Nogo受体的实验研究进展

脊髓损伤后轴突的再生极差,神经功能难以恢复。促进脊髓损伤后的轴突再生,一直是研究脊髓损伤修复的重要实验内容。目前,大多数学者认为中枢神经系统（CNS）轴突并不是不能再生,外部微环境中的抑制因子可能发挥更为重要的抑制作用。研究表明,脊髓损伤后髓磷脂相关抑制物的作用是抑制中枢神经轴突再生的关键因素之一。NgR是CNS3种髓磷脂相关轴突生长抑制蛋白Nogo-A、髓磷脂相关糖蛋白（MAG,myelin-associated glycoprotein）、少突胶质细胞-髓磷脂糖蛋白（OMgp,oligodendrocyte-myelin glycoprotein）共同作用的集中点,近期得到学术界的广泛关注。     

Nogo受体特异性RNA干扰载体合成

目的构建表达Nogo受体(NgR)特异性siRNA199的重组质粒。方法按照Elbashir等设计原则和siRNA表达载体的要求,在合成、筛选出基因沉默效率较高的siRNA199基础上,设计带有BamH I、HindⅢ酶切黏性末靖、终止识别序列和LOOP环的shRNA,并将其克隆入载体pRNAT-U6．1/Neo,构建成NgR特异siRNA199重组质粒,然后进行酶切鉴定及基因测序。结果设计的shRNA成功克隆人载体pRNAT-U6．1/Neo,构建成NgR特异siRNA199重组质粒,酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。结论重组质粒构建成功,为构建病毒载体及观察重组质粒抑制大鼠NgR基因的表达对脊髓损伤的修复作用奠定了基础。     

大鼠脊髓损伤后胶质细胞生长因子的mRNA表达变化

目的：探讨胶质细胞牛长凼子（glial growth factor，GGF）在大鼠脊髓损伤后的表达变化及意义。方法：采川改良Allen’s脊髓损伤打击模型，用逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测胚胎大鼠脊髓内、正常成年大鼠脊髓内以及脊髓损伤后不同时间点伤段脊髓组织中GGF的mRNA表达结果：GGF在成年大鼠正常脊髓内低水平表达，在胚胎脊髓中高水平表达。大鼠脊髓损伤后GGF的mRNA表达持续降低，在脊髓损伤后5d达到最低峰，之后GGF的mRNA表达可逐渐恢复。结论：GGF在脊髓乍长发育中起重要作用：大鼠脊髓损伤后GGF的表达降低可能与脊髓损伤后少突胶质细胞大量死亡或凋亡有关．与脊髓损伤后轴突无法再生、脱髓鞘的髓鞘再生困难有关。     

脊髓损伤的Nogo受体干预

髓磷脂相关抑制物作用是抑制中枢神经（CNS）元轴突再生的关键因素之一。Nogo-A、髓磷脂相关糖蛋白（myelin-associated glycoprotein,MAG）、少突胶质细胞-髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp）与Nogo受体（NgR）结合具有抑制成熟中枢神经元轴突再生及诱导生长锥溃变的作用。NgR是CNS三种髓磷脂相关轴突生长抑制蛋白Nogo-A、MAG、Omgp的共同作用的靶点,干预NgR可以同时影响Nogo-A、MAG、Omgp对轴突生长的抑制作用。     

siRNA干扰大鼠神经元Nogo受体mRNA 表达的时程研究

目的：观察大鼠Nogo受体（NgR）特异性小于扰RNA（small interfering RNA，siRNA）在原代神经元干扰其mRNA表达的时程效果。方法：体外培养大鼠原代皮层和海马细胞，应用阳离子脂质体转染试剂转染针对2个基因片段（199和964位点）的大鼠NgR特异性siRNA和对照siRNA，分别于转染后24h、48h、72h和96h，应用文时荧光定量PCR检测NgRmRNA表达情况。结果：2对siRNA（siNgRl99和siNgR964）均能够下调靶基因mRNA的表达水平，24h、48h、72h和96h，NgR mRNA表达分别为对照siRNA组的38．12％、12.47％、3．96％、18.4％（siNgR199）和49．54％、24．25％、13．17％、37．93％（siNgR964），与对照siRNA组比较有统计学意义（P〈0．05）。结论：NgR特异性siRNA能够在原代皮层和海马细胞下凋靶基因mRNA的表达水平．且基因沉默效果存转染后3d最显著，     

慢病毒介导RNA干扰Nogo受体基因治疗脊髓损伤的实验研究

目的 观察慢病毒介导RNA干扰大鼠神经元Nogo受体(NgR)基因表达对脊髓损伤的修复作用.方法 将前期实验中构建好的针对NgR的特异性小干扰RNA系列siNgR199慢病毒重组体,按感染复数=3体外转染已培养好的大鼠皮层神经元细胞.荧光电镜观察慢病毒重组体的转染效率,采用实时荧光定量PCR检测NgR基因沉默效率,验证慢病毒重组体的有效性.建立大鼠重度脊髓损伤模型,大鼠分组后分别于大脑皮层运动区注射生理盐水、慢病毒重组体,采用BBB评分法观测大鼠后肢运动恢复情况,采用神经示踪法观察脊髓损伤区神经纤维生长情况.结果 慢病毒重组体体外转染神经元细胞的效率＞99%,NgR基因沉默效率为61%.大鼠模型给药后8周,慢病毒重组体组大鼠脊髓损伤区可观察到神经纤维生长通过,而生理盐水组大鼠脊髓损伤区未见神经纤维生长通过,BBB评分结果提示慢病毒重组体组大鼠后肢运动功能恢复优于生理盐水组(P＜0.01).结论 慢病毒siNgR199重组体能够促进脊髓损伤区神经纤维的生长,在一定程度上促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复.     

轴突生长抑制因子的实验研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI) 的修复现在依然是世界性难题,SCI后局部微环境中存在抑制轴突生长的因子。研究表明,髓磷脂相关抑制因子（myelinassociated inhibitor,MAI）是脊髓轴突再生的关键抑制因素,主要包括轴突生长抑制蛋白 (neurite outgrowth inhibitor ,Nogo)、髓磷脂相关糖蛋白（myelinassociated glycoprotein,MAG）和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp）,本文初步探讨该类因子及其受体以及其相互作用机制。     

轴突生长抑制因子的实验研究进展

脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的修复现在依然是世界性难题,SCI后局部微环境中存在抑制轴突生长的因子。研究表明,髓磷脂相关抑制因子（myelin-associated inhibitor,MAI）是脊髓轴突再生的关键抑制因素,主要包括轴突生长抑制蛋白（neurite outgrowth inhibitor,Nogo）、     

Nogo/NgR网状通路干预治疗脊髓损伤研究进展

目前,脊髓损伤的治疗仍是临床医学尚未解决的难题之一,由于伤后脊髓轴突再生困难,患者很难得到有效地治疗。研究证明中枢神经系统轴突再生困难可能与胶质瘢痕和微环境中的抑制因子有关,而后者可能发挥更为重要的抑制作用。     

神经内分泌分化对前列腺癌细胞生长及雄激素受体表达影响的实验研究

目的探讨神经内分泌分化对前列腺癌细胞生长的作用及对雄激素受体表达的影响。方法建立神经内分泌分化的前列腺癌细胞模型PC3MNE和LNCaPNE;采用甲基噻唑基四唑(MTT)试验观察其调节前列腺癌细胞生长的作用[以吸光度值(A)表示];采用逆转录聚合酶链反应和Western杂交方法检测LNCaPNE对LNCaP细胞雄激素受体表达的影响。结果PC3MNE的培养上清液可促进PC3M细胞的生长(A值在培养24h为034±018与050±009,48h为038±016与057±009,72h为038±015与055±005,P均<005);在有雄激素时,LNCaPNE的培养上清液不促进LNCaP细胞的生长,对其雄激素受体的表达也没有显著影响;去除雄激素后,LNCaPNE的培养上清液可促进LNCaP细胞的生长,并能下调其雄激素受体的表达(P均<005)。结论在雄激素阻断后,神经内分泌分化的前列腺癌细胞能以旁分泌的方式支持其他前列腺癌细胞生长,降低其雄激素受体的表达。     

强啡肽对大鼠行为学和脊髓组织学改变的影响及受体机制

目的探明强啡肽(Dyn)对脊髓的损伤效应及其受体机制。方法观测大鼠鞘内注射DynA(1-13)或联合注射Kappa阿片受体拮抗剂nor-BNI或兴奋性氨基酸(EAA)的NMDA受体拮抗剂MK-801后的运动功能和脊髓病理学变化。结果注射30nmolDyn组3d时,Tarlov运动功能评分下降,脊髓前角神经元数目减少,GFAP阳性神经胶质细胞数轻度增生。14d时,Tarlov运动功能评分未恢复,神经胶质细胞增生明显。而鞘内联合注射100nmol nor-BNI、100nmol MK-801后3d时与单纯Dyn组结果相似,14d时Tarlov运动功能评分明显恢复,脊髓前角神经元数目较Dyn组多,GFAP阳性神经胶质细胞增生不明显,nor-BNI组与MK-801组间比较差异不显著。结论Dyn鞘内注射可使大鼠运动功能、脊髓组织损害,而nor-BNI或MK-801有对抗其损害作用。Dyn的病理作用是通过Kappa阿片受体和EAA的NMDA受体两种途径介导的。     

大鼠脊髓缺血再灌注损伤后MMP-9的基因表达变化

目的 研究脊髓缺血再灌流损伤过程中的脊髓神经细胞MMP-9表达的变化.方法 30只成年Wistar大鼠,解剖分离腹主动脉,按缺血和再灌流各时间段分别阻断开放腹主动脉,造成脊髓腰尾段缺血,假手术组不阻断腹主动脉,取缺血前、缺血30min、缺血60min,缺血30min再灌注2、6、10h后,分别造成脊髓缺血再灌注损伤模型,每个时相点5只.对局部脊髓逆转录PCR(RT-PCR)及荧光定量PCR检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达水平.结果 正常对照组(缺血前)脊髓可见少量MMP-9表达,而实验组(缺血30min、缺血60min)MMP-9基因表达明显增加,再灌注2、6、10h,MMP-9mRNA表达逐渐增加,且MMP-9的基因表达较缺血期明显增加,各组之间存在明显的差异(P＜0.05).结论 MMP-9在脊髓缺血再灌注中起一定作用,再灌注期细胞内MMP-9基因表达明显多于缺血期,MMP-9与缺血再灌注时间之间存在时效关系,表明MMP-9可能参与脊髓再灌流损伤,是脊髓再灌注损伤过程中一个重要的病理学环节,研究结果对于揭示脊髓继发性损伤的发病机理具有积极意义.     

阳离子脂质体介导的重组pEGFP-N1-IGF-1质粒体内转染在损伤后脊髓组织内的表达

目的探讨重组质粒pEGFP-N1-IGF-1在大鼠损伤脊髓内表达及mRNA定量分析,为基因治疗SCI提供依据。方法建立改良Nystrom’s大鼠脊髓不完全损伤动物模型,应用基因直接注射法,将阳离子脂质体与重组质粒pEGFP-N1-IGF-1混合后注入大鼠脊髓损伤部位,以空白质粒及生理盐水对照,转染1周后取材,行冰冻切片并于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况;行RealTimePCR脊髓内IGF-1的mRNA定量表达,并进行统计学分析。结果通过阳离子脂质体Transfectamreagent成功介导重组质粒pEGFP-N1-IGF-1在大鼠脊髓内转染其神经细胞,并表达EGFP和IGF-1的融合蛋白,通过RealtimePCR方法进行mRNA定量分析,进一步证实了重组质粒pEGFP-N1-IGF-1能在脊髓内明确地表达IGF-1,pEGFP-N1-IGF-1转基因组与IGF-1组和对照组mRNA表达相对数比较均有明显显著性差异(P<0.01)。结论重组质粒pEGFP-N1-IGF-1转染后能在脊髓内明确表达IGF-1。证明阳离子脂质体介导的IGF-1体内转基因方法的可行性,为今后应用IGF-1基因治疗脊髓损伤提供了理论依据。     

肾癌患者外周血中survivin mRNA的表达

目的探讨肾透明细胞癌患者外周血中survivin mRNA的表达及其临床意义。方法用RT-PCR方法检测30例肾透明细胞癌患者、10例正常健康人外周血中survivin mRNA的表达。结果30例肾透明细胞癌患者中有23例外周血中survivin mRNA表达阳性，阳性率为76．7％，与正常健康人（0％）相比差异有统计学意义（P〈0．001）；survivin mRNA的表达与临床分期密切相关（P〈0．01）；随肿瘤组织分化程度的降低，survivin阳性率有增加的趋势，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论肾透明细胞癌患者外周血中survivin mRNA可作为肾透明细胞癌微转移的一个监测指标。     

重组人促红细胞生成素对大鼠脊髓损伤后白细胞介素-10表达的影响及意义

目的　探讨重组人促红细胞生成素 (rHuEPO)对大鼠脊髓损伤后白细胞介素 10 (IL 10 )表达的影响。方法　SD大鼠 10 2只 ,随机分为 4组 ,采用改良Allen脊髓损伤打击模型 ,以逆转录 -聚合酶链反应(RT PCR)法测定伤段脊髓组织IL 10mRNA的表达情况。结果　正常脊髓组织内存在IL 10mRNA的表达 ;脊髓损伤后IL 10mRNA表达逐渐增强 ,在伤后 16 8h达高峰 (本实验的最后观察点 ) ;脊髓损伤后 30min注射rHuEPO能明显上调损伤脊髓组织内IL 10mRNA的表达。结论　脊髓损伤后IL 10mRNA表达逐渐增强 ;rHuEPO通过上调IL 10mRNA的表达 ,对脊髓继发性损伤可能有保护作用。     

Gene expression changes of urokinase plasminogen activator and urokinase receptor in rat testes at postnatal stages

Aim： To investigate the gene expression changes of urokinase plasminogen activator （uPA）/urokinase receptor （uPAR） in rat testes at postnatal stages and explore the effects of uPA/uPAR system on the rat spermatogenesis. Methods： The mRNAs of uPA and uPAR in rat testes were measured by using real-time quantitative polymerase chain reaction （PCR） at postnatal days 0, 5, 10, 15, 21, 28, 35, 42, 49 and 56, respectively. Results： The tendencies of uPA and uPAR mRNA expression were similar at most postnatal stages except for Do. The expression of uPAR mRNA in rats testes was relatively higher than that of uPA at postnatal Do, and both were decreased until D21, increased obviously at postnatal D28, reached a peak at postnatal D35, then declined sharply at postnatal D42 and retained at a low level afterwards. Conclusion： The uPA/uPAR system may be strongly linked to spermiation and spermatogenesis via regulating germ cell migration and proliferation, as well as promoting the spermiation and detached residual bodies from the mature spermatids.