miR-20b对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制

目的:研究miR-20b在卵巢癌细胞系中的表达及其对迁移和侵袭的影响。方法:采用qRT-PCR检测卵巢癌细胞系HO8910,A2780,SKOV3与正常卵巢细胞系Hose中miR-20b的表达水平。将A2780细胞系分成两组,miR-20b模拟物组和阴性对照组,分别转染miR-20b mimics和阴性对照质粒;细胞划痕实验和Transwel l实验分别测定两组细胞迁移和侵袭能力,qRT-PCR和Western印迹分别测定两组血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)mRNA和蛋白表达水平。结果:miR-20b在卵巢癌细胞系HO8910,A2780,SKOV3中低表达,分别为0.30±0.05,0.23±0.03及0.10±0.02,显著低于Hose细胞系的1.00±0.03(P<0.001)。miR-20b模拟物组划痕愈合率为23.20%±3.50%,阴性对照组为65.70%±8.30%,miR-20b模拟物组划痕愈合率显著低于阴性对照组(P<0.01)。miR-20b模拟物组侵袭细胞数为(21.3±4.5)个,阴性对照组为(73.5±6.7)个,miR-20b模拟物组侵袭细胞数显著少于阴性对照组(P<0.01)。miR-20b模拟物组VEGF mRNA相对表达量为0.30±0.02,而阴性对照组为1.00±0.05,miR-20b模拟物组VEGF mRNA表达量显著低于阴性对照组(P<0.001)。miR-20b模拟物组VEGF蛋白表达量为118.00±8.00,显著低于阴性对照组的180.00±5.90(P<0.05)。结论:miR-20b在卵巢癌细胞系中低表达,过表达miR-20b抑制卵巢癌细胞转移与侵袭,可能通过下调VEGF发挥抑癌作用。     

下调miR-19b靶向TP53INP1对骨肉瘤细胞侵袭迁移和凋亡的影响

目的研究miR-19b靶向调控TP53INP1对骨肉瘤细胞侵袭迁移和凋亡的影响。方法将骨肉瘤MG63细胞分为:对照组、抑制物阴性对照组(转染抑制物阴性对照)、miR-19b抑制物组(转染miR-19b抑制物)、siRNA阴性对照+miR-19b抑制物组(转染siRNA阴性对照和miR-19b抑制物)、TP53INP1 siRNA+miR-19b抑制物组(转染TP53INP1 siRNA和miR-19b抑制物)、模拟物阴性对照组(转染模拟物阴性对照)、miR-19b模拟物组(转染miR-19b模拟物)。以qRT-PCR测定转染效果,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移,流式细胞术测定细胞凋亡。靶基因预测软件预测TP53INP1为miR-19b的靶基因,双荧光素酶报告载体鉴定靶向关系。以Western blot测定上调或下调miR-19b对TP53INP1表达的影响。以miR-19b抑制物和TP53INP1 siRNA共转染至MG63细胞中,以流式细胞术和Transwell小室测定细胞凋亡和侵袭迁移变化。结果 miR-19b抑制物MG63细胞中miR-19b表达水平下降,侵袭和迁移能力下降,细胞凋亡率升高,与对照组、抑制物阴性对照组比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。miR-19b与TP53INP1mRNA的3,UTR有结合位点,荧光素酶报告载体鉴定TP53INP1为miR-19b的靶基因。与抑制物阴性对照组比较,miR-19b抑制物组上调细胞中TP53INP1蛋白表达水平,与模拟物阴性对照组比较,miR-19b模拟物组下调细胞中蛋白表达水平。与siRNA阴性对照+miR-19b抑制物组比较,TP53INP1 siRNA+miR-19b抑制物组能够上调MG63细胞的侵袭和迁移能力并减少细胞凋亡(P 0. 05)。结论下调miR-19b通过靶向调控TP53INP1可抑制骨肉瘤细胞侵袭迁移并诱导细胞凋亡。     

胃癌组织中miR-1258的表达水平及其对胃癌细胞侵袭转移能力的调节机制研究

目的研究胃癌组织中微小RNA-1258(miR-1258)的表达水平及其对胃癌细胞侵袭转移能力的调节机制。方法采用回顾性研究,收集108例胃癌组织标本及其对应的癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR对miR-1258在两组中的表达水平进行检测。采集胃癌细胞,将其分为空白对照组(未转染的SGC-7901细胞)、阴性对照组(转移阴性miRNA模拟物)及实验组(转染miR-1258模拟物)。采用MTT实验检测miR-1258对三组细胞增殖能力的影响,并通过Transwell小室实验检测miR-1258对三组细胞侵袭能力的影响;建立裸鼠胃癌肺转移的动物模型,分析miR-1258对三组细胞转移能力的调节机制。结果相比癌旁正常组织,miR-1258低表达于胃癌组织(P 0. 01)。空白对照组细胞增殖能力明显升高,其次为阴性对照组,而实验组细胞增殖能力明显减缓(P 0. 05)。相比空白对照组和阴性对照组,实验组SGC-7901细胞侵袭能力明显下降(P 0. 01)。相比空白对照组和阴性对照组,实验组小鼠肺部转移癌灶数量明显减少(P 0. 01)。结论 miR-1258低表达于胃癌组织,促使miR-1258高表达具有阻滞胃癌细胞侵袭和转移的作用,提示其可能具有肿瘤抑制剂的作用,有望成为胃癌的新型肿瘤标志物,在临床治疗中可作为潜在靶点,具有重要的临床意义。     

miR-145通过调控MMP-2、MMP-9的表达对卵巢癌细胞调亡、增殖、迁移的影响

目的研究微小RNA-145(miR-145)通过调控基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表达对卵巢癌细胞调亡、增殖、迁移的影响。方法将卵巢癌细胞株随机分为3组,其中对照组为单纯卵巢癌细胞株,不做其他处理,进行正常培养;miR-145组为含miR-145质粒的慢病毒转染的卵巢癌细胞株;NC组为含NC质粒的慢病毒转染的卵巢癌细胞株。检测3组卵巢癌细胞的凋亡、增殖、迁移情况。检测3组MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达水平。结果与对照组、NC组比较,miR-145组卵巢癌细胞凋亡率明显升高,卵巢癌细胞增殖数、迁移数明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);对照组与NC组卵巢癌细胞凋亡率、增殖数、迁移数差异无统计学意义(P>0.05)。miR-145组MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达水平均低于NC组、对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组与NC组MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-145可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移,促进调亡,其作用机制可能与miR-145能降低MMP-2、MMP-9的表达有关。     

微小RNA-126对卡波西肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨卡波西肉瘤细胞系转染微小RNA-126(microRNA-126,miR-126)后对细胞迁移和侵袭能力影响。方法卡波西肉瘤细胞株SLK随机分为miR-126模拟物组、阴性对照组、miR-126抑制物组和抑制物阴性对照组,分别将miR-126模拟物25ng、阴性对照25ng、miR-126抑制物250ng和抑制物阴性对照250ng加入转染试剂3μL,室温孵育10min形成转染混合物,分别转染到4组细胞悬液中,孵育48h后行Transwell小室迁移实验和侵袭实验,将Transwell小室基底膜完整切除,行苏木精染色,光学显微镜下计数细胞迁移数目和细胞侵袭数目。结果 miR-126模拟物组细胞迁移数目[(77.33±7.02)个]和细胞侵袭数目[(25.67±2.52)个]较阴性对照组[(96.67±6.11)、(45.67±2.08)个]、miR-126抑制物组[(138.00±8.00)、(76.67±4.16)个]和抑制物阴性对照组[(101.33±9.29)、(47.33±1.53)个]少(P0.05);miR-126抑制物组细胞迁移和侵袭数目较阴性对照组和抑制物阴性对照组多(P0.05);阴性对照组细胞迁移和侵袭数目与抑制物阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 miR-126对卡波西肉瘤细胞侵袭和迁移起抑制作用,可能成为卡波西肉瘤的潜在治疗靶点。     

miR-135a靶向调控STAT6对前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的分析微小RNA-135a(miR-135a)靶向调控信号传导和转录激活因子6(STAT6)对前列腺癌细胞生物学行为的影响。方法选取DU145前列腺癌细胞株,细胞培养后分为空白组、miR-135a阴性对照组、miR-135a转染组,构建miR-135a慢病毒载体,空白组加入常规细胞培养液、生理盐水做空白处理,miR-135a阴性对照组加入miR-135aNC、Lipofectamine 2000试剂行无义序列转染,miR-135a转染组加Hsa-miR-135a、Lipofectamine 2000试剂行细胞转染。鉴定miR-135a转染效率及STAT6mRNA表达量,分析对细胞生物学行为、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bax蛋白的影响。结果与空白组相比,miR-135a阴性对照组miR-135a表达量降低,miR-135a转染组miR-135a表达量升高,差异具有统计学意义(P0.05),说明miR-135a转染成功。空白组、miR-135a阴性对照组、miR-135a转染组STAT6mRNA表达量、增殖、凋亡率、侵袭、迁移个数、MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表达比较,差异具有统计学意义(P0.05);与miR-135a阴性对照组相比,miR-135a转染组STAT6mRNA表达量、细胞增殖率、侵袭、迁移个数、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达量降低,细胞凋亡率、TIMP-2、Bax蛋白表达量升高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 miR-135a对STAT6表达有一定的调控作用,通过调控MMP-2、MMP-9、TIMP-2表达抑制前列腺癌细胞迁移和侵袭,通过调控Bcl-2、Bax相关蛋白表达抑制前列腺癌细胞增殖,促进其凋亡,为临床前列腺癌靶向治疗提供理论依据。     

MicroRNA-29b表达改变对卵巢癌细胞增殖及侵袭的影响

目的：探讨microRNA-29b (miRNA-29b)在卵巢癌细胞中的表达差异及其对卵巢癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法：采用real-time PCR技术检测人卵巢癌上皮细胞系SKOV-3及正常人卵巢上皮细胞系IOSE80中miRNA-29b的表达水平;采用转染技术上调SKOV-3细胞中miRNA-29b的表达水平;采用CCK-8法检测SKOV-3细胞增殖能力;采用Transwell法检测SKOV-3细胞的侵袭能力;采用Western印迹法检测SKOV-3细胞中蛋白表达水平。结果：与IOSE80细胞相比,人卵巢癌上皮细胞系SKOV-3细胞miRNA-29b的表达下降（P<0.05）。转染miRNA-29b mimic后SKOV-3细胞中miRNA-29b的表达水平增加;从第4天开始,转染miRNA-29b的SKOV3细胞增殖能力下降（P<0.05）。转染miRNA-29b减少了通过聚碳酸酯膜的SKOV3细胞数量,抑制了SKOV3细胞的侵袭能力（P<0.05）;转染miRNA-29b mimic后,卵巢癌细胞SKOV3中抑制凋亡蛋白Bcl-2和侵袭相关蛋白MMP-9的表达均降低,与阴性对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论：miRNA-29b可通过抑制凋亡相关蛋白Bcl-2和侵袭相关蛋白MMP-9的表达来抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭。     

载脂蛋白M在非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭中的作用

目的探讨载脂蛋白M(apo M)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞系增殖、迁移、侵袭的影响及与基质金属蛋白酶(MMP)-10的关系。方法以转染apo M慢病毒的A549细胞作为实验组(apo M-OE组),转染空慢病毒的A549细胞作为阴性对照组。分别采用CCK-8法、划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组细胞的增殖、迁移和侵袭能力。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫印迹法检测各组细胞apo M及MMP-10的表达水平。结果与阴性对照组相比,apo M-OE组apo M表达明显上调(P0.01),表达量约为阴性对照组的28倍。apo M-OE组细胞增殖倍数及侵袭率明显高于阴性对照组(P0.001)。与阴性对照组比较,apo M-OE组空白视野显著减少,闭合速率显著加快,即细胞迁移率更大(P0.001)。apo M-OE组中MMP-10 mRNA及apo M、MMP-10蛋白表达量显著高于阴性对照组(P0.05)。结论过表达apo M可增强A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力,同时使细胞高表达MMP-10。     

环状非编码RNAcirc-ZNF652对卵巢癌增殖和迁移的影响及机制

目的:探讨环状非编码RNA circ-ZNF652在卵巢癌细胞系中的表达及对增殖和迁移的影响和机制。方法:采用q PCR法检测circ-ZNF652在卵巢癌细胞系PA-1,Caov-3,Caov-4,SK-OV-3及正常卵巢上皮细胞系HPOSEC,SV40中的表达。将SK-OV-3细胞分别转染circ-ZNF652敲降质粒(si-circZNF652组)与阴性对照质粒(si-control组),野生型SK-OV-3细胞作为空白对照组(Control组),分别使用CCK-8法、细胞划痕实验检测3组细胞的细胞活力及迁移能力,蛋白质印迹法测定蛋白激酶B(Akt)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化情况。结果:卵巢癌细胞系中circ-ZNF652表达量均显著高于正常卵巢细胞系(P0.01);与Control组比较,si-circ-ZNF652组细胞活力降低(P0.01)、细胞迁移能力显著降低(P0.01),Akt和GSK-3β蛋白表达不变(P0.05),而磷酸化Akt和磷酸化GSK-3β蛋白显著降低(P0.01)。Si-control组与Control组相比差异均无统计学意义(P0.05)。结论:环状非编码RNA circ-ZNF652在卵巢癌细胞系中高表达,沉默其表达可抑制细胞增殖和迁移,其机制可能与调控Akt/GSK-3β信号通路有关。     

miR-577对胶质瘤细胞上皮-间质转化的调控作用及机制

目的探讨miR-577调控胶质瘤细胞上皮-间质转化活性的机制。方法将人源性胶质瘤细胞U87细胞分为miR-577类似物组、miR-577抑制物组和空白对照组,分别转染miR-577 mimic、miR-577 inhibitor和miR577-NC。转染24 h后,采用划痕实验检测各组细胞迁移距离,采用Transwell小室实验检测各组细胞侵袭细胞数,采用反转录PCR法检测各组细胞β-catenin mRNA表达水平,采用Western blot法检测各组细胞vimentin、E-cadherin蛋白相对表达量。结果 miR-577抑制物组、空白对照组、miR-577类似物组细胞迁移距离[(3.44±0.55)、(2.13±0.21)、(1.04±0.14)mm]、侵袭细胞数[(128.50±8.11)、(84.60±4.20)、(39.80±6.01)个]、细胞β-catenin mRNA相对表达量(0.80±0.06、0.61±0.04、0.45±0.06)和vimentin蛋白相对表达量(0.82±0.06、0.67±0.08、0.31±0.02)均依次降低(P0.05),E-cadherin蛋白相对表达量(0.44±0.04、0.76±0.05、0.89±0.08)依次增高(P0.05)。结论 miR-577可能作为抑癌基因,通过阻断Wnt/β-catenin信号通路的活性,降低人源性胶质瘤U87细胞上皮-间质转化活性,从而抑制肿瘤发展。     

miR-373对人胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响

目的探讨miR-373在人胃癌SGC7901细胞中表达情况及其对胃癌细胞增殖、迁移的影响。方法人胃癌SGC7901细胞和正常胃黏膜上皮GES-1细胞采用反转录PCR法检测miR-373相对表达量。人胃癌SGC7901细胞分为miR-373类似物组、miR-373抑制物组和空白对照组,分别转染miR-373 mimic、miR-373 inhibitor和miR-373 NC。转染后24、36、48、72 h,采用MTT法检测3组细胞增殖率,转染后48 h,采用Transwell小室迁移实验检测迁移细胞数。结果胃癌SGC7901细胞miR-373相对表达量(0.39±0.05)明显高于正常胃黏膜上皮GES-1细胞(0.23±0.04)(P0.05);miR-373类似物组细胞miR-373相对表达量(0.78±0.11)明显高于miR-373抑制物组(0.17±0.02)和空白对照组(0.36±0.06)(P0.05),空白对照组高于miR-373抑制物组(P0.05);转染后24 h,3组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P0.05),转染后36、48、72 h,miR-373类似物组细胞增殖率明显高于miR-373抑制物组和空白对照组(P0.05),空白对照组高于miR-373抑制物组(P0.05);转染后48 h,相同面积下miR-373类似物组迁移细胞数[(181.28±11.29)个]明显多于miR-373抑制物组[(61.82±8.29)个]和空白对照组[(109.73±8.22)个](P0.05),空白对照组多于miR-373抑制物组(P0.05)。结论 miR-373可能作为癌基因作用于胃癌组织,且能增强胃癌细胞的增殖和迁移能力。     

YB-1对卵巢癌细胞EMT标志蛋白表达及黏附能力的影响研究

目的研究Y-box结合蛋白(YB-1)对卵巢癌细胞上皮间质转化(EMT)标志蛋白表达及细胞黏附能力的影响。方法在卵巢癌细胞中转染p Genesil-1.1/YB-1 shRNA和p Genesil-1.1/shRNA control,筛选稳定转染的细胞记为YB-1 shRNA组和shRNA-NC组,把没有转染的细胞作为对照组。以Realtime PCR和Western blot方法检测细胞中YB-1表达水平。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)方法分别检测细胞增殖和黏附能力,用Western blot检测EMT标志蛋白上皮钙黏附素(E-cadherin)、神经型钙粘素(N-cadherin)和迁移侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移情况。结果 YB-1 shRNA组细胞中的YB-1表达水平明显低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞增殖率和黏附率低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞中E-cadherin蛋白水平高于对照组和shRNA-NC组,N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白水平低于对照组和shRNA-NC组,差异具有统计学意义(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞侵袭和迁移数目低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。结论下调YB-1促进卵巢癌细胞E-cadherin表达,抑制N-cadherin表达,抑制细胞EMT,降低细胞黏附、侵袭、迁移能力。     

miR-9对SGC-7901胃癌细胞株侵袭能力的影响

目的探讨miR-9表达对SGC-7901胃癌细胞株侵袭力的影响及其可能的作用机制。 方法培养SGC-7901胃癌细胞株,分组转染miR-9阴性对照（miR-9 NC）、miR-9模拟物（miR-9 mimics）和miR-9抑制剂（miR-9 inhibitor）,上调或下调细胞中miR-9表达水平。采用Transwell实验评价胃癌细胞侵袭能力,应用SYBR Green荧光实时定量聚合酶链反应和Western blot实验检测SGC-7901细胞中MMP-2 mRNA和蛋白表达水平。对miR-9空白对照组、miR-9 mimics组和miR-9 inhibtor组miR-9的相对表达量、MMP-2 mRNA及蛋白相对表达量,Transwell侵袭实验SGC-7901细胞中侵袭细胞数量,多组间均数比较采用单因素方差分析。 结果与空白对照组SGC-7901细胞miR-9的相对表达量比较：转染miR-9 mimics组SGC-7901细胞miR-9的相对表达量明显上升,差异具有统计学意义［（1.002±0.083）vs（15.375±3.097）,P=0.012］;转染miR-9 inhibitor组SGC-7901细胞miR-9的相对表达量明显下降,差异具有统计学意义［（1.002±0.083）vs（0.279±0.039）,P=0.022］。与空白对照组SGC-7901细胞中侵袭细胞数量比较：转染miR-9 mimics组SGC-7901细胞中侵袭细胞数量明显减少,差异具有统计学意义［（72.0±2.2）vs（23.6±4.2）,P=0.026］;转染miR-9 inhibitor组SGC-7901细胞中侵袭细胞数量明显增加,差异具有统计学意义［（72.0±2.2）vs（102.4±7.6）,P=0.037］。与空白对照组SGC-7901细胞中MMP-2的mRNA及蛋白的相对表达量比较：miR-9 mimics组SGC-7901细胞中MMP-2的mRNA及蛋白相对表达量明显下降,差异具有统计学意义［（1.006±0.133）vs（0.371±0.132）,P=0.011;（0.573±0.063）vs（0.261±0.159）,P=0.024］;miR-9 inhibitor组SGC-7901细胞中MMP-2的mRNA及蛋白相对表达量明显上升,差异具有统计学意义［（1.006±0.133）vs（2.995±0.701）,P=0.015;（0.573±0.063）vs （0.708±0.079）,P=0.016］。 结论在SGC-7901胃癌细胞株中,miR-9可下调MMP-2的表达,抑制细胞的侵袭能力。     

宫颈癌细胞通过下调miR-301b表达促进基因组DNA损伤修复

目的通过研究miR-301b、C末端结合蛋白作用蛋白(Ctip)基因表达在DNA损伤修复过程中的作用以及miR-301b影响Ctip基因表达的作用机制,揭示宫颈癌细胞修复DNA损伤的新机制。方法 (1)Siha细胞经肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理、miR-301b模拟物、抑制物转染以及pcDNA3.1/Ctip与miR-301b模拟物共转染后,利用流式细胞术检测平台和彗星实验测定细胞内DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白平均表达水平和DNA彗星状尾距;(2)采用实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测DNA损伤修复过程中细胞内miR-301b、Ctip mRNA的水平以及转染miR-301b模拟物、抑制物后细胞内Ctip mRNA的水平;(3)采用Western-blot蛋白印迹试验检测转染miR-301b模拟物、抑制物后细胞内Ctip蛋白的水平;(4)应用生物信息学预测miR-301b在Ctip mRNA上的靶定位点;(5)应用荧光报告实验检测转染miR-301b模拟物、抑制物后细胞内mRNA上存在miR-301b靶定位点的报告基因的表达水平。结果 (1)与对照相比,刺激1.5和3h后,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)使细胞内γ-H2AX蛋白平均水平和DNA平均尾距升高,刺激6h后,TNF-α对胞内γ-H2AX蛋白平均水平以及DNA平均尾距无影响;转染miR-301b模拟物升高γ-H2AX蛋白平均水平和DNA尾距,转染miR-301b抑制物降低γ-H2AX蛋白平均水平和DNA平均尾距;与miR-301b模拟物共转染的pcDNA3.1/Ctip降低细胞内γ-H2AX蛋白平均水平和DNA平均尾距;(2)TNF-α刺激使细胞内miR-301b水平降低,Ctip mRNA水平升高;转染miR-301b模拟物降低Ctip mRNA水平,转染miR-301b抑制物升高Ctip mRNA水平;(3)转染miR-301b模拟物降低Ctip蛋白水平,转染miR-301b抑制物升高Ctip蛋白水平;(4)miR-301b靶定Ctip mRNA的3208至3214核苷酸位点;(5)mRNA上存在miR-301b靶定位点的报告基因的表达水平在miR-301b模拟物转染后降低,在miR-301b抑制物转染后升高。结论 Siha细胞通过下调miR-301b表达增强Ctip基因表达促进基因组DNA的损伤修复。     

靶向p21基因saRNA抑制肝癌细胞生长实验研究

目的 探讨RNA激活p21对肝癌HepG2、Hep3b和SMMC-7721细胞生长和侵袭力的影响.方法 化学合成靶向p21的saRNA、阴性对照dsRNA,将其转染肝癌细胞系HepG2、Hep3b和SMMC-7721.每个细胞系分为3组,分别为p21-322组、阴性对照组和空白对照组,每组复3孔;p21-322组和阴性对照组分别采用p21-322 saRNA和阴性对照dsRNA进行转染,空白对照组不干预.转染后72 h,采用RT-PCR和Western blot检测各组细胞中的p21 mRNA和P21蛋白表达水平,采用MTT法检测细胞生长情况及划痕实验观察细胞侵袭能力的变化.结果 HepG2、Hep3b和SMMC-7721细胞p21-322组p21 mRNA相对表达水平分别为23.43±2.29、16.87±1.61、31.77±5.06,P21蛋白相对表达水平分别为55.93±12.66、32.91±5.17、24.96±6.81;空白对照组分别为3.53±0.07、2.39±0.02、5.70±0.89,3.21±0.03、2.91±0.14、4.15±0.12;阴性对照组分别为3.87±0.97、2.57±0.71、5.87±1.73,3.11±0.70、3.01±0.97、5.13±2.14;p21-322组p21 mRNA和蛋白相对表达水平明显高于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01),空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);细胞转染后第6天时HepG2、Hep3b、SMMC-7721细胞p21-322转染组细胞平均生长抑制率分别为41％、48％和52％;HepG2细胞p21-322组24 h后空白区域占原划痕区域面积的百分比((76±11)％)明显高于空白对照组((13±6)％)和阴性对照组((17±8)％)(P＜0.01),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 靶向p21的RNAa能抑制肝癌细胞的生长和侵袭力,p21可作为一个具有肝癌治疗应用价值的靶基因.     

miR-141靶向调控Keap-Nrf2/HO-1信号通路对卵巢癌发生发展的影响

目的观察卵巢癌组织和细胞中miR-141的表达,探讨其异常表达对卵巢癌细胞Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路的影响。方法回顾性收集2018年1月4日至2018年12月1日就诊于中国人民解放军中部战区总医院妇产科并经病理切片诊断为卵巢上皮癌患者的手术标本15例、良性卵巢肿瘤标本15例及正常卵巢组织标本15例。免疫组化检测不同标本中Keap1、Nrf2、HO-1的阳性表达,qRT-PCR检测卵巢组织及细胞中miR-141和Keap1、Nrf2、HO-1的mRNA表达情况。在SKOV3细胞内转染miR-141 siRNA后,qRT-PCR检测细胞内Keap1、Nrf2、HO-1 mRNA水平的表达情况,Western Blot检测细胞内Keap1、Nrf2、HO-1蛋白水平的表达情况;分别消化、收集转染miR-141 siRNA,阴性对照物,Nrf2 siRNA及阴性对照物的SKOV3细胞后,继续培养0 h、24 h、48 h后,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,细胞划痕试验检测细胞迁徙改变情况。结果 Keap1蛋白在卵巢癌组织中的阳性表达显著低于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织。Nrf2和HO-1蛋白在卵巢癌组织中的阳性表达显著低于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织,差异有统计学意义(P 0. 05);转染miR-141siRNA抑制其表达后,与转染阴性对照物组相比,细胞内Keap1 mRNA水平和蛋白表达显著上升,Nrf2、HO-1 mRNA水平表达变化无显著差异,而蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P 0. 05);转染miR-141siRNA和Nrf2 siRNA组细胞与转染阴性对照物组相比,增殖显著下降,凋亡显著上升,细胞迁移距离显著下降,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论卵巢癌细胞中,miR-141异常高表达,异常高表达的miR-141可以通过调控Keap1-Nrf2/HO-1信号通路影响卵巢癌细胞的增殖与凋亡。     

Gadd45α mRNA和蛋白在子痫前期胎盘组织中表达及转染siRNA对滋养细胞侵袭能力及侵袭相关分子的影响

目的分析生长阻滞和DNA损伤45α(Gadd45α)蛋白和mRNA在子痫前期(PE)胎盘组织中的表达情况及转染siRNA对滋养细胞侵袭能力及侵袭相关分子的影响。方法回顾性选取咸宁市中心医院收治的40例PE胎盘组织为病例组,30例正常胎盘组织为对照组。通过免疫印迹法对两组Gadd45α蛋白表达水平进行检测,并用实时荧光定量PCR法对两组Gadd45α mRNA的相对表达量进行检测。对滋养细胞HTR8/Svneo进行培养,以转染阴性对照的siRNA为对照siRNA组,转染Gadd45α的siRNA为Gadd45α-siRNA组。在转染Gadd45α的siRNA后对滋养细胞侵袭数量和侵袭相关分子基质金属蛋白酶(MMPs)的表达水平进行检测。结果相比对照组,病例组Gadd45α蛋白表达水平明显升高(P 0. 01),Gadd45α mRNA的相对表达量明显上调(P 0. 01)。相比对照siRNA组,Gadd45α-siRNA组滋养细胞HTR8/Svneo中Gadd45α蛋白表达水平显著下降(P 0. 01),Gadd45α mRNA的相对表达量亦显著下调(P 0. 01)。随着转染siRNA时间的增加,对照siRNA组与Gadd45α-siRNA组细胞侵袭数量明显增多(P 0. 05);相比对照siRNA组,Gadd45α-siRNA组同时间点滋养细胞HTR8/Svneo侵袭数量明显增多(P 0. 01)。相比对照siRNA组,Gadd45α-siRNA组滋养细胞HTR8/Svneo侵袭相关分子MMP-1、MMP-2、MMP-3及MMP-9的表达水平均显著升高(P 0. 05)。结论 Gadd45α高表达于PE胎盘组织,而通过阻滞滋养细胞HTR8/Svneo中Gadd45α的表达水平可诱导细胞侵袭,提高侵袭相关分子MMPs的表达量。     

反义miR-224对人胰腺癌细胞系Aspc-1和Bxpc-3侵袭、迁移的影响及机制研究

目的分析miR-224对胰腺癌细胞侵袭和迁移的影响并探讨其分子机制。方法用miR-224反义寡核苷酸(ASO)降低胰腺癌细胞中miR-224的表达,通过Transwell实验和划痕实验观察miR-224 ASO对胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响,用western blot法检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9表达水平的变化。结果与空白对照组和转染无义ASO组相比,miR-224 ASO组miR-224的表达降低(P均0.05);Transwell实验和划痕实验结果显示miR-224 ASO组胰腺癌细胞的侵袭、迁移能力下降(P均0.05),MMP-2和MMP-9表达水平下降(P均0.05)。结论降低miR-224的表达可有效抑制胰腺癌细胞的侵袭和迁移;miR-224有可能成为胰腺癌侵袭转移调控的新靶点。     

miR-326靶向MAPK/MEK信号通路抑制食管鳞状细胞癌恶性生物学行为

目的探讨miR-326靶向MAPK/MEK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 20例食管鳞状细胞癌患者,取手术切除食管癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-326mRNA和MAPK mRNA相对表达量,采用免疫组织化学法检测MAPK蛋白表达。3种食管癌细胞系(KYSE150、EC9706、TE-9)和人正常食管上皮细胞系Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-326 mRNA和MAPK mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞MAPK蛋白相对表达量。将对数生长期EC9706细胞随机分为miR-326组、转染对照组和空白对照组,miR-326组和转染对照组分别转染miR-326 mimic和mimic NC,空白对照组细胞不作任何处理,采用Western blot法检测细胞MAPK、p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量,克隆形成试验检测细胞克隆形成率,划痕试验检测细胞划痕闭合率,Transwell小室试验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果食管癌组织miR-326 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P0.05),MAPK mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P0.05)。KYSE150、EC9706和TE-9细胞miR-326 mRNA相对表达量均低于Het-1A细胞(P0.05),MAPK mRNA和MAPK蛋白相对表达量高于Het-1A细胞(P0.05),且EC9706细胞MAPK蛋白相对表达量最高。miR-326组细胞MAPK 3'UTR WT荧光素酶活性(0.53±0.05)明显低于转染对照组(1.22±0.14)(P0.05),MAPK 3'UTR MUT荧光素酶活性(0.86±0.06)与转染对照组(0.91±0.11)比较差异无统计学意义(P0.05)。miR-326组细胞MAPK蛋白相对表达量(0.32±0.15)低于转染对照组(0.88±0.07)和空白对照组(0.91±0.06)(P0.05),细胞克隆形成率[(21.30±0.55)%]、划痕闭合率[(29.47±4.12)%]和侵袭细胞数[(113.86±3.15)个]低于转染对照组[(75.43±0.81)%、(80.52±2.51)%、(427.27±4.25)个]和空白对照组[(79.13±0.65)%、(83.44±1.87)%、(468.10±3.38)个](P0.05),G_0/G_1期细胞比率[(63.15±1.20)%]和细胞凋亡率[(18.54±0.60)%]高于转染对照组[(41.18±0.60)%、(5.28±1.30)%]和空白对照组[(45.11±0.80)%、(4.13±0.90)%],S期和G_2/M期细胞比率及p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量低于转染对照组和空白对照组(P0.05),转染对照组与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 miR-326靶向抑制MAPK/MEK信号通路的激活,影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。     

基质金属蛋白酶-11对骨肉瘤细胞上皮-间质转化的调控作用

目的 观察基质金属蛋白酶-11(matrix metalloproteinase-11, MMP-11)对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、转移的影响,探讨其对骨肉瘤细胞上皮-间质转化的调控作用。方法 对数生长期Saos-2细胞随机分为空白对照组(正常培养)、siRNA-MMP-11组(转染siRNA-MMP-11)、ovRNA-MMP-11组(转染ovRNA-MMP-11)。转染48 h采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞MMP-11 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测细胞E-cadherin、N-cadherin、MMP-11蛋白相对表达量,采用Transwell小室实验检测侵袭细胞数,采用划痕实验检测迁移细胞数;采用MTT法检测转染后培养72 h时3组细胞增殖率。结果 转染48 h, ovRNA-MMP-11组MMP-11 mRNA和蛋白相对表达量(1.511±0.082、1.688±0.115)均高于空白对照组(1.339±0.211、1.024±0.066)、siRNA-MMP-11组(1.147±0.382、0.382±0.068)(P<0.05),空白对照组...