PRNP基因在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中的表达及肿瘤坏死因子-α对其调节作用

目的 探讨3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中PRNP基因表达水平的变化及TNF-α对其调节作用.方法 体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,胰岛素加地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MDI)方案诱导3T3-L1细胞分化成熟,并收集分化前、分化0～10 d各时段细胞,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段3T3-L1细胞PRNP基因表达水平;同时在成功诱导3T3-L1细胞分化成熟的基础上,应用不同水平TNF-α(0.1、1.0、10.0 μg/L)干预分化后的成熟脂肪细胞(第10天),收集TNF-α刺激前(0 h)及刺激后0.5、2.0、6.0、12.0、24.0 h的脂肪细胞,通过RT-PCR测定TNF-α干预前后不同时间点脂肪细胞中PRNP基因表达水平.采用Excel软件进行统计学分析.结果 1.PRNP基因低表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐上调,至分化第10天其表达水平最高.PRNP基因表达水平除在诱导分化前(第-1天)至第4天、第2～5天、第6～10天时段内无显著性差异外(Pa＞0.05),其余各时段间表达水平均有显著性差异(Pa＜0.05);2.在分化前的3T3-L1脂肪细胞和成熟脂肪细胞中,不同水平TNF-α(0.1、1.0、10.0 μg/L)均能在短时间内明显抑制PRNP基因mRNA的表达,且呈时间依赖性.结论 PRNP基因可能参与3T3-L1脂肪细胞分化及脂质积聚过程;不同水平重组TNF-α对成熟脂肪细胞的PRNP基因表达具有抑制作用,其抑制效应总体趋势上呈时间依赖性.     

鞘氨醇激酶基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的表达水平

目的 探讨鞘氨醇激酶基因(SPHK）在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化。方法采用细胞培养和RT-PCR技术检测细胞分化不同阶段脂肪细胞中SPHK基因表达水平。结果1．SPHK基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化初期表达呈明显上调趋势；2．随着脂肪前体细胞分化成熟，该基因表达水平明显低于诱导分化初期的基因表达水平。结论 SPHK基因可能参与脂肪细胞分化的调控过程，与肥胖发生有一定联系。     

胰岛素受体底物1基因沉默对3T3-L1细胞CCAAT增强子结合蛋白α、过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达的影响

目的研究胰岛素受体底物1(IRS-1)沉默对3T3-L1前脂肪细胞分化关键分子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)mRNA及蛋白表达的影响,并观察IRS-1沉默后前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞能力的改变,探讨胰岛素受体底物(IRSs)是否作为C/EBPα、PPARγ的上游调节信号在前脂肪细胞分化中起到重要的调节作用。方法合成4条IRS-1 shRNA,Western blotting筛选出沉默效率最高的1条。3T3-L1前脂肪细胞分为IRS-1沉默组和对照组。IRS-1沉默组细胞用沉默效率最高的IRS-1 shRNA质粒转染3T3-L1前脂肪细胞,沉默细胞中的IRS-1分子;对照组采用无意义IRS-1 shRNA质粒转染3T3-L1前脂肪细胞。转染24 h后诱导其分化成熟,分化72 h后检测促进前脂肪细胞分化的关键分子C/EBPα、PPARγ的表达。继续诱导分化至第7天,油红O染色观察IRS-1沉默后前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的比例,检测其分化能力的改变。结果与对照组相比,IRS-1沉默组在诱导分化72 h后,Real-time PCR结果显示3T3-L1前脂肪细胞中C/EBPαmRNA、PPARγmRNA表达明显下降(Pa<0.05),Western blotting结果显示C/EBPα、PPARγ蛋白水平也同样显著下降(Pa<0.05);细胞继续分化至第7天,油红O染色显示,IRS-1沉默组前脂肪细胞分化成熟的比例与对照组比较显著降低。结论胰岛素可能通过IRS-1刺激C/EBPα、PPARγ的表达促进前脂肪组织的分化。     

TSG-6基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化及TNF-α对其调节作用的研究

目的观察3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中TSG-6基因mRNA表达水平的变化,探讨TNF-α对成熟脂肪细胞中TSG-6基因表达水平的调节作用.方法体外培养3T3-L1脂肪细胞,在诱导3T3-L1脂肪细胞分化成熟的基础上,应用重组TNF-α干预分化成熟的脂肪细胞,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段及TNF-α干预后不同时间脂肪细胞中TSG-6基因的表达水平.结果 (1)随脂肪细胞逐渐分化成熟,TSG-6 基因mRNA表达水平逐渐升高.TSG-6 基因表达水平除在细胞分化第0～2天、第3～5天、第4～6天和第7～10天各时段内差异无显著意义(P>0.05)外,其余各时段之间表达水平,差异均有显著意义(P＜0.05);(2)不同浓度重组TNF-α(0.1～10.0 ng/ml)均能显著抑制成熟脂肪细胞中TSG-6基因mRNA的表达,除外TNF-α浓度1.0 ng/ml时6～24 h时段,其抑制作用呈现随TNF-α浓度增加和刺激时间延长而明显增强的总体趋势.TNF-α浓度为0.1 ng/ml时,TSG-6基因表达水平6 h内下降33.73%,12 h内下降97.39%;TNF-α浓度为1.0 ng/ml时,TSG-6基因表达水平6 h内下降78.68%,并持续至24 h;TNF-α浓度达10.0 ng/ml时,TSG-6基因表达水平2 h内即下降96.27%,TSG-6基因的表达几乎被完全抑制.结论 (1)TSG-6基因可能参与脂肪细胞分化及脂质形成过程;(2)TNF-α对脂肪细胞中TSG-6基因表达具有抑制作用,其抑制效应总体趋势上呈现剂量反应性特征.     

3T3-L1脂肪细胞分化中促酰化蛋白对脂肪因子肾上腺髓质素mRNA表达的影响

目的 研究3T3-L1脂肪细胞分化过程中脂肪因子肾上腺髓质索(AM)mRNA表达变化及促酰化蛋白(ASP)对细胞分化过程中AM mRNA表达的影响,探讨ASP在脂肪代谢中的作用.方法 1.应用反转录(RT) -PCR法检测诱导分化4个时点(0d、1d、2d、3d)的3T3-L1脂肪细胞中AM mRNA的表达水平;2.对诱导分化过程中不同时间点(0h、12 h、24h、48 h)的3T3-L1脂肪细胞给予适合浓度的ASP处理,并设立相应空白对照,应用RT-PCR法检测细胞中AM mRNA的表达.结果 (1)脂肪细胞诱导分化各时间点(0d、1d、2d、3 d)AM mRNA均明显表达,且表达水平呈时间依赖性递减;(2)0 h、12 h和24h3个时点ASP组细胞中AMmRNA表达水平较空白对照组均显著下降(P＜0.05,0.01),而48 h时间点ASP组细胞中AM mRNA表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ASP促成脂作用可能与其调节脂肪细胞分化过程中脂肪因子AM mRNA表达密切相关.     

LYRM1基因沉默对成熟脂肪细胞线粒体形态及其相关基因的影响

目的 探讨LYRM1基因沉默对成熟脂肪细胞线粒体形态及相关基因的影响.方法 以3T3-L1前体脂肪细胞为工具细胞,建立LYRM1基因沉默细胞株,以转染空载质粒的3T3-L1脂肪细胞作为阴性对照,将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,采用油红O染色观察脂肪细胞分化状态,采用透射电镜观察成熟脂肪细胞的线粒体形态,采用荧光定量PCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体融合基因(Mfn) 1/2 mRNA、线粒体动态相关基因(Drp)1 mRNA、线粒体分裂基因(Fis)l mRNA的表达水平.结果 1.油红O染色诱导分化第8天的脂肪细胞,发现85％以上脂肪细胞已分化为成熟脂肪细胞,细胞形态大而圆,胞质含大量被油红O染成亮红色的脂滴,比较发现2组细胞无论脂滴的大小、数量均无显著差异.2.透射电镜观察发现2组细胞的线粒体形态基本正常,线粒体无明显肿胀、皱缩,线粒体嵴清晰可见,2组细胞间线粒体数目无明显差异.3.LYRM1基因沉默成熟脂肪细胞的Mfn2 mRNA表达水平显著高于对照组成熟脂肪细胞.4.LYRM1基因沉默成熟脂肪细胞的Mfnl mRNA、Drpl mRNA和Fisl mRNA表达水平与对照组成熟脂肪细胞的表达水平无明显差异.结论 LYRM1基因沉默能够引起成熟脂肪细胞Mfn2 mRNA表达水平升高,对线粒体形态结构并无显著影响,提示LYRM1基因沉默可部分影响成熟脂肪细胞线粒体形态相关基因.     

STEAP4基因在人前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达

目的观察人肥胖相关全长新基因STEAP4在人前体脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化,探讨STEAP4基因与脂肪细胞分化、脂质积聚的关系。方法体外培养人前体脂肪细胞,待细胞生长融合后以1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素及罗格列酮联合诱导方案,在体外诱导其分化为成熟脂肪细胞。在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中观察细胞形态及脂质积聚变化;采用实时荧光定量RT-PCR技术检测诱导分化不同时段(前体,第0、4、6、8、11、14、17天)脂肪细胞中STEAP4基因mRNA的表达水平。结果STEAP4基因高表达于人前体脂肪细胞;加入脂肪细胞分化诱导剂后(第4天)表达略有上调,其后随脂肪细胞分化成熟该基因表达量呈逐渐下降趋势;至脂肪细胞完全分化成熟(第14-17天)表达量最低。STEAP4基因表达水平除在诱导分化前至第4天、第14-17天差异无统计学意义外,余各时间点的表达水平差异均有统计学意义(Pa<0.05)。结论STEAP4基因随脂肪细胞分化成熟表达逐渐下调,可促进脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚,与肥胖的发生有关。     

解偶联蛋白4基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的表达水平

目的　观察 3T3 L1脂肪前体细胞诱导分化过程中解偶联蛋白 4 (UCP4 )基因表达水平变化 ,探讨UCP4基因与肥胖发生之间的关系。方法　体外培养 3T3 L1细胞 ,诱导细胞分化 ,采用RT PCR技术在细胞分化成熟的不同时段检测脂肪细胞中UCP4基因mRNA表达水平。结果　UCP4基因高表达于 3T3 L1脂肪前体细胞中 ,随细胞分化成熟该基因表达水平渐下调。UCP4基因表达水平在诱导分化前 (d - 1)至d0、d0～ 3、d4～6、d7～ 8、d9～ 10内无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,余各时段表达水平均有显著差异 (P均 <0 .0 1)。结论　UCP4基因与肥胖发生相关 ,其在 3T3 L1细胞分化过程中表达逐渐下调可能有利于脂肪细胞的脂质积聚     

丝裂原活化蛋白激酶8基因在3T3-L1细胞诱导分化中表达水平的变化及肿瘤坏死因子-α对其调节的作用

目的观察丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨TNF-α,对成熟脂肪细胞中MAPK8基因表达水平的调节作用,分析MAPK8基因与脂肪细胞分化、脂质形成及肥胖间的关系。方法体外培养3T3-L1脂肪前体细胞,在诱导其分化成熟的基础上,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段(0~10 d)脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平;应用重组TNF-α(0.1,1.0,10.0μg/L)干预分化成熟的脂肪细胞,采用RT-PCR技术检测TNF-α干预后不同时间(0.5,2,6,12,24 h)脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平。结果1.3T3-L1前体脂肪细胞中,MAPK8基因表达水平较高。应用地塞米松(DEX)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、胰岛素后脂肪细胞逐渐分化成熟,MAPK8基因mRNA表达水平逐渐减低。MAPK8基因表达水平除在诱导分化前至d4、d2~5、d6~10时段内无显著性差异外(P均>0.05),余各时段间表达水平均有显著差异(P均<0.01);2.不同浓度重组TNF-α干预成熟脂肪细胞,均能显著上调MAPK8基因的表达,并呈现随TNF-α浓度增加、刺激时间延长,表达调控作用逐渐增强的总体趋势。TNF-α浓度为0.1μg/L时,MAPK8基因的表达水平于干预12 h时间点开始出现明显上调;浓度增加至1.0μg/L时,MAPK8基因表达水平开始显著上调的时间点提前至干预2 h时,但24 h时间点的表达水平未见继续上调;TNF-α浓度为10.0μg/L时,除2 h时间点MAPK8基因表达开始显著上调外,12~24 h时段的表达也呈上调趋势。结论1.MAPK8基因在3T3-L1细胞分化过程中表达逐渐下调,其机制可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚,与肥胖发生有关;2.TNF-α能够上调成熟脂肪细胞中MAPK8基因的表达,其效应总体趋势上呈现剂量及时间反应性特征。     

NYGGF4基因表达沉默对3T3-L1脂肪细胞线粒体代谢的影响

目的 探讨NYGGF4(又称PID1)基因沉默对脂肪细胞线粒体代谢的影响.方法 以3T3-L1前体脂肪细胞为研究对象,体外培养稳定转染NYGGF4基因沉默载体(pGPU6/GFP/Neo-shRNA,NYGGF4-RNAi)的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体(pG-PU6/GFP/Neo-shRNA,NCshRNA)的3T3-L1前体脂肪细胞作为对照,经1-甲基-3异丁基黄嘌呤加地塞米松、胰岛素方案诱导分化为成熟脂肪细胞,采用实时定量RCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体代谢酶指标:己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平.结果 NYGGF4表达沉默与NYGGF4基因过表达相比,可以部分逆转3T3-L1脂肪细胞中已糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平,差异均有统计学意义.结论 NYGGF4基因过表达,下调3T3-L1脂肪细胞中定位于线粒体的代谢关键酶,提示NYGGF4基因的动态平衡对维持3T3-L1脂肪细胞的线粒体代谢具有重要作用.     

凋亡蛋白酶活化因子1基因在脂肪细胞诱导分化中表达及肿瘤坏死因子-α对其调节作用

目的 观察3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中（0~10 d）凋亡蛋白酶活化因子1（APAF1）基因表达水平的变化趋势，探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对成熟脂肪细胞中APAF1基因表达水平的调节作用。方法 体外培养3T3-L1脂肪前体细胞，通过油红O染色鉴定其分化成熟的基础上，应用人重组TNF-α 1.0 ng·mL-1干预分化成熟的脂肪细胞，抽提脂肪细胞总RNA和总蛋白后，采用RT-PCR及Western blot技术检测诱导分化不同时段及TNF-α干预后不同时间（2、6、12和 24 h）脂肪细胞中APAF1基因的表达水平。结果 ① 3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化过程中（0~10 d），APAF1基因表达水平呈现逐渐减低的趋势;②人重组TNF-α对成熟脂肪细胞中APAF1基因的表达具有显著的增强作用，且TNF-α对APAF1基因表达的上调作用呈现随刺激时间延长而明显增强的总体趋势。结论 ① 在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中，APAF1基因的表达逐渐下调可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚；② APAF1基因在人重组TNF-α刺激成熟脂肪细胞过程中呈明显上调趋势，这种上调可能具有协同TNF-α促进成熟脂肪细胞去分化的作用。     

IgG3 deficiency and severity of 2009 pandemic H1N1 influenza

Background: The severity of the 2009 pandemic H1N1 influenza (H1N1 pdm 09) in immune deficient children is unknown. The aim of the present study was to investigate this in a case of complete IgG3 deficiency complicated by pneumonia and asthma attack. Methods: The clinical parameters of the IgG3 deficiency patient were compared with those of four control patients using 95% confidence intervals. These control patients were selected from 71 patients admitted due to pneumonia or bronchitis caused by H1N1 pdm 09, and were chosen according to age, absence of pretreatment with oseltamivir before admission, presence of a past history of asthma, use of antibiotics, and combination of inhalation of a beta2 agonist and treatment with i.v. methylprednisolone for asthma attack. Results: The IgG3 deficiency patient had significantly longer duration of admission and period of oseltamivir, with a significantly decreased pulse oxygen saturation and increased maximum serum C‐reactive protein, creatine kinase and urinary excretion of β2‐microglobulin/creatinine, compared with the controls (P < 0.05). Conclusions: Complete IgG3 deficiency is possibly associated with severity of the clinical course of pneumonia and asthma attack in children suffering from H1N1 pdm 09.     

Human hepatic flavin-containing monooxygenases 1 (FMO1) and 3 (FMO3) developmental expression.

The flavin-containing monooxygenases (FMOs) are important for the metabolism of numerous therapeutics and toxicants. Six mammalian FMO genes (FMO1-6) have been identified, each exhibiting developmental and tissue- and species-specific expression patterns. Previous studies demonstrated that human hepatic FMO1 is restricted to the fetus whereas FMO3 is the major adult isoform. These studies failed to describe temporal expression patterns, the precise timing of the FMO1/FMO3 switch, or potential control mechanisms. To address these questions, FMO1 and FMO3 were quantified in microsomal fractions from 240 human liver samples representing ages from 8 wk gestation to 18 y using Western blotting. FMO1 expression was highest in the embryo (8-15 wk gestation; 7.8 +/- 5.3 pmol/mg protein). Low levels of FMO3 expression also were detectable in the embryo, but not in the fetus. FMO1 suppression occurred within 3 d postpartum in a process tightly coupled to birth, but not gestational age. The onset of FMO3 expression was highly variable, with most individuals failing to express this isoform during the neonatal period. FMO3 was detectable in most individuals by 1-2 y of age and was expressed at intermediate levels until 11 y (12.7 +/- 8.0 pmol/mg protein). These data suggest that birth is necessary, but not sufficient for the onset of FMO3 expression. A gender-independent increase in FMO3 expression was observed from 11 to 18 y of age (26.9 +/- 8.6 pmol/mg protein). Finally, 2- to 20-fold interindividual variation in FMO1 and FMO3 protein levels were observed, depending on the age bracket.     

Lung function in adolescents with α1-antitrypsin deficiency

Children with α₁-antitrypsin deficiency, screened at birth, were followed prospectively. At 16 years of age, 150 adolescents (103 PiZ, 1 PiZ-, 1 PiS-, 45 PiSZ) were interviewed using a standardized questionnaire and asked to participate in an extensive lung function study including part or all of the following tests: FVC, FEV₁ before and 15 min after four inhaled doses of salbutamol, TLC, RV and FRC. Fifty age-, sex- and height-matched adolescents participated as controls. No significant differences in age, height or weight were found between the PiZ, PiSZ and control groups. No significant differences were found in respiratory symptoms, parental smoking history or the smoking habits of PiZ, PiSZ and control subjects. Asthma occurred in 10.7% of PiZ, 6.5% of PiSZ and 4% of control adolescents (p = 0.33). Only 3 of 100 PiZ and 1 of 45 PiSZ adolescents were smokers. No significant contribution of α₁-antitrypsin Pi-type was found to explain the variation in lung function variables studied. We conclude that children with α₁-antitrypsin deficiency have a favourable prognosis and normal lung development up to 16 years of age. Anti-smoking advice was found to be reasonably successful; only 3% of those answering the questionnaire had started to smoke.     

Nephrotic Syndrome Following H1N1 Influenza in a 3-Year-Old Boy

Background

The pandemic influenza A/H1N1, spread through the world in 2009, producing a serious epidemic in Italy. Complications are generally limited to patients at the extremes of age (<6 months or >65 years) and those with comorbid medical illness. The most frequent complications of influenza involve the respiratory system.

Case Presentation

A 3-year-old boy with a recent history of upper respiratory tract infection developed a nephrotic syndrome. Together with prednisone, furosemide and albumin bolus, a therapy with oseltamivir was started since the nasopharyngeal swab resulted positive for influenza A/H1N1. Clinical conditions and laboratory findings progressively improved during hospitalization, becoming normal during a 2 month follow up.

Conclusion

The possibility of a renal involvement after influenza A/H1N1 infection should be considered.