双重复合糖基转移酶的ABO基因启动子CpG岛甲基化

背景：在ABO血型抗原的研究中,绝大多数样本是相同的ABO基因表达出正常的相同的ABH抗原。但有一定数量的样本表现出具有相同分子遗传背景但表达出来的抗原强度却随着家系\个体不同而有所差异,说明了ABO血型中复杂的表达调控机制。分析一类罕见的双重复合型标本的ABO血型血清学与基因背景情况,深入表观遗传学的研究,有利于部分揭示ABO基因表达机制。 目的：探讨双重复合型ABO糖基转移酶表达相关的ABO基因启动子CpG岛甲基化水平与ABH抗原表达的关系。 方法：6例经血型血清学定为CisAB或B(A)型的标本,进行ABO基因编码区全长序列和启动子序列的测定,采用重亚硫酸盐处理法检测ABO基因启动子CpG岛甲基化程度。 结果与结论：6例双重复合AB型的标本中,在B101等位基因基础上存在nt803C > G突变的2个CisAB05/B(A)06等位基因,在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-33(30%)、nt+27(50%)、nt+49(50%)具有甲基化差异;在A101等位基因序列的基础上存在nt803C > G突变的2个CisAB01等位基因,在ABO启动子CpG岛区域两者在nt-26(10%)位置有甲基化差异;在B101等位基因基础上存在nt640A > G突变的2个B(A)04等位基因ABO启动子CpG岛,在nt-33(10%)、nt+16(50%)、nt+57(60%)、nt+59(60%)、nt+68(60%)和nt+74(60%)位有甲基化差异。全部的6例标本ABO基因启动子区域DNA序列无任何突变异常。结果提示在相同的ABO遗传基因背景下,ABO基因启动子CpG岛区域某些位点甲基化可能影响ABH抗原在红细胞膜表面的表达。     

一例ABO疑难血型基因分析

目的对一例血型血清学鉴定困难的患者进行相关基因分析,鉴定血型并分析引起血型鉴定困难的原因。方法采用微柱凝胶法和试管法进行血清学血型鉴定、抗球蛋白试验和抗体筛查,PCR扩增患者ABO基因第6、7外显子区及其侧翼序列并进行Sanger测序、克隆测序,寻找突变位点进行血型鉴定。结果患者血清学血型鉴定正反结果不符,其红细胞与单克隆抗A、B、H抗体反应均呈阴性(-);血清与A、B、O型红细胞均无凝集;患者直接及间接抗球蛋白试验均为阴性;血清抗体筛查为阴性。测序发现,患者ABO血型相关基因存在多个变异位点。其中第6外显子区存在c.261delG,第7外显子区存在c.467CCT、c.526CCG、c.657CT、c.703GGA、c.796CCA、c.803GG。以A101基因作为标准序列进行比较,对照Blood Group Antigen Gene Mutation Database进行ABO等位基因突变分析,判断患者血型为A102/B101。结论患者红细胞上抗原减弱是血型鉴定正反不符的主要原因,DNA基因测序第6、7外显子七个点突变导致了红细胞上抗原减弱。     

一例Bw亚型的糖基转移酶等位基因鉴定及蛋白结构分析

目的对1例Bw亚型个体进行分子遗传学及蛋白结构分析。方法采用血清学技术进行红细胞表面抗原和血清中抗体的测定,并用PCR-基于序列的分型(PCR-sequence-based typing,PCR-SBT)方法进行ABO基因的全编码区序列和第1内含子区红系特异性调控元件的分析。进一步对存在突变位点的第5~7外显子扩增片段进行T-A克隆分离单倍体和序列验证分析。应用Pymol软件对突变蛋白进行3D结构的模拟,分析氨基酸残基的变化对蛋白结构稳定性的影响。结果该样本血清学表现为B抗原减弱,血清中含有抗-B抗体。ABO基因全编码区测序初步确定其基因型为ABO*B.01/ABO*O.01.01伴有c.734C/T的杂合突变。第1内含子红系特异性调控元件区碱基序列无异常。通过单倍体克隆分离,确定突变位点c.734T位于ABO*B.01等位基因链,另一个等位基因为ABO*O.01.01。该突变将B糖基转移酶活性中心245位Thr置换为Ile。蛋白3D结构的模拟分析发现氨基酸置换后,与之结合的残基未发生改变而连接的氢键距离发生变化,同时增加了与远距离水分子之间的连接。结论B糖基转移酶基因c.734C>T突变导致酶活性中心氨基酸置换,影响了突变B糖基转移酶蛋白稳定性,引起酶活性减弱,从而产生了Bw变异型。     

一种ABx变异型相关的B糖基转移酶基因新突变研究

目的 研究1例ABO血型系统ABx变异型的分子遗传背景.方法 用血型血清学技术鉴定1例ABO血型疑难样本的红细胞表型和唾液血型分泌物质,并用聚合酶链反应分别扩增先证者ABO基因全编码区共7个外显子及侧翼内含子序列,扩增产物经双酶切纯化后直接进行双向测序分析.进一步对存在突变位点的第6～7外显子扩增产物经进行TA克隆和单倍体序列分析.结果 先证者红细胞ABO抗原表达为A强B弱,结合其它血清学特征,鉴定其血型为罕见的ABx变异型.ABO基因全编码区测序发现9处核苷酸杂合位点,分别为第6外显子的297A/G杂合,第7外显子的467C/T、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、808T/A、930G/A杂合.单倍体序列分析发现,其中一个等位基因为常见的A102,另一个等位基因除808T＞A突变外,其它变异位点与B101等位基因一致.808T＞A突变可导致B糖基转移酶第270位苯丙氨酸转变为异亮氨酸.结论 B糖基转移酶基因808T＞A突变可能引起酶活性减弱,并进而导致产生Bx变异型.     

2例CisAB/B亚型的血清学和分子生物学研究

目的 结合ABO血型血清学结果,采用ABO基因测序技术鉴定CisAB血型.探讨CisAB/B亚型的血清学和基因型的关系.方法 对于送至青岛市中心血站ABO血型待定的献血者标本,采用经典试管法进行血清学分析.采用聚合酶链反应(PCR)直接测序的方法分析ABO基因第6,7外显子及侧翼序列、启动子和增强子序列.对于有突变的标...     

ASPP2基因启动子区DNA甲基化及转录因子DNA结合位点的干湿研究

对p53凋亡刺激蛋白2 (ASPP2)基因启动子区进行了甲基化及转录因子结合位点(TFBS) 的生物信息学分析及实验研究.结果表明,在该基因近端启动子区存在一个长1391bp的CpG岛,且此区域中包含19个转录因子的37个结合位点,其中有13个转录因子的结合位点含有CpG;甲基化预测发现在含CpG的23个TFBS中有18个位点的CpG易发生甲基化.由此推断ASPP2是典型的多因子调控的CpG岛基因,CpG岛的异常甲基化将影响转录因子结合,导致ASPP2基因表达下调.通过对人肝癌细胞株HepG和人成纤维细胞HFL-1的ASPP2基因启动子CpG岛中含4个E2F结合位点区域的甲基化实验检测,证明这种推断是正确的.这一研究说明,对重要基因启动子区DNA甲基化及TFBS的生物信息学研究可为相关的实验研究提供指南,对促进基因表达的表观遗传调控研究具有重要意义.     

一例ABO血型cisAB06亚型的基因序列分析

目的 探讨1例ABO亚型cisAB06的血清学和分子遗传特征.方法 应用单克隆抗体检测1例ABO正反定型不符的患者红细胞ABO抗原,标准A、B、O红细胞检测血清中ABO抗体.用序列特异性引物-聚合酶链反应进行ABO基因分型.用PCR技术特异性扩增A、B基因第6～7外显子,PCR产物纯化后直接测序分析.结果 患者红细胞有A、B抗原,同时血清中存在抗A抗体.聚合酶链反应-序列特异性引物基因分型结果为B/O02型,直接测序结果为cisAB06型,与B101基因序列比对仅在第526位发生G＞C的突变(c.526G＞C),该位点的突变导致176位甘氨酸变成精氨酸(p.R176G).结论 B等位基因c.526G＞C突变形成cisAB06等位基因,其血清学表现为AB型.     

一例ABO新等位基因B112的分子生物学研究及其家系分析

目的 研究1例新的ABO亚型B112的分子机制,并对其家系进行分析.方法 应用单克隆抗体检测先证者红细胞ABO血型抗原,标准A、B、O红细胞检测先证者血清中的ABO抗体.采用聚合酶链反应(po1ymerase chain reaction,PCR)技术扩增先证者ABO基因的第5至7外显子序列,PCR产物经双酶切后直接测序分析第6和7外显子.同时采用基因组单链抽提技术分离先证者的两条单倍型,对分离的单倍型扩增后进行ABO基因测序分析.家系调查采集先证者父母的标本进行ABO血清学实验和ABO基因第6和7外显子测序分析.结果 先证者血清学表型符合B表型特性,直接测序分析显示第6和7外显子有261G/缺失、297A/G、526C/G、559C/T、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A杂合,推断基因型为BO.基因组单链抽提技术将先证者B和O基因分离后,测序得到两个等位基因为O01和B112.与B101相比,B112第559位C→T导致第187位精氨酸变成半胱氨酸.家系调查显示先证者B112基因从母亲遗传所得,母亲标本ABO血型血清学特性和测序分析结果与先证者完全一致.结论 发现1例559C＞T突变的ABO亚型新等位基因B112,其B抗原表达正常,提示α-1,3-半乳糖基转移酶第187位精氨酸变成半胱氨酸并不影响B转移酶的活性.     

罕见Bel01亚型的血清学和基因分析

目的:探讨Bel01亚型的血清学特征和分子机制.方法:采用血型血清学方法分析该献血者ABO表型,磷酸盐耦联法检测糖基转移酶活性,PCR-SSP法进行ABO亚型基因分型,对第1～7外显子进行测序.结果:血清学试验检测疑为Bel,血清和红细胞上均无D-半乳糖基转移酶活性,ABO血型基因分型结果为BO2,基因测序结果确认为B...     

5-羟色胺转运体基因启动子区CpG岛甲基化状态与精神分裂症Ⅰ型和Ⅱ型的关联

目的:探讨5-羟色胺转运体(5-HTT)基因启动子区CpG岛甲基化状态与精神分裂症Ⅰ型和Ⅱ型的关联。方法:运用特异性甲基检测PCR和直接测序法对62例精神分裂症Ⅰ型患者、38例Ⅱ型患者和50例健康被试5-HTT基因启动子区CpG岛甲基化状态进行检测。结果:三组5-HTT基因启动子区CpG岛甲基化阳性率无显著性差异;精神分裂症Ⅰ型患者5-HTT基因启动子区CpG岛内位点甲基化率显著高于精神分裂症Ⅱ型患者和健康被试组。结论:5-HTT基因启动子区CpG岛内位点高甲基化可能是精神分裂症Ⅰ型的发病机制之一。     

启动子区5′CpG岛去甲基化对人结肠癌细胞生物学表型的影响

目的：探讨DNA启动子区5′CpG岛甲基化状态与人结肠癌RKO细胞增殖凋亡等生物学特征的关系。方法： 应用特异性DNA甲基转移酶（DNMTs）抑制剂-5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）处理肠癌RKO细胞72 h，甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）及DNA测序法分析p16/CDKN2基因CpG岛甲基化状态；MTT、FCM、荧光染色及透射电镜检测启动子区去甲基化后细胞生长、形态和细胞周期凋亡的影响。 结果： DNMTs抑制剂能较好地逆转启动子区胞嘧啶甲基化状态；CpG岛去甲基化后能明显地抑制肠癌细胞的生长，增加细胞群体倍增时间（P<0.01），诱导肠癌细胞凋亡，影响肠癌细胞周期分布，并具有良好的量效依赖关系。 结论： 通过逆转CpG岛高甲基化能有效地抑制肠癌细胞增殖，为临床治疗大肠癌提供新的作用靶点。     

ABO亚型ABw07一家系的分子生物学研究

目的 研究一个ABO亚型ABw07家系的分子机制.方法 用单克隆抗体检测先证者红细胞ABO血型抗原.标准A、B、O红细胞检测先证者血清中的ABO抗体,采用聚合酶链反应技术扩增先证者ABO基因的第6和7外显子序列,PCR产物经酶切后直接测序分析.同时PCR产物经TOPO TA克隆到质粒载体中获得单链,对所得克隆进行ABO基因双向测序分析.家系调查采集先证者父母和姐姐的标本进行血型血清学实验和ABO基因第6和7外显子直接测序分析.结果 先证者红细胞有A、B抗原,同时血清中存在抗B抗体.直接测序分析发现第261位无缺失,第297位A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、1055C/A、1096A/G杂合,可推断为A102Bw07基因型.克隆测序得到两个等位基因A102和Bw07.与B101相比,Bw07第1055位G→A,导致1个氨基酸改变:第352位氨基酸精氨酸变成谷氨酰胺.家系调查显示先证者Bw07基因从母亲遗传所得,母亲血液标本ABO血型血清学特性和测序分析结果与先证者完全一致.结论 α-1,3-半乳糖基转移酶基因(B基因)第1055位G→A突变导致产生Bw07表型,其血清中可含有抗B抗体.     

Bw11亚型家系表现ABO等位基因竞争现象的研究

目的分析携带ABO*BW.11等位基因的家系成员ABO血清学和分子生物学特征。方法应用血清学方法检测先证者及其家系成员共9人的ABO血型表型。采用PCR方法扩增ABO基因第6、7外显子并对扩增产物直接测序,同时克隆测序先证者及其父亲的标本。结果血清学检测初步判断先证者及其弟弟为AB亚型,先证者的父亲及其两女儿为B亚型。克隆测序发现先证者ABO等位基因第7外显子在B101的基础上第695位碱基发生T>C变异,表明为ABO*BW.11等位基因。先证者的父亲、弟弟及其两个女儿均携带该变异等位基因。A基因与BW.11以及BW.11与O基因同时遗传时竞争现象存在明显差异。结论ABO基因c.695T>C变异可能会导致Bw11亚型存在等位基因竞争现象。分子生物学方法结合血清学方法有助于精准鉴定ABO疑难血型。     

Changes in Presenilin 1 gene methylation pattern in diet-induced B vitamin deficiency

We have previously shown that a nutritional model of B vitamin deficiency and homocysteine cycle alteration could lead to increased amyloid β deposition, due to PSEN1 and BACE over-expression and consequent increase in secretase activity. We hypothesize that nutritional factors causing homocysteine cycle alterations (i.e. hyperhomocysteinemia) could induce sequence-specific DNA hypomethylation and “aberrant” gene activation.Aim of present study was to analyze the methylation pattern of PSEN1 promoter in SK-N-BE neuroblastoma cells and TgCRND8 mice, in a B vitamin (folate, B12 and B6) deficiency paradigm. PSEN1 methylation status has been evaluated through bisulphite modification and genomic sequencing. We demonstrate that B vitamin deficiency induces hypomethylation of specific CpG moieties in the 5′-flanking region; S-adenosylmethionine has been supplemented as methyl donor to reverse this effect. PSEN1 promoter methylation status is correlated with gene expression. These findings pinpoint a direct relationship between B vitamin-dependent alteration of homocysteine cycle and DNA methylation and also indicate that PSEN1 promoter is regulated by methylation of specific CpG moieties.     

α1，3半乳糖基转移酶基因721C〉T突变导致Bw亚型

目的研究红细胞ABO血型系统Bw亚型的分子基础. 方法通过标准血型血清学方法明确鉴定2个家庭3例Bw亚型,PCR扩增Bw亚型ABO糖基转移酶基因的增强子、启动子和第1～7外显子及侧翼内含子序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序.同时将第6和7外显子克隆到pcDNA3.1(-)质粒,转化DH5α后进行序列分析.采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法证实测序所发现的突变.结果直接测序发现3例Bw亚型的基因型为B/O杂合,其中糖基转移酶基因的第261位G杂合缺失,第721位C/T杂合.克隆证实一条染色体上为正常的O等位基因,另一条染色体上B等位基因(α1,3半乳糖基转移酶基因)存在第721位C>T突变,导致多肽链Arg241Trp替换.序列特异性引物-聚合酶链反应检测140份随机样本未发现此突变. 结论α1,3半乳糖基转移酶基因第7外显子721C>T突变可能是Bw亚型分子遗传基础之一.