Survivin-siRNA对裸鼠视网膜母细胞瘤移植瘤的抑制研究

目的构建Survivin-siRNA真核重组质粒,转染裸鼠视网膜母细胞瘤玻璃体腔移植瘤中,探讨其对肿瘤组织中Survivin表达的抑制作用及诱导凋亡情况。方法构建针对Survivin mRNA特异的靶序列的Survivin-siRNA以及对照Scramble-siRNA。将Y79细胞种植至21只裸鼠玻璃体腔内,9d后随机平均分为mock对照组(注射K-PBS);Scramble对照组(注射带有非同源的Scramble-siRNA重组质粒);Survivin实验组(注射特异性Survivin-siRNA重组质粒)。10d后摘除肿瘤组织,利用半定量RT-PCR检测肿瘤组织Survivin mRNA;采用Western blot方法分析Survivin蛋白;HE染色、Survivin及Ki67免疫组化染色;TUNEL法检测肿瘤组织凋亡。结果真核重组质粒及视网膜母细胞瘤裸鼠玻璃体腔移植瘤模型均构建成功。半定量RT-PCR显示Survivin-siRNA在mRNA水平上抑制了Survivin基因转录(P0.01),Scramble组与mock组无差别(P0.05)。Western blot显示与mock组和Scramble组相比,实验组细胞的Survivin蛋白表达显著降低(P0.01)。HE染色普通光镜下观察,实验组与两对照组相比,在瘤组织内可见到较多死亡细胞;实验组移植瘤组织中Survivin蛋白表达与mock组和scramble组相比明显下降;实验组Ki67的表达较对照组下降明显,增殖指数明显下降(P0.01)。TUNEL法显示实验组肿瘤组织内可见大量细胞核染为棕黄色的凋亡细胞,对照组可见少许凋亡细胞,实验组凋亡指数明显高于对照组(P0.01)。结论成功构建的Survivin-siRNA重组质粒可以抑制裸鼠视网膜母细胞瘤移植瘤中Survivin基因转录和蛋白表达,诱导了肿瘤细胞凋亡。     

SGK1基因沉默对人前列腺癌细胞生长的抑制作用

目的探究糖皮质激素诱导蛋白激酶1(serum and glucocorticoid-inducible kinase 1,SGK1)基因沉默对人前列腺癌细胞生长抑制的作用。方法选取人前列腺癌PC-3细胞,将RNAi重组质粒(PSGK1-RNAi)通过脂质体转染至PC-3细胞,再用G418筛选稳定转染的SGK1基因沉默的PC-3细胞作为SGK1基因沉默组,并将正常培育的PC-3细胞和空质粒稳定转染的PC-3细胞分别作为阴性对照组与阳性对照组。检测培育48 h、72 h、96 h的细胞增殖能力,计算培育48 h的不同细胞周期表达水平和细胞凋亡情况。结果培育48 h、72 h及96 h,三组PC-3细胞水平差异有统计学意义(P 0. 05);与SGK1基因沉默组比较,培育48 h、72 h及96 h的阳性对照组、阴性对照组PC-3细胞水平升高,差异具有统计学意义(P 0. 05)。三组G1期和S期细胞所占比例比较差异有统计学意义(P 0. 01);与SGK1基因沉默组比较,阳性对照组、阴性对照组G1期细胞所占比例下降,S期细胞所占比例升高,差异具有统计学意义(P 0. 01)。三组PC-3细胞凋亡率比较差异有统计学意义(P 0. 01);与SGK1基因沉默组比较,阳性对照组、阴性对照组细胞凋亡率下降,差异有统计学意义(P 0. 001)。结论 SGK1基因沉默能抑制PC-3细胞增殖,诱发PC-3细胞凋亡,可作为基因治疗前列腺癌的有效靶点。     

基因敲除的新技术——RNAi

RNA干扰（RNAi）是一种新兴的基因阻断技术,它通过双链RNA分予介导,特异降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默,自1995年首次报道以来已取得了重大研究进展。近8年来,研究者对RNAi现象进行了广泛、深入的探索研究,预示RNAi有望成为今后分析人类基因功能的有力工具,并将在人类疾病的基因表达显像和治疗方面发挥重要作用。     

人骨肉瘤mta1 mRNA的siRNA载体构建及其对mta1沉默作用

目的本实验拟构建针对mta1 mRNA的siRNA重组载体,将siRNA对应的DNA发卡样双链序列克隆入载体内,位于H1启动子下游,转染入人骨肉瘤细胞内,在细胞内表达mta1靶向的siRNA分子,特异性沉默mta1的表达。方法依据GenBank中mta1基因(NM-004689)的序列,用设计分析软件进行设计候选序列,确定针对mta1的siRNA序列。合成mta1发卡样siRNA寡核苷酸,退火成双链DNA,克隆入T载体,利用α互补和T7/SP6PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-mta1;用BglⅡ和HindⅢ双酶切重组子pGEM-T-mta1和siRNA表达载体pSuperneo;将双粘mta1发卡样siRNA片段亚克隆入siRNA表达载体pSuperneo中;利用BglⅡ和HindⅢ双酶切筛选鉴定重组子pSuperneo-mta1;对插入序列进行DNA序列分析。将siRNA表达载体pSuperneo-mta1转入人骨肉瘤细胞系MG-63中,用RT-PCR方法检测细胞mta1 mRNA表达水平。结果转染pSuperneo-mta1的实验组骨肉瘤细胞中mta1 mRNA表达几乎完全被抑制,而2个对照组(无关siRNA对照组和空载体对照组)和未转染的骨肉瘤细胞系MG-63细胞中都存在较高水平的mta1 mRNA表达。结论设计出针对mta1的发卡样siRNA寡核苷酸片段,成功构建出针对mta1的siRNA表达载体pSuperneo-mta1,pSuperneo-mta1转染骨肉瘤细胞后能显著降低细胞mta1 mRNA表达。     

视网膜母细胞瘤中DLC-1启动子甲基化异常

目的探讨肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)启动子在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)中的甲基化情况及与临床参数的关系。方法收集37例RB石蜡切片,4例正常眼部组织标本和2株RB细胞系(WERI-Rb1及Y79)。用甲基化敏感性高分辨率熔解(MS-HRM)法定量检测DLC-1甲基化情况,用亚硫酸氢盐测序对其进行验证,并用RT-PCR检测WERI-Rb1和Y79细胞系中DLC-1 mRNA的表达。结果 35.1%的RB中存在DLC-1启动子甲基化,而在正常眼部组织中未发现甲基化;WERI-Rb1和Y79检测出DLC-1 mRNA表达。DLC-1启动子甲基化与肿瘤分化、伴随其他肿瘤和家族史均无显著关系,但单侧RB患者中的DLC-1甲基化率明显高于双侧患者(P<0.05)。结论 RB患者DLC-1启动子存在一定程度的甲基化,DLC-1甲基化在RB的发生、发展中具有一定的作用。     

视网膜母细胞瘤易感基因在人肺癌中的缺失和突变研究

目的研究视网膜母细胞瘤易感基因(Rb基因)在人肺癌中的缺失和突变情况。方法采用PCR和限制性内切酶分析技术,对20例人肺癌组织DNA样品和3例正常人肺组织DNA样品Rb基因外显子14~16、22~23区域进行分析。结果2例样品存在外显子14~16区域的缺失。结论Rb基因在人肺癌,特别是小细胞肺癌中存在缺失,此为肺癌发病机制的研究积累了资料。     

人端粒酶逆转录酶基因沉默对肺腺癌细胞侵袭、增殖、凋亡的影响

目的:探讨靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(siRNA)转染对肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响。方法:构建靶向hTERT的siRNA表达质粒转染A549细胞,通过Western blot检测蛋白的表达水平,确定有效后,通过Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定转染后肿瘤细胞的细胞周期和凋亡率。结果:成功构建靶向hTERT的siRNA表达质粒。实验组siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱(P<0.01),生长抑制率明显高于阴性对照组(P<0.01),且表现出时间依赖性。流式细胞术测定显示,实验组siRNA转染48h后,肿瘤细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论:靶向hTERT的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导细胞凋亡的发生。     

RNAi沉默G250／MN／CAIX基因对肾癌Ketr-3细胞株生物学行为的影响

目的观察RNAi沉默G250基因表达后，肾癌Ketr-3细胞生长速度和体外侵袭力的变化。方法据G250基因的序列合成shRNA并克隆至真核表达载体pSilencer2．1-U6-neo中，构建G250shRNA真核表达载体，将该载体转染至人肾癌Ketr-3细胞株中。采用RTPCR、West-ernblot及间接免疫荧光法对干扰效率进行检测。MTT法观察干扰后细胞生长情况的变化，Tran-swell小室体外侵袭实验探讨干扰后细胞体外侵袭能力的变化。结果成功构建了G250shRNA的真核表达载体。RT-PCR、Westernblot和间接免疫荧光检测表明转染G250shRNA真核载体的肿瘤细胞G250／β-actin的比值明显降低。细胞生长曲线结果显示Ketr-3-MNRi组与Ketr～3组和阴性对照组Ketr3-NC相比较，肿瘤细胞生长减慢；Ketr3-MNRi细胞其穿膜细胞数明显低于Ketr-3-NC及Kerr-3细胞。结论G250shRNA可以下调kerr-3细胞G250的过度表达，抑制肿瘤细胞生长，下调其侵袭能力，为探讨G250在肾癌的发病机制中的作用及生物学治疗肾癌提供实验基础和理论依据。     

视网膜母细胞瘤Y79细胞裸鼠玻璃体腔移植瘤模型的建立

目的建立视网膜母细胞瘤裸鼠玻璃体腔移植瘤模型并观察其生长状态,为开展肿瘤体内实验做好前期工作。方法培养视网膜母细胞瘤Y79细胞,调整细胞浓度为（4.5-5.5）&#215;107/ml,注射至裸鼠玻璃体腔内（5μl/只）,观察肿瘤的生长状态。结果注射早期玻璃体腔内浑浊明显,而后依次出现肿瘤团块;角膜混浊;眼内结构破坏;眼球突出于眼外。摘除的肿瘤组织HE染色结果显示瘤细胞大小不等,胞浆少,核大,核分裂相常见。结论利用Y79细胞系可以建立良好的视网膜母细胞瘤玻璃体腔移植瘤模型,为人们探索视网膜母细胞瘤的发展规律以及治疗方法提供了有用的工具。     

儿童视网膜母细胞瘤发生发展密切相关的可疑新基因位点研究

背景近年来研究表明视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)的发生和病变的进展除了与已知的Rb1基因有相关性外,可能还有其他抑癌基因的参与.目的探讨其他可能参与RB发生发展的基因存在的位点,并试图寻找和确定具有监测及预后价值的杂合性缺失(LOH)检测指标.设计以RB患者为研究对象的病例分析.单位一所军医大学医院的基因诊断治疗中心.对象本研究在第三军医大学西南医院基因诊断治疗中心完成,研究对象为1998-05/2001-10在本校三所附属医院门诊就诊的RB患者16例.纳入标准符合RB诊断标准的年龄小于3岁的患儿;排除标准有家族遗传史者.其中男10例,女6例;累及双眼者12例,累及单眼者4例.方法在患者的RB肿瘤及外周血标本中运用荧光聚合酶链反应(PCR)分别扩增13号染色体上14个微卫星DNA标记,分析测定各位点LOH发生率;同时通过家系分析确定位点缺失的遗传学来源.主要观察指标患者13号染色体上LOH发生频率.结果16例RB患者中,12例在13号染色体上1个或1个以上位点发生LOH.其中3个位点D13S265、D13S263和D13S153(位于Rb1基因内)LOH发生机率最高.12个LOH阳性标本中有10个位点的缺失被确定发生在父系来源的染色体中.LOH阳性及阴性组RB的确诊时间分别为504和1 086 d,两组相比差异具有显著性意义(t=2.357,P＜0.05).结论LOH阳性组的患者RB确诊时间早于LOH阴性组.除已确定的Rb1基因外,D13S263(13q14.1-14.2)和D13S265(13q31-32)两个位点的LOH现象也可能对RB患者的早期干预和功能监测具有一定提示作用.     

沉默SETD8基因表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用

目的探究siRNA下调含SET结构域(赖氨酸甲基转移酶) 8(SETD8)基因表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能的机制。方法采用脂质体法将特异性针对SETD8基因的siRNA转入骨肉瘤MG-63细胞中,得到关于SETD8基因沉默表达的MG-63稳定的细胞系即实验组,将杂序siRNA用脂质体法同时转染骨肉瘤MG-63细胞,得到关于Control siRNA的MG-63细胞系即对照组,未经转染的骨肉瘤MG-63的稳定的细胞系即空白组。以上三组细胞系通过应用细胞毒性活性检测法(CCK-8法)、平板克隆法同时检测被SETD8基因沉默后骨肉瘤MG-63细胞的增殖能力,侵袭迁移小室即(Transwell小室)法检测骨肉瘤MG-63细胞的侵袭和迁移能力,实时荧光定量法即(PCR法)以及蛋白质印迹法即(Western Blot法)检测SETD8基因沉默表达效果及细胞内SETD8,β-catenin,cyclin D1,vimentin、MMP3的mRNA和相应蛋白的表达水平。结果 SETD8 siRNA转染后,骨肉瘤MG-63细胞的增殖能力显著低于对照组(control siRNA转染MG-63细胞)和空白组(未经转染的MG-63细胞)(P 0. 05); Transwell小室结果显示,沉默SETD8基因组的侵袭和迁移能力明显下降;实验组(SETD8 siRNA转染MG-63细胞)中SETD8、β-catenin、cyclin D1、vimentin、MMP3的mRNA及蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白对照组(P 0. 05)。结论 siRNA下调SETD8基因表达可以抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖、侵袭和迁移能力,Wnt/β-catenin信号通路可能参与并调控这一过程。     

RNA干扰Survivin基因在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的作用

目的利用RNAi技术沉默人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞Survivin基因。方法应用RNAi技术,以pGCsi/U6质粒为载体构建Survivin-siRNA重组质粒,体外转染SH-SY5Y细胞,通过RT-PCR检测Survivin基因的表达。结果重组质粒转染SH-SY5Y细胞后其生长明显受抑制;Survivin基因的表达明显低于对照组(P0.01),达到了抑制效果。结论 RNAi可明显降低人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中Survivin基因的表达,从而抑制细胞生长,促进凋亡。     

siRNA沉默Slug基因抑制体外胰腺癌AsPC l细胞生长的实验研究

有研究发现Slug在恶性肿瘤中过度表达,并与肿瘤的发生、发展,患者预后有关[1].最近发现,S1ug是PUMA的强烈抑制基因,而PUMA是促凋亡基因.本文旨在研究S1ug基因沉默后对胰腺癌AsPC 1细胞的增殖和凋亡的影响,探讨胰腺癌基因治疗的新靶点.     

沉默DNMT1基因对骨髓瘤细胞SOCS-1基因甲基化的影响

目的:探讨DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase,DNMT1)基因沉默对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞内细胞因子信号转导抑制分子1(suppressor of cytokine signaling,SOCS-1)甲基化的影响。方法:应用靶向沉默DNMT1基因的短发卡RNA(RNA-Short hairpin RNA,shRNA)通过脂质体(lipofectamineTM2000)介导转染骨髓瘤细胞RPMI8226,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测转染前后DNMT1基因和蛋白表达,应用甲基化特异性PCR检测转染前后骨髓瘤细胞SOCS-1基因甲基化水平的变化。结果:转染后骨髓瘤细胞DNMT1 mRNA表达水平(0.176±0.004)和蛋白表达水平(0.065±0.014)均明显低于阴性对照组(0.956±0.033,0.415±0.027),其差异具有统计学意义(P0.01)。转染后SOCS-1基因甲基化水平较转染前明显降低。结论:利用shRNA能靶向沉默DNMT1基因的表达,并可以有效逆转SOCS-1基因高甲基化状态。     

小干扰RNA抑制PTTG基因对人胰腺癌细胞PANC-1侵袭能力的影响

目的研究P1TG基因沉默对胰腺癌细胞侵袭力的影响,探讨其与胰腺癌细胞侵袭性的关系及调控机制。方法阳离子脂质体转染PITG siRNA对PANC-1中的PITG基因进行干扰;利用RT-PCR和Western blot技术检测其基因沉默效应;通过Transwell小室法测定PANC-1细胞侵袭能力的改变。结果转染PTTG siRNA后,PANC-1细胞中PTTG的mRNA转录和蛋白表达受抑,显著低于未经处理的PANC-1细胞（P〈0．01）。利用PITGsiRNA对PITG进行RNA干扰后,PANC-1细胞的侵袭能力下降。结论设计的PITGsiRNA能有效抑制体外培养PANC-1细胞中PTIG的mRNA转录和蛋白表达水平,实现其基因沉默效应。P1TG与人胰腺癌的侵袭能力密切相关,其表达水平下降导致细胞侵袭能力降低。     

急性白血病视网膜母细胞瘤相关蛋白46基因和蛋白表达谱的变化及意义

目的探讨急性白血病(AL)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)视网膜母细胞瘤相关蛋白46(RbAp46)蛋白和基因表达状态,揭示RbAp46表达与AL类型及预后的可能联系。方法用Western印迹技术检测46例AL患者BMMNCRbAp46蛋白表达量;用RTPCR方法扩增22例AL患者BMMNCRbAp46mRNA的表达并进行半定量检测;用间接免疫荧光技术观察RbAp46蛋白在BMMNC的表达和分布。结果①AL患者BMMNC存在RbAp46蛋白和mRNA表达,表达强度与白血病类型无关。②肿瘤重度负荷组的AL患者BMMNC表达RbAp46蛋白的平均吸光度(A)值为93.4±37.2,明显低于肿瘤轻度负荷组的127.2±15.8(P<0.05)。③难治性白血病患者BMMNCRbAp46蛋白表达的平均A值为87.1±33.8,明显低于非难治性白血病组的126.6±21.2(P<0.05)。④肿瘤重度负荷组AL患者BMMNCRbAp46mRNA的相对表达量为0.19±0.08,明显低于肿瘤轻度负荷组的0.31±0.12(P<0.05)。⑤AL和对照组患者BMMNC均存在RbAp46蛋白的原位表达;RbAp46蛋白主要分布在细胞核中。结论AL患者BMMNC存在RbAp46蛋白和mRNA表达,该表达在肿瘤负荷重的AL和难治性白血病患者显著降低,提示RbAp46可能是白血病细胞生长的抑制基因。     

shRNA抑制CD147基因表达对HT29细胞增殖、侵袭和致瘤能力的影响

目的用RNA干扰(RNAi)技术抑制CD147基因的表达,检测其对人结直肠癌细胞系HT29细胞增殖、侵袭和致瘤能力的影响。方法设计合成CD147特异性的RNA干扰表达质粒pYr-mir30-shRNA,稳定转染HT29细胞,分别获得HT29/shRNA-control和HT29/shRNA细胞;RT-PCR和western blot分别检测CD147、MCT1、MCT4 mRNA和蛋白质的表达;明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9的活性;CCK8法分析细胞的增殖能力;Transwell小室检测细胞的侵袭能力;观察结直肠癌裸鼠皮下移植瘤的致瘤能力。结果与空白组比较,RNA干扰后的细胞中CD147、MCT1 mRNA(F分别为99.645和84.985)及蛋白质(F分别为73.675和19.842)的表达水平均降低(P均0.01);MMP-2和MMP-9的活性均降低(P均0.01);细胞增殖(t分别为7.491、15.023、14.584、6.637和11.211,P均0.01)和侵袭(F=330.443,P0.01)能力均降低,使裸鼠荷瘤能力下降(F=365.679,P0.01)。结论 RNA干扰能有效抑制CD147基因的表达,抑制HT29细胞的增殖和侵袭能力。     

双链RNA介导的转录后基因沉默及其在血液系统肿瘤中的应用

双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默(PTGS)普遍存在于生物界中。PTGS是通过向细胞内引入核酸为起始,激发dsRNA的产生、小干扰(siRNA)的形成和mRNA特异性降解,从而阻断蛋白质的翻译而引起的基因沉默。它具有特异、高效等特点。研究表明,PTGS与细胞的生长发育、维持遗传稳定性和抵抗外来核酸的入侵有关,故用于血液系统肿瘤病因、发生发展和治疗的研究具有重要的价值。     

RNAi沉默STAT3基因对结肠癌HCT116细胞侵袭的调控

目的:观察RNA干扰沉默STAT3基因对结肠癌细胞侵袭的影响,并探讨其可能机制。方法:应用STAT3小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理人结肠癌细胞系HCT116后,采用RT-PCR检测STAT3 mRNA表达,软琼脂集落培养试验检测锚着不依赖性增殖,Boyden小室模型试验检测癌细胞的侵袭性,琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测癌细胞失巢凋亡。结果:STAT3 siRNA可有效抑制结肠癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关。琼脂糖凝胶电泳和TUNEL结果显示,STAT3 siRNA转染可诱导结肠癌细胞失巢凋亡,且与浓度相关。结论:STAT3 siRNA可抑制结肠癌细胞的恶性侵袭,其机制与诱导失巢凋亡有关。     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制膀胱癌EJ细胞增殖及转移

目的探讨慢病毒介导的Clusterin（CLU）基因沉默的RNA干扰效果及其对膀胱癌EJ细胞增殖和转移的影响。方法构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,用Westernblot检测其对膀胱尿路上皮癌细胞株EJ的干扰效果,用MTT、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验等方法分别检测CLU沉默后膀胱癌EJ细胞在增殖、侵袭和转移等方面的细胞生物学改变。结果靶向CLU基因的慢病毒干扰载体感染膀胱癌EJ细胞后,CLU基因在蛋白水平的表达明显下降。EJ细胞的增殖、侵袭和转移能力均受到抑制。结论 CLU慢病毒干扰载体可有效沉默膀胱癌EJ细胞内源性CLU基因,抑制膀胱癌EJ细胞的增殖、侵袭和转移。