞中表达.方法:应用RT-PCR技术,从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中,获得CD36基因编码序列片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,通过荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达.结果:酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36构建成功,荧光显微镜及Western blot确认目的基因序列在293T细胞中过表达.结论:成功构建大鼠CD36基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36,并在293T细胞中过表达.     

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

CD80-IgG1 Fc融合蛋白修饰的HepG2细胞对淋巴细胞抗肿瘤免疫的影响

目的：探讨CD80-IgG1 Fc段融合蛋白修饰的HepG2细胞对淋巴细胞抗肿瘤免疫的影响。方法：应用福建省临床免疫研究所构建的CD80-IgG1 Fc段融合蛋白，修饰肝癌细胞株HepG2细胞，用流式细胞术检测修饰的HepG2细胞上CD80的表达。将修饰的HepG2细胞与健康人外周血淋巴细胞混合后进行培养，分别应用MTT比色法、乳酸脱氢酶释放试验；检测经CD80-IgG1 Fc段融合蛋白修饰的HepG2细胞对外周血淋巴细胞增殖及其细胞毒性的影响。结果：CD80-IgG1Fc段融合蛋白可有效地结合于HepG2细胞膜上，结合的量在一定范围内与融合蛋白的浓度呈正相关（P＜0．05）。融合蛋白修饰的HepG2细胞可明显刺激外周血淋巴细胞活化增殖并增强CTL的细胞毒活性（P＜0．05）。结论：CD80在抗肿瘤免疫中起着重要作用，用CD80-IgG1Fc段融合蛋白修饰的HepG2肿瘤细胞能明显增强淋巴细胞的特异性抗肿瘤免疫，为CD80用于肿瘤免疫治疗的研究提供了实验依据.     

CD80融合蛋白修饰的H22细胞激发抗肿瘤免疫

目的 探讨CD80-IgG1 Fc段融合蛋白修饰的H22细胞对淋巴细胞抗肿瘤免疫的影响.方法 应用福建省临床免疫研究所构建的CD80-IgG1 Fc段融合蛋白,修饰小鼠肝癌细胞株H22细胞,用流式细胞术检测修饰的H22细胞上CD80的表达.将修饰的H22细胞与小鼠脾细胞悬液混合后进行培养,分别应用MTT比色法、乳酸脱氢酶释放试验,检测经CD80-IgG1Fc段融合蛋白修饰的H22细胞对脾淋巴细胞增殖及其细胞毒性的影响.结果 CD80-IgG1 Fc段融合蛋白可有效地结合于H22细胞膜上(P＜0.05),融合蛋白修饰的H22细胞可明显刺激脾淋巴细胞活化增殖并增强CTL的细胞毒活性(P＜0.05).结论 CD80在抗肿瘤免疫中起着重要作用,用CD80-IgG1Fc段融合蛋白修饰的H22细胞能明显增强淋巴细胞的特异性抗肿瘤免疫,为CD80用于肿瘤免疫治疗的研究提供了实验依据,为下一步体内免疫治疗肿瘤奠定了基础.     

肝癌靶向性SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定

目的:构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体。方法:首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttleCMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2。将AFP增强子、启动子、SEA及CD80基因分别从已构建的pKSEP载体和pMD18TBIS载体上,分别亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy1共转化E.coliBJ5183。以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepa16和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3。采用间接免疫荧光法,激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达。采用3H掺入法检测膜表达的SEA诱导淋巴细胞增殖的活性。结果:以制备的重组腺病毒感染肿瘤细胞后,SEA和CD80能够靶向性地共表达在高表达AFP的Hepa16细胞膜上,而在不表达AFP的B16、NIH3T3细胞膜上不表达。结论:成功地构建肝癌靶向性SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究SEA和CD80在肝癌靶向基因治疗中的联合应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础。     

Construction of the recombinant expression vector for CD80-IgG fusion gene and its expression in Chinese hamster ovary cells

Itiswellestablishedthatoptimalactivationof na veTcellsrequiressignalingthroughtheT cell receptoraswellasthroughothercostimulatorypathways.Na veTcellswillbecomenonrespons ive,anergicorapoptoticifthetumorantigenispr esentedtothemwithoutthecostimulatorysignal,whichmakestumorcellsescapefromtheimmuno surveillance.Oneofthemostimportantcostimula torysignalsofthiskindcanbeprovidedbythein teractionofB7.1(CD80)onantigen presenting cells(APC)withCD28onTcells.Acutemyelogenousleukemia(AML)cellsarenot…     

人CD40-IgG1Fc段融合蛋白对EBV转化的B细胞凋亡的影响

目的 探讨人CD40-IgG1Fc段融合蛋白对EB病毒(EBV)转化的B淋巴细胞在细胞生长及凋亡方面的影响.方法 应用流式细胞术检测EBV转化的B淋巴细胞膜表面异位表达CD40L;应用本研究所构建的CD40-IgG1Fc段融合蛋白CHO稳定表达株的培养上清与EBV转化的B淋巴细胞共孵育,通过MTT法检测B细胞的生长变化,吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)双染色法和DNA ladder法检测融合蛋白对B细胞凋亡的影响.结果 EBV转化的B细胞膜表面异位表达CD40L;CD40IgG1Fc段融合蛋白可有效抑制EB病毒转化的B细胞生长,抑制程度与蛋白浓度呈正相关;AO与EB双染色法及DNA ladder法均检测到B细胞凋亡明显增加,与共孵育时间呈正相关.结论 CD40-CD40L的相互作用是EBV转化的B细胞异常激活的重要机制,人CD40-IgG1Fc段融合蛋白能阻断CD40-CD40L的相互作用,抑制EB病毒转化的B细胞的生长,促进其凋亡,为下一步自身免疫性疾病的临床实验治疗奠定了基础.     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。     

小鼠TERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达鉴定

目的:构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中的表达情况。方法:采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染肝癌细胞系Hepa1-6和成纤维细胞系NIH3T3。采用免疫荧光染色法检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况。结果:重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS感染的Hepa1-6肝癌细胞膜上能够共表达SEA和CD80;而病毒感染的NIH3T3细胞不能表达SEA和CD80。结论:成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在肝癌细胞中的靶向表达,为进一步研究肝癌的靶向基因治疗奠定了基础。     

Cloning and expression of human TNFR (P55)-IgG Fc fusion protein in eukaryotic cells]

OBJECTIVE: To express soluble biologically active TNF receptor protein in eukaryotic cells, which can inhibit cytotoxic activity of TNF. METHODS: PCR amplified the extra-cellular region of TNF receptor P55 and IgG Fc gene. Then the two were linked through an oligomer encoding a thrombin-sensitive peptide linker and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+). The eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1/TI was then transfected to the mammalian cell line COS7 and BHK. Using the G418 system, BHK cell clones were selected and can continuously secrete biological protein in large amount. RESULTS: The expressed protein was fused with IgG Fc and secreted into the cell culture supernatant. It has good antigenicity and binding ability to TNF. It can also inhibit the cytotoxic activity of TNF on L929 cell. CONCLUSION: The TNFR-IgG Fc fusion protein expressed in eukaryotic cells has biological activities of human TNF receptor P55.