大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性

用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),体外培养传代扩增,观察细胞生长特性,对细胞进行免疫组化染色鉴定,电镜观察细胞形态。动态观察示培养细胞具有不断增殖的干细胞特性,并保持细胞活性。证实密度梯度离心结合贴壁法以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。本研究可为临床进行细胞移植奠定基础。     

成人骨髓间充质干细胞的纯化及部分生物学特性的研究

目的探讨成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells或bone maglow stroma cells，MSCs)体外纯化的方法，观察其生物学特性，为其在风湿病治疗中应用提供了初步实验体系和依据。方法抽取健康正常人骨髓3-5ml，Percoll分离液分离后低糖达氏修正依氏培养基(LG—DMEM)培养，流式细胞仪检测表面标记物与细胞周期，绘制生长曲线，并对长时间培养的传代细胞行碱性磷酸酶(AKP)染色及Von Kossa染色。结果①经分离出的细胞为MSCs；②经自然纯化。第2代细胞(P2)与第3代细胞(P3)均质性分别达90％及98％以上；③纯化后，细胞在第3代(P3)细胞增生旺盛，第7代(P7)后细胞呈增长缓慢趋势；④MSCs长期培养，有向成骨细胞分化的趋势。结论利用MSCs特性，经自然纯化．是当前纯化MSCs的一种较好且行之有效的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的初步研究

目的探讨体外培养、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法,诱导MSCs向神经元样细胞定向分化。方法取大鼠骨髓,采用贴壁培养筛选法分离MSCs,进行培养扩增,观察其生物学特性;用IBMX诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。结果大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离,并可在体外大量扩增,经IBMX诱导,MSCs可向神经元样细胞分化,出现胞体和突起,细胞免疫化学染色神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白呈阳性。结论MSCs易分离和培养,体外培养条件下生长良好,可连续传代,诱导剂作用下可分化出神经元样细胞。     

三氧化二砷对K562细胞生长及Ki-67和Survivin表达的影响

目的：探讨三氧化二砷(As2O3)对K562细胞生长的影响及K562细胞对As2O3的抵抗机制。方法：以不同浓度As2O3作用于K562细胞后，用四唑盐(MTT)比色法分析细胞的生长增殖，用台盼蓝排斥试验观察细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡以及Ki-67抗原和Survivin的表达。结果：2μmol／L As2O3能明显抑制K562细胞生长，但细胞活力、增殖相关抗原Ki-67的降低和凋亡发生在5μmol／L As2O3作用48h后才较为明显；同时As2O3作用后抗凋亡蛋白Survivin的表达均有不同程度的增加。结论：As2O3能有效抑制K562细胞的生长，但对细胞增殖能力的抑制及凋亡的诱导作用不如前者明显；Survivin的表达增加可能是K562细胞对As2O3诱导凋亡的抵抗机制之一。     

乙型肝炎患者骨髓间充质干细胞培养方法的优化和生物学特性

目的比较乙型肝炎患者骨髓间充质干细胞（MSCs）多种体外培养方法的效果，确定乙型肝炎患者MSCs的最佳体外培养方案；并对其生物学特性进行初步研究。方法比较2种接种方案和5种不同成分培养液的乙型肝炎患者MSCs体外培养成功率。比较5种不同成分培养液和4种换液方案的乙型肝炎患者MSCs生长曲线。进行乙型肝炎患者MSCs的形态观察和表面分子鉴定，传代培养以初步了解其生长特性。结果密度梯度离心接种法的体外培养成功率（88％）高于全骨髓接种法（76％），但差异无统计学意义。5种培养液的体外培养成功率差异有统计学意义（P〈0．01），其中患者自体血清培养液的培养成功率最高（100％），3种FBS培养液的培养成功率次之，健康成人血清培养液的最低（56％）。患者自体血清培养液的MSCs生长曲线最高，健康成人血清培养液的生长曲线最低，3种FBS培养液的MSCs生长曲线集中位于上述两者之间。以2d或者3d一次全量换液的MSCs生长曲线较高。乙型肝炎患者MSCs与正常人MSCs形态相同，表面分子表达一致，生长特性近似。结论乙型肝炎患者MSCs的体外培养方案以密度梯度离心法分离后，自体血清培养液进行培养，2～3d全量换液为佳，可以较快获得纯度较高的MSCs。乙型肝炎患者MSCs的生物学特性和正常人的近似。     

白藜芦醇对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的 探讨白藜芦醇对白血病K562细胞生长的影响及相关作用机制.方法 用不同浓度白藜芦醇作用于K562细胞,CCK-8法观察白藜芦醇对K562细胞生长增殖的影响,AnnexinV-FITC/PI双染法观察白藜芦醇对K562细胞凋亡的影响,PI染色法观察白藜芦醇对K562细胞周期的影响,Western blot法检测K562细胞中的Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Cyclin D1蛋白.结果 白藜芦醇作用后的K562细胞的增殖被抑制并且凋亡增加,呈时间-剂量依赖性;同时,凋亡相关分子Bcl-2、Bcl-xl表达下调,Bax表达上调;白藜芦醇作用K562细胞后,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞周期调节蛋白Cyclin D1表达下降.结论 白藜芦醇可抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与下调细胞内Bcl-2、Bcl-xl、Cyclin D1表达并上调Bax的表达有关.     

白血病细胞铁变化对TPA诱导K562细胞生长分化的影响

目的：通过改变细胞培养时铁状态,观察TPA诱导K562细胞分化过程中细胞铁对K562细胞生长分化的影响,探讨铁与白血病细胞诱导分化的关系。方法：应用体外细胞培养技术,观察不同铁水平K562细胞生长抑制率;用非特异性酯酶染色观察细胞生长分化情况。结果：在TPA诱导K562细胞分化过程中TPA组和TPA＋Fe组K562细胞生长抑制率分别为8.67%、6.01%,而TPA-Fe组98.88%。对照组及TPA-Fe组K562细胞NSE染色阳性率为15.5%和13%,以弱阳性为主,氟化钠抑制率分别为16.13%和19.23%;TPA、TPA＋Fe组K562细胞NSE染色呈阳性和强阳性,阳性率分别为86%、88%,且这两组K562细胞氟化钠抑制率分别为58.72%、61.93%。结论：铁剥夺可明显抑制K562细胞生长、阻止TPA诱导K562细胞分化,故铁剥夺剂（DFO）可能作为一种辅助抗癌药用于白血病的化疗,但由于它能阻止白血病细胞的分化,故不宜用于白血病的诱导分化治疗。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外分离、纯化及扩增的方法及对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法采用贴壁筛选法分离大鼠MSCs，并通过不断传代进行纯化和扩增培养，检测大鼠MSCs生长周期，绘制细胞生长曲线。结果大鼠MSCs在体外分离培养扩增，大鼠MSCs形态呈长梭形，细胞周期显示第3代MSCs约有81．48％的细胞处于G0／G1期，细胞生长曲线呈S形。结论所建立的分离和培养方法获取的大鼠MSCs具有生物学特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的生物学特性,对其表型和生长曲线进行初步鉴定.方法 采用全骨髓培养法提取培养MSCs,绘制原代及三代细胞生长曲线,利用免疫组化法检测表面标志物CD34、CD44;流式细胞分析法检测表面标志物CD90.结果 成功培养出MSCs,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.结论 该实验分离培养的细胞群与MSCs的生物学特性相吻合,说明MSCs易于体外分离、培养和扩增.     

结肠炎大鼠炎症黏膜提取液对骨髓间质干细胞增殖和表面分化抗原的影响

背景:动物实验和临床试验均表明间质干细胞(MSCs)对受损肠道组织有一定修复作用,然而目前尚不清楚肠道炎症微环境对MSCs移植治疗炎症性肠病(IBD)有何影响。目的:通过体外实验观察结肠炎大鼠模型肠道炎症黏膜提取液对骨髓MSCs增殖和表面分化抗原的影响。方法:以全骨髓贴壁法分离和原代培养大鼠MSCs并行传代扩增。取三硝基苯磺酸(TNBS)结肠炎大鼠模型肠道炎症黏膜提取液(0、1、2、3 ml)与MSCs共培养,倒置相差显微镜观察各组细胞贴壁和生长情况,绝对计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面分化抗原表达。结果:全骨髓贴壁法可成功分离MSCs,所获细胞CD29、CD44表达阳性,CD105表达低度阳性,CD34、CD45表达阴性。3 ml炎症黏膜提取液处理组MSCs接种6 h后见细胞贴壁,36 h开始克隆性增生,此后细胞增殖速度较空白对照组明显加快,第6 d即达100%融合,但表面分化抗原表达与空白对照组相比无明显变化。结论:结肠炎大鼠炎症黏膜提取液可促进骨髓MSCs增殖,但对细胞表面分化抗原无明显影响。     

DC与CIK或LAK联合对结肠癌细胞株SW480杀伤作用的研究

[目的]研究树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导或未诱导的杀伤细胞(CIK)或淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)对结肠癌细胞株SW480的杀伤活性.提供DC联合CIK或LAK治疗结肠癌的实验依据.[方法]取人外周血分离出单个核细胞(PBMNC),诱导生成DC、CIK、LAK细胞;流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后的表型变化;以CIK+DC细胞、CIK细胞、LAK+DC细胞及LAK细胞作为效应细胞,SW480为靶细胞,以15∶1、30∶1、45∶1为效靶比,LDH释放法测定细胞杀伤试验活性;ELISA检测杀伤试验中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、IL-12、IL-17的分泌水平.[结果]流式细胞仪检测DC经SW480肿瘤抗原冲击后,其表面分子HLA-DR、CD40、CD80和CD86表达分别平均为90.23％、73.68％、85.96％、57.55％,与未经肿瘤抗原冲击DC比较,DC成熟的表面标志分子表达明显增加(P＜0.01).相同效靶比下,CIK+DC细胞组对SW480的杀伤作用最强,明显高于其他细胞组(P＜0.01);CIK+ DC细胞组在效靶比为45∶1时,杀伤活性最强(P＜0.01);单独CIK细胞组的杀伤活性明显高于LAK+DC细胞组(P＜0.01);LAK+ DC细胞组的杀伤活性明显高于单独LAK细胞组(P＜0.01).效靶比为45∶1时,各杀伤试验细胞组上清液中IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17的分泌量,CIK+DC细胞组的IFN-γ、IL-12的分泌量显著高于其他细胞组(P＜0.05);LAK+DC、单独LAK细胞组IL-2的分泌量明显高于CIK+DC、单独CIK细胞组(P＜0.05);单独CIK细胞组IFN-γ的分泌量明显高于LAK+DC、单独LAK细胞组(P＜0.05).[结论]CIK+DC细胞组对SW480的杀伤活性明显强于单独CIK、LAK+ DC组、单独LAK细胞组.其机制可能是,SW480抗原致敏的DC分泌IFN-γ、IL-12等刺激、诱导CIK细胞的活化和增殖,明显增强CIK细胞杀伤SW480的活性.     

树突状细胞对不同诱导时间LPAK抗肝癌作用的影响

目的　比较ＤＣ对诱导４ ｄ（Ｌ４） 和诱导７ ｄ（Ｌ７） 的ＬＰＡＫ 细胞体外杀伤人肝癌细胞株ＢＥＬ－ ７４０２（Ｂ） 的杀伤力和杀伤模式的影响．方法　Ｌ４ 组为Ｂ＋ Ｌ４ ,ＬＤ４ 组为Ｌ４ 组＋ ＤＣ;Ｌ７ 组为Ｂ＋ Ｌ７ ,ＬＤ７ 组为Ｌ７ 组＋ ＤＣ．Ｌ４ 和Ｌ７ 与Ｂ的效靶比均为５∶１ 和１０∶１两种． 采用杀伤细胞检测技术及电镜技术,比较各组的杀伤效应和杀伤模式．结果　各组的细胞毒活性为ＬＤ４ ＞ Ｌ４（ Ｐ＜ ０－０１） ,ＬＤ７ ＞ Ｌ７（ Ｐ＜ ０－０１） ．Ｌ４ 组和ＬＤ４ 组的ＢＥＬ７４０２ 细胞呈现不同程度的变性坏死,Ｌ７ 组和ＬＤ７ 组的ＢＥＬ７４０２ 细胞则呈现不同程度的凋亡改变．结论　ＤＣ对不同诱导时间的ＬＰＡＫ 细胞体外杀伤肿瘤细胞都有明显的促进作用,但并不改变ＬＰＡＫ 细胞对肿瘤细胞的杀伤模式．     

人类胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞的研究进展

人类胚胎干(hES)细胞具有极其强大的增殖能力,理论上具有分化为机体所有组织细胞的潜能.治疗性克隆技术可用于制备带有患者基因型的hES细胞及其分化而来的胰岛素分泌细胞,但存在激烈的伦理学争论.新近,通过体外转基因处理可诱导人类体细胞重构形成hES样的多潜能干细胞.本文着重介绍hES细胞定向分化为胰岛素分泌细胞的研究进展.     

祖细胞和干细胞与缺血性疾病的治疗

缺血性疾病是严重危害人类健康的疾病之一,主要包括缺血性脑血管疾病、缺血性心血管疾病、下肢缺血性疾病等。祖细胞和干细胞都是具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下,它们可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞,虽然胚胎干细胞具有万能分化型功能,但伦理学方面的争议使其研究困难重重,而成体干细胞相较胚胎干细胞,不仅避免了伦理学方面的争议问题,而且无移植后免疫排斥反应。本文主要讨论成体干细胞和祖细胞在缺血性疾病中的应用。近年来,关于祖细胞和干细胞在缺血性疾病中应用的研究日益增多,受到了广泛的关注,为我们提供了一条治疗缺血性疾病的新思路。     

Clusterin induces differentiation of pancreatic duct cells into insulin-secreting cells

Aims/hypothesis We recently reported that expression of the gene encoding clusterin (Clu) is upregulated in the regenerating pancreas, particularly in tissues undergoing differentiation. This led us to propose that clusterin participates in the cytodifferentiation of pancreatic tissue, particularly the endocrine islet cells. The aim of this study was to investigate whether clusterin induces the differentiation of duct-lining cells into insulin-secreting cells. Methods We isolated ductal tissue from rat pancreas and cultured it to develop epithelial cell explants for transfection of the Clu cDNA as well as for treatment of clusterin protein. Results The number of newly differentiated insulin cells increased 6.9-fold upon Clu overexpression compared with controls. Ins1 mRNA and peptide levels were also increased. Furthermore, glucose-stimulated insulin secretion was observed in the differentiated insulin cells. These cells were immunoreactive for insulin and C-peptide, but negative for other islet hormones and for cytokeratin-20, which indicates a fully differentiated state. Insulin cell differentiation was also increased in a dose-dependent manner by treating duct cells in culture with clusterin, indicating a growth-factor-like action of clusterin in insulin cell differentiation. Conclusions/interpretation These results suggest that clusterin can be considered as a potential morphogenic factor that promotes differentiation of pancreatic beta cells.     

Thymic stromal cells support differentiation of natural killer cells from CD34+ bone marrow cells in vitro

Abstract: Natural killer (NK) cells are CD3^? CD56⁺ lymphocytes characterized by exhibiting non-MHC restricted cytotoxicity. A developmental relationship between NK cells and T lymphocytes has been proposed, and, moreover, the thymus has been shown to contain NK cell precursors. In this study we utilized an in vitro assay, devised to study T-lymphocyte development from bone marrow progenitors, to investigate the ability of thymic stromal cells to support generation of NK cells from CD34⁺ bone marrow cells. CD34⁺ cells purified from healthy adults were seeded on adherent thymic stromal cells. The cells emerging after culture were phenotypically characterized by flow cytometry. We show that lymphocytes expressing the phenotypical characteristics of NK cells were generated from CD34⁺ bone marrow cells, and that these cells represented 1% of the cells recovered from the cultures. Furthermore, this was accomplished without supplement of exogenous interleukin 2 which is required for NK cell differentiation in bone marrow cultures.     

树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对胃癌细胞杀伤作用

目的探讨树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对胃癌细胞的杀伤作用。方法采用胃癌患者自身血液中单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),经体外诱导分别扩增出DC和CIK细胞,二者共同培养后,利用MTT法检测DC细胞联合CIK细胞体外杀伤人胃癌细胞株(MNK-45、MNK-28、SG-7901)的活性。结果DC与CIK细胞共培养后得到的细胞群高表达CD3 CD56 ,平均值达到(56.74±7.63)%。通过彼此相互作用诱导出的细胞群体对胃癌细胞株MNK-45、MNK-28、SG-7901有杀伤作用,且杀伤活性随着效靶比的增加而增强。结论DC与CIK细胞共培养后有很强的增殖能力,对胃癌细胞具有杀伤活性,且其杀伤作用与胃癌细胞类型无相关性。     

造血干细胞分化成肝细胞的可能性

来自骨髓的造血干细胞具有干细胞的多向分化的潜能.近年来有研究表明,在特定微环境下,造血干细胞能诱导分化成肝细胞,也有研究对此表示争议.本文对造血干细胞是否能有效诱导分化成肝细胞作简要综述.     

Origin of stellate cells from submesothelial cells in a developing human liver

Background: The embryonic origin of liver stellate cells is unknown. Methods: We investigated the development of stellate cells in histological sections of human liver of 7–20 weeks gestation, using neural cell adhesion molecule (N‐CAM) to highlight stellate cells by the immunoperoxidase method. Results: We observed a layer of submesothelial cells beneath the liver capsule in the first trimester of gestation, which express N‐CAM and desmin antigens by the immunoperoxidase method but not epithelial‐cadherin, smooth muscle actin or CD34 antigens, unlike hepatocytes and similar to septum transversum mesenchyme. In embryonic liver, stellate cells appeared to grow from pockets of submesothelial cells, with transitional forms observed between the cell types. The submesothelial cells morphologically resemble those described during the rapid growth phase in avian liver, which have been shown to be precursors of stellate cells. There is considerable evidence for epithelial–mesenchymal interactions during development, and we have also found that hepatocytes adjacent to the capsule and around the portal tracts show enhanced expression of β‐catenin in developing liver. These are sites in which stellate cells appeared to be concentrated. Conclusion: We present evidence to suggest that stellate cells originate from submesothelial cells, which possibly derive from the septum transversum.