骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景:用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论.鉴于此,课题组提出"同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨"的实验设技.目的:同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法.方法:分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组:实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子.比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况.制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养.分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析.结果与结论:实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组(u=3.326,P < 0.01).实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞.组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性.提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨.同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求.     

骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质组合生长因子诱导向软骨细胞分化

背景：用组织工程学方法高质量修复关节软骨缺损并达到很好的远期疗效目前尚无定论。鉴于此,课题组提出＂同种异体骨髓间充质干细胞关节腔内定向培养组织工程软骨＂的实验设技。目的：同种异体脱钙骨基质组合转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力,同时探索其在关节腔内培养促进向关节软骨定向分化的方法。方法：分离兔骨髓间充质干细胞并行体外培养,分为两组：实验组DMEM培养液中加入转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ,对照组中未加入诱导因子。比较两组细胞的增殖情况和成软骨分化情况。制备同种异体脱钙骨基质支架材料,实验组骨髓间充质干细胞负载到同种异体脱钙骨基质中,构建组织工程软骨复合体,取另2只兔的腰背筋膜包裹后缝合固定到30只兔膝关节腔内行腔内培养。分别于植入后4,8,12周各取10只标本进行组织学切片观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学观测,并对结果进行分析。结果与结论：实验组中骨髓间充质干细胞集落形成效率明显高于对照组（u=3.326,P〈0.01）。实验组细胞爬片做Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阳性,对照组未见阳性细胞。组织工程复合体在腔内培养12周后,苏木精-伊红染色见大量软骨细胞增生,胞核染色呈蓝色;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,大量软骨陷窝形成,周围大量基质包绕;Ⅱ型胶原免疫组织化学反应见细胞外基质中出现大量棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色强阳性。提示转化生长因子β1和胰岛素样生长因子Ⅰ可显著促进骨髓间充质干细胞增殖和成软骨分化,骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质结合后可在关节腔内成功培养出组织工程软骨。同种异体脱钙骨基质符合组织工程软骨支架材料的基本要求。     

转化生长因子β及周期性拉伸应变条件下骨髓间充质干细胞向软骨样细胞的分化

背景：研究表明转化生长因子β对骨髓间充质干细胞的软骨方向分化具有显著的诱导作用。周期性拉伸应变可以模拟软骨细胞在体内的力学环境,对细胞的增殖和分化起着重要的调节作用。目的：探讨转化生长因子β及周期性拉伸应变在诱导骨髓间充质干细胞向软骨样细胞分化过程中是否具有协同作用。方法：取2月龄新西兰大白兔10只,骨穿针穿入股骨髓腔内,抽取骨髓3.0-4.0 mL并分离培养骨髓间充质干细胞,传至3代后随机分为4组,分别为空白组、转化生长因子β组、周期性拉伸应变组以及周期性拉伸应变＋转化生长因子β组,作用1,3,6 d后取出相应细胞,番红O染色观察大体形态,阿尔新蓝染色检测糖胺聚糖水平,ELISA检测上清液基质金属蛋白酶13及基质金属蛋白酶组织抑制剂1水平,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13及基质金属蛋白酶组织抑制剂1 mRNA相对表达量。结果与结论：番红O染色可见细胞呈长梭形或不规则三角形样改变,各实验组较空白组细胞数量及基质分泌增多。作用第3天时转化生长因子β组、周期性拉伸应变＋转化生长因子β组上清液糖胺聚糖水平较空白组均升高（P＜0.05）,周期性拉伸应变＋转化生长因子β组Ⅱ型胶原mRNA相对表达量较空白组增高（P ＜0.05）。结果提示转化生长因子β及周期性拉伸应变均可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,二者具有明显的协同作用。     

同种异体脱钙骨与骨髓间充质干细胞关节腔内共培养:与同腔软骨性状的对比简

背景：临床发现膝关节内游离体能长期存在于关节腔内并能保持一定的软骨组织学特性和生理学特性,因此大胆提出假设：关节腔环境可能是软骨细胞生长、发育的较佳环境并提出“腔内培养,腔内移植”的理念。目的：观察兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨基质体外培养或关节腔内培养组织工程软骨与同腔软骨的性状差异。 方法：实验分3组进行,体外培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质体外复合培养;腔内培养组将经成软骨诱导的乳兔骨髓间充质干细胞与成年兔脱钙骨基质以筋膜包裹,复合培养于成年新西兰兔膝关节腔内,以同腔内正常软骨为对照。 结果与结论：培养12周后：①体外培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞少量增生,胞核蓝染;甲苯胺蓝染色见软骨细胞排列无序,少量周围基质包绕;Masson染色阳性区域小,细胞排列无序;Ⅱ型胶原免疫组织化学见软骨细胞胞浆及胞外基质少量黄色颗粒。②腔内培养组苏木精-伊红染色见软骨细胞增生,胞核蓝染;甲苯胺蓝染色见软骨细胞成串排列,软骨陷窝形成,周围基质包绕;Masson染色阳性,软骨细胞多,基质蓝染,按一定应力方向排列;Ⅱ型胶原免疫组织化学见细胞外基质中出现较多棕黄色颗粒,Ⅱ型胶原染色阳性。说明骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物可在体外及膝关节腔内培养出组织工程软骨,关节腔内培养的软骨比体外培养的软骨更接近正常软骨。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

背景:骨髓基质干细胞的多向分化性不利于向软骨细胞单一方向分化,植入体内后成骨系细胞分泌的骨形态发生蛋白作用于非定向分化的前体细胞,使其向成骨细胞分化,而已定向分化的细胞则不受骨形态发生蛋白的影响,形成相应的组织.目的:体外诱导犬骨髓基质干细胞定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-03/2006-01在中山大学组织工程实验室完成.材料:选取4个月龄雄性家犬1只,骨髓基质干细胞取自犬肋骨.方法:自犬肋骨取骨髓2.0～3.0mL行体外原代骨髓基质干细胞分离培养.8～11d细胞接近融合时,加入胰酶消化,用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM合成培养液终止消化,收集细胞悬液,离心后,用培养液悬浮细胞,按1:3接种传代.取第3代细胞培养扩增,换液时加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子2mL,换液2次后,再加入1mg/L转化生长因β1 2mL诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化.主要观察指标:行甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.结果:骨髓基质干细胞体外行原代和传代培养至P4代生长良好,经碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1扩增诱导的细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性,显示被诱导的骨髓基质干细胞具备软骨细胞特性.结论:应用碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因β1体外可以诱导犬骨髓基质干细胞分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞.     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损

背景:以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况.目的:观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性.方法:将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料.术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色.结果与结论:实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组(P < 0.05).说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法.     

大鼠来源滑膜间充质干细胞的成软骨分化

背景：相比其他组织来源的间充质干细胞,滑膜间充质干细胞有着较强的成软骨特性和克隆能力,因此将是软骨组织工程中最有前景的种子细胞之一。 目的：培养及体外扩增 SD 大鼠滑膜间充质干细胞,鉴定其多向分化潜能及在添加生长因子后三维立体培养条件下的成软骨能力。 方法：无菌条件下获取SD大鼠滑膜组织,Ⅰ型胶原酶消化法分离大鼠滑膜间充质干细胞。体外扩增、培养,取第3代滑膜间充质干细胞进行吉姆萨、生长曲线测定、成脂诱导、成骨诱导和三维条件下成软骨诱导,成软骨诱导21 d后通过甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色及RT-PCR对成软骨诱导后产物进行检测。 结果与结论：获取的大鼠滑膜细胞具有间充质干细胞的特性,滑膜间充质干细胞在体外培养呈成纤维样形态,并维持着多向分化的能力。使用生长因子诱导软骨细胞21 d后,可见软骨样组织,蛋白聚糖和Ⅱ型胶原可以在甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色后被检测到。RT-PCR 检测结果显示软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA呈阳性表达。提示大鼠来源的滑膜间充质干细胞具有成软骨能力。     

Bio—gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化

背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,以细胞表面抗原进行鉴定。采用成软骨诱导培养基诱导第3代骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化作为实验组,设置普通培养基培养对照组,MTT比色法测试软骨细胞生长曲线,并行Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝染色等生物学鉴定。将第3代骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外复合培养行倒置相差显微镜、扫描电镜观察。结果与结论：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法获得了高纯度高活性的骨髓间充质干细胞,生长状态良好,扩增能力强,并成功诱导分化为软骨细胞。大量骨髓间充质干细胞在Bio-gide胶原膜上贴附增殖并复层生长,细胞与Bio-gide胶原膜逐渐融为一体;在胶原膜的断面可见胞体伸出突起相互连接包绕胶原膜,其间有明显细胞基质分泌。表明犬骨髓间充质干细胞可在Bio-gide胶原膜上生长并向软骨细胞分化。     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损（英文）

背景：以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况。目的：观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性。方法：将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料。术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色。结果与结论：实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组（P〈0.05）。说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法。     

膝关节腔内培养骨髓间充质干细胞复合脱钙骨的组织工程软骨

背景：如何更好地以组织工程学方法修复关节软骨缺损并达到良好的远期疗效目前尚无公识。目的：创新性地在膝关节腔内培养兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨的组织工程软骨。方法：采用全骨髓贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,DMEM／F12完全培养基培养,成软骨诱导条件培养基诱导分化。取同种异体兔的髂骨和椎体骨制作成脱钙骨支架,诱导后的骨髓间充质干细胞种植于脱钙骨支架上,培养1d后将细胞支架复合物用筋膜包裹置于兔左膝关节腔内培养,单纯脱钙骨支架筋膜包裹置入右膝关节腔。于培养第4,8,12周分别取材,行大体观察并制成石蜡切片,采用苏木精伊红染色、甲苯胺蓝染色,Ⅱ型胶原免疫组化染色方法进行组织学观察。结果与结论：培养4,8周,细胞一支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化的平均吸光度值（A）分别为0．263±0．031,0．340±0．052,单纯支架组标本分别为0．147±0．027,0．165±0．030,两组比较差异有显著性意义（P〈0．05）;培养12周细胞支架组标本Ⅱ型胶原免疫组化A值平均为0．362±0．037,标本类似正常软骨外观,Ⅱ型胶原免疫组化反应呈阳性;而单纯支架组脱钙骨支架降解。培养12周细胞一支架组苏木精一伊红染色结果显示细胞数量多,脱钙骨支架基本被吸收;而甲苯胺蓝染色结果显示有被染成紫红色的异染性基质形成。结果提示兔骨髓间充质干细胞复合同种异体脱钙骨可在兔膝关节腔内培养出组织工程软骨。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

纳米仿生复合支架的生物相容性

背景：纳米材料构建具有生物活性的组织工程骨,可以很好的模仿体内细胞外基质的结构,有利于细胞黏附、生长。目的：评价新型仿生壳聚糖/胶原纳米纤维支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性。方法：分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测;相差显微镜观察细胞形态。聚电解质共凝聚技术制作仿生壳聚糖/胶原纳米纤维支架,取生长良好的P3代,与仿生壳聚糖/胶原纳米纤维支架体外联合诱导培养,通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力、周期、细胞Ⅰ型胶原染色、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性。结果与结论：骨髓基质干细胞可在体外分离扩增,表达CD29、CD44和CD106,不表达CD34和CD45,细胞形态为长梭形,仿生壳聚糖/胶原纳米纤维平均孔径为150μm,与骨髓基质干细胞有较好的黏附性。提示骨髓基质干细胞可在体外长期、稳定培养;是理想的组织工程种子细胞;仿生壳聚糖/胶原纳米纤维与骨髓基质干细胞有良好的相容性,可用来做组织工程生物材料。     

纳米仿生复合支架的生物相容性

背景:纳米材料构建具有生物活性的组织工程骨,可以很好的模仿体内细胞外基质的结构,有利于细胞黏附、生长。目的:评价新型仿生壳聚糖/胶原纳米纤维支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性。方法:分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测;相差显微镜观察细胞形态。聚电解质共凝聚技术制作仿生壳聚糖/胶原纳米纤维支架,取生长良好的P3代,与仿生壳聚糖/胶原纳米纤维支架体外联合诱导培养,通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力、周期、细胞Ⅰ型胶原染色、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性。结果与结论:骨髓基质干细胞可在体外分离扩增,表达CD29、CD44和CD106,不表达CD34和CD45,细胞形态为长梭形,仿生壳聚糖/胶原纳米纤维平均孔径为150μm,与骨髓基质干细胞有较好的黏附性。提示骨髓基质干细胞可在体外长期、稳定培养;是理想的组织工程种子细胞;仿生壳聚糖/胶原纳米纤维与骨髓基质干细胞有良好的相容性,可用来做组织工程生物材料。     

微球化人脐带 Wharton 胶间充质干细胞移植裸鼠皮下构建异位软骨简

背景：软骨细胞外基质具有众多的信号分子蛋白和因子,其成分和特性最接近天然软骨组织,因而其很可能是构建组织工程软骨的最理想原料。 目的：探讨海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球复合人脐带Wharton胶间充质干细胞在裸鼠皮下异位构建组织工程软骨的可行性。 方法：制备软骨细胞外基质微丝悬液,将人脐带Wharton胶间充质干细胞接种于海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球中体外培养后植入裸鼠背部皮下（实验组）,以人脐带 Wharton 胶间充质干细胞混合于单纯藻酸盐凝胶微球作为对照组,于4周后取材进行大体和组织学苏木精-伊红、甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化观察。结果与结论：体外培养时微球中干细胞呈球形软骨细胞样形态,生长、增殖情况良好;实验组术后第4周取材可见外形呈类软骨样组织块,甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,镜下观察可见大量类软骨样细胞及类软骨陷窝样结构,植入的混合凝胶微球周围组织无明显炎症反应;对照组显示微球部分降解,周围仅有少量炎症细胞及淋巴细胞。结果可见海藻酸钙-软骨细胞外基质具有良好的组织相容性,复合干细胞形成的微球植入裸鼠皮下可以构建为类软骨样组织。     

骨膜复合骨髓间充质干细胞和软骨细胞体内移植修复软骨缺损

背景:以往主要采用磨削灌洗、钻孔、微骨折技术等对软骨缺损组织进行修复,但多数技术被认为具有一定的局限性,只能减轻患者疼痛或仅短期有效。近年来越来越多的研究表明,软骨组织工程修复技术对于软骨再生及修复具有重要意义。目的:观察自体骨膜复合骨髓间充质干细胞和软骨细胞修复兔膝关节髁间窝软骨缺损的效果。方法:取新西兰大白兔28只,随机均分为两组,建立双侧膝关节髁间窝关节软骨缺损模型,实验组左侧植入自体骨膜与骨髓间充质干细胞-软骨细胞复合物,右侧不植入任何材料作为空白对照;对照组左侧植入自体骨膜,右侧不植入任何材料作为空白对照。术后第8,12周,取膝关节软骨缺损部位新生组织,行大体、组织学观察及Wakitani评分。结果与结论:术后12周,实验组修复组织表面基本光滑,与周围软骨色泽极其相近,出现大量软骨细胞及软骨陷窝,形成软骨基质,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,甲苯胺蓝染色较深;对照组修复组织仍为白色,新生修复组织局部凹陷,表面欠光滑,质地较硬,仅有极少量软骨细胞,甲苯胺蓝染色较浅,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,无软骨基质形成;空白对照组软骨缺损塌陷,表面不规则,修复组织为纤维组织,甲苯胺蓝染色较浅。表明自体骨膜复合骨髓间充质干细胞与软骨细胞移植能够较好修复关节软骨缺损。     

骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景:半月板损伤后自行修复能力有限,组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径.骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞.取第3代的骨髓间充质干细胞,实验组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化,对照组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液.在诱导第7,14,21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果.结果与结论:①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d,第4代以后相对延长,为5～9 d.②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变.③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色,尤其细胞密集生长的区域蓝染较深,染色强度随诱导时间延长而增强.对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染.④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性,各期染色无明显差异.对照组未见Ⅱ型胶原表达,实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达.提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质,作为半月板组织工程种子细胞来源可行.     

同种异体脱钙骨基质复合自体骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损

背景:脱钙骨基质具有良好的生物相容性,是临床常用的骨缺损修复材料.骨髓基质干细胞具有向骨及软骨细胞分化的潜能,适合骨软骨缺损修复.目的:观察同种异体脱钙骨基质复合自体骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损的效果.方法:27只兔均建立骨软骨缺损模型,造模后随机分为3组:复合材料组钻孔植入复合自体骨髓基质干细胞培养8 d的脱钙骨基质块,单纯脱钙骨基质组钻孔单纯植入脱钙骨基质块,模型对照组钻孔后不植入任何材料.取材后对修复组织进行大体观察、组织学观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定,并参照Wakitani评分标准对修复组织进行评分.结果与结论:植入后12周,复合材料组修复组织呈透明软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨及软骨下骨结合良好;单纯脱钙骨基质组有部分软骨样修复;而模型对照组仅有少量纤维性修复.植入后12周,复合材料组、单纯脱钙骨基质组修复组织Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性,修复细胞表达Ⅱ型胶原,为软骨细胞;模型对照组呈阴性表达.植入后4,8,12周,复合材料组修复效果评分均显著优于单纯脱钙骨基质组、模型对照组(P<0.01).说明自体骨髓基质干细胞复合同种异体脱钙骨基质支架材料修复兔全层关节软骨缺损的效果良好.     

脂肪基质干细胞小肠黏膜下层双面复合的体外成软骨诱导

背景：使用体外构建的组织工程软骨治疗软骨损伤是目前的研究热点,材料与支架材料的选择仍有较多问题尚待解决。目的：观察脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物在体外经成软骨诱导培养基诱导分化的效果。方法：将第3代脂肪基质干细胞接种于复水后的小肠黏膜下层双面,加入成软骨诱导培养基,于体外诱导培养7d和14d后,使用实时荧光定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白,甲苯胺蓝染色观察细胞外基质,扫描电镜观察体外成软骨诱导14d后细胞在支架材料上的生长状况。结果与结论：Ⅱ型胶原mRNA实时荧光定量RT-PCR检测提示,体外成软骨诱导后7,14d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值与未诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物差异有显著性意义（P〈0.05）,诱导14d与诱导7d相比,差异亦有显著性意义（P〈0.05）。脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物成软骨诱导后14d,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性,甲苯胺蓝染色可见基质异染,未诱导的复合物Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。扫描电镜检测显示诱导14d时,细胞长满支架材料的双面。提示脂肪基质干细胞复合至小肠黏膜下层后,在体外经成软骨诱导培养基成软骨诱导后,能够向成软骨细胞分化。     

转化生长因子β1联合骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞的分化

背景:国内外许多学者成功利用转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化报道较多,而对骨形态发生蛋白2作为诱导因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的报道较少.目的:观察验证转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞下向软骨细胞表型转化的可能性及相互作用.方法:取健康Wistar大鼠骨髓,采用贴壁法筛选获得骨髓间充质干细胞.按添加生长因子的不同分为4组:转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2组,转化生长因子β1组,骨形态发生蛋白2组,对照组不添加任何生长因子.于诱导14 d后,分别进行阿利新蓝染色和二甲基亚甲蓝比色法定性定量检测糖胺聚糖的分泌表达,免疫组织化学法检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达.结果与结论:3个加入细胞因子的实验组在阿利新蓝染色和软骨特异性Ⅱ型胶原疫组化法检测中均有不同程度的阳性表达,糖胺聚糖的定量检测中,转化生长因子β1+骨形态发生蛋白2联合应用组的糖胺聚糖含量明显高于其他组(P<0.05).结果提示转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2联合作用更能促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化,分泌软骨特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源.     

藻酸钙复合材料构建组织工程化骨及软骨的实验

背景软骨组织工程的两个关键问题是种子细胞和支架材料,保证支架材料上有足够数量的功能细胞是体内形成骨和软骨组织的基础.目的对经体外培养的骨髓基质干细胞与藻酸钙载体及生长因子复合形成的组织工程性骨及软骨进行形态学观察.设计细胞形态对比,观察12周实验结果.单位郑州大学骨科研究所,上海第二医科大学骨科实验室.对象实验于2001-09/2002-06在上海第二医科大学骨科实验室完成.3月龄雄性新西兰大白兔9只,平均体质量3.2kg.方法复合材料分别为①藻酸钙.②藻酸钙+骨髓基质细胞.③藻酸钙+骨髓基质细胞+类胰岛素生长因子Ⅰ.④藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β.⑤藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子Ⅰ.将5种组合注射于同一个体新西兰大白兔背部不同部位皮下组织中,每组各注射2处,共10处,每处0.2mL,分别做好标记.按组分别于术后4,8,12周取材,各时间点处死动物3只,取兔背部皮下增殖物进行骨和软骨组织生成物观察,应用苏木精-伊红、甲苯胺蓝、Masson、番红-O染色技术.主要观察指标兔背部皮下增殖物的组织学观察.结果兔背部皮下增殖物的组织学观察结果4周时可见藻酸钙+骨髓基质细胞+类胰岛素生长因子Ⅰ、藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β、藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子Ⅰ组有岛状软骨样组织形成,软骨细胞包绕于碱性基质中,8周时复合物中形成大量的类软骨结构,并部分向骨组织转化,细胞周围有大量的基质分泌,部分软骨细胞呈簇状分布.12周时藻酸钙+骨髓基质细胞+转化生长因子β+类胰岛素生长因子Ⅰ组软骨组织基本转变为骨组织,并开始吸收.结论骨髓基质细胞-藻酸钙-生长因子复合材料能形成软骨及骨组织.藻酸钙适合骨髓基质细胞生长,是一种良好的骨及软骨组织工程载体.