三叶木通AFLP反应体系的建立及优化

目的 为研究三叶木通种质资源遗传多样性,建立并优化三叶木通AFLP反应体系.方法 以三叶木通叶片为材料,对影响AFLP反应体系中连接、预扩增和选择性扩增的各因素进行分析,建立优化的AFLP反应体系.结果 建立三叶木通AFLP反应优化体系:连接体系加入T4连接酶2 U,Mse I接头100 pmol,EcoR I接头10 pmol;预扩增反应总体积20 μL,加入连接产物2.0μL,E-0、M-0各100 ng,dNTPs 0.250 mmol/L,Mg2+1.875mmol/L,Taq DNA聚合酶2 U;选择性扩增反应总体积20 μL,加入5 μL稀释100倍的预扩增产物,E3、M3各50 ng,dNTPs 0.250 mmol/L,Mg2+1.875 mmol/L,Taq DNA酶1.5 U.结论 建立适用于三叶木通种质资源遗传多样性研究的AFLP反应优化体系.     

丹参DNA甲基化MSAP分析条件的建立和优化

以丹参叶片为材料,利用MSAP技术检测丹参基因组DNA甲基化差异,对MSAP体系中的预扩增、选择性扩增体系及电泳时间进行了优化。结果表明MSAP最佳反应体系为酶切反应:HpaII/MspI 10 U,EcoR I 10 U;最佳预扩增体系为25μL反应体系中,含rTaq酶0.2μL、Mg2+2.0μL、模板DNA 2.0μL、dNTPs 2.0μL和上下游引物E00/HM00各1.5μL;最佳选择性扩增体系为25μL体系中,含rTaq酶0.2μL、Mg2+2.0μL、预扩增稀释100倍产物2.0μL、dNTPs 2.0μL和上下游引物各1.0μL;最佳电泳时间为5h。该检测方法方便快捷,为进一步深入研究分析丹参DNA甲基化地域差异奠定了基础。     

何首乌ISSR—PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化ISSR-PCR反应体系.方法 通过单因素实验研究ISSR反应体系中主要成分(模板、Taq DNA聚合酶、Mg2 、引物、dNTPs)以及退火温度对扩增结果的影响.结果 建立了适合何首乌ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μl反应体系中,内含1×Taq酶配套缓冲液、100ng模板、1.5 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2 、0.6μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为94℃预变性5 min;然后是94℃变性45s,(据不同引物的退火温度)复性1 min,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行何首乌鉴定及种质资源遗传多样性分析提供了一个标准化程序.     

药用植物胡黄连ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 优选胡黄连稳定的ISSR-PCR反应体系.方法 采用4因素(dNTPs、Mg2+、Taq酶、引物)4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法.结果 适于胡黄连的25 μl的ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer2.5 μl,dNTPS150 μmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq酶1U,引物0.5μmol/L,DNA20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs150 μmol/L,Mg2+2 mmol/L,Taq酶0.5U,引物0.5 μmol/L,DNA20 ng.结论 对于胡黄连ISSR-PCR实验,一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系.     

金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究

目的建立金钗石斛Dendrobiumnobile相关序列扩增多态性(SRAP)反应体系,为金钗石斛分子生物学研究提供技术支持。方法运用L25(56)正交设计对影响金钗石斛SRAP反应的5个因素:模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物在5个水平上进行优化试验,对PCR结果进行极差分析。结果金钗石斛SRAP反应最佳体系为:25μL PCR体系中含有20 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs,1 UTaq酶,0.6μmol/L引物。各因素对SRAP反应的影响依次为:Taq酶Mg2+dNTPs模板DNA引物。结论所建立的金钗石斛SRAP反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点,可用于金钗石斛分子生物学的研究。     

综合评分法优化柴胡RAPD-PCR反应体系

目的采用综合评分法优化柴胡RAPD-PCR的反应体系.方法以柴胡基因组DNA为模板,应用L16(4 5)正交表.研究了Taq酶、Mg2 、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种RAPD反应组分浓度变化对扩增结果的影响.结果优化反应体系为25 μL反应体系中含有1 × buffer、Taq 酶1.5 U、Mg2 2.5 mmol/L、引物0.4 μmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、模板DNA50ng.结论综合评分法能客观高效的优化柴胡RAPD反应体系.     

何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化

目的 建立何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性(SRAP)分子鉴定技术体系.方法 正交优化影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量.结果 20 μl反应体系的优化组合为:Mg2+ 2.5 mmol/L,dNTPs 0.4 mmol/L,引物0.35μmol/L,Taq酶1U.结论 Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量对不同物种SRAP-PCR结果有不同程度影响,利用SRAP分子鉴定前应对此4因素进行优化.     

桔梗ISSR反应体系的建立和优化

目的建立并优化桔梗ISSR-PCR反应体系和扩增程序。方法采用正交试验和单因子试验,对ISSR反应体系主要因子(dNTPs、Taq酶、引物、Mg2+、模板)进行筛选。之后通过单因子试验,进行引物退火温度、循环次数的筛选。结果桔梗ISSR-PCR的最佳反应体系(20μl)为:dNTPs 0.25mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.30μmol/L、Mg2+1.50mmol/L、模板DNA10ng。利用此反应体系从54条引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,确定了引物UBC853[序列为(TC)8RC]的最佳退火温度为55℃和循环次数为45次。结论建立的桔梗ISSR-PCR反应体系,经过白、紫花桔梗共20份样品检验,证明该体系具有稳定性和可靠性,可用于桔梗遗传多样性研究。     

利用综合评分法优化柴胡ISSR-PCR反应体系

目的研究柴胡ISSR-PCR的最佳反应体系。方法应用综合评分法,对Taq酶、Mg2+、引物、总DNA和dNTPs 5种ISSR反应成分进行优选。结果优化反应体系为:25μL反应体系中含有1×buffer、Taq酶1.0 U、Mg2+2.5 mmol.L-1、引物0.4μmol.L-1、DNA 75 ng、dNTPs 0.3 mmol.L-1。结论综合评分法优化柴胡ISSR反应体系可行,为下一步试验提供了可靠参数。     

药用植物胡黄连ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 优选胡黄连稳定的ISSR-RCR反应体系.方法 采用4因素(dNTRs、Mg~(2+)、Taq酶、引物)4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法.结果 适于胡黄连的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素最佳浓度分别为10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)1.5mmol/L,Taq酶1U,引物0.5 μmol/L,DNA 20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)2 mmol/L,Taq酶0.5 U,引物0.4 μmol/L,DNA 20 ng.结论 对于胡黄连ISSR-RCR试验,一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系.     

蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化

目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.     

地龙ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化地龙ISSR-PCR反应体系.方法 以地龙药材为实验试材,采用异丙醇沉淀法提取了地龙总DNA模板,对地龙ISSR-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选.结果 建立了标记位点清晰、稳定、重复性好,可用于地龙ISSR分析的最佳反应体系,50 μl体系中含有:1×Taq酶配套缓冲液,DNA模板50 ng,2.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgCl2,0.8 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸5 min,反应结束后,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行地龙类药用动物鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础.     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序.为探讨夏枯草种质问遗传多样性奠定基础.方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究.Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响.结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20 μL的反应体系中含模板DNA 30ng,Mg2+ 2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U.在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.并通过梯度PCR试验.确定引物最佳退火温度.结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析.     

半夏试管块茎银染mRNA差异显示条件的建立及优化

目的：建立半夏试管小块茎DDRT-PCR反应最佳体系，为进一步研究半夏试管小块茎相关基因表达提供技术参考。方法：以半夏试管苗的叶柄﹑试管小块茎为材料，利用正交试验设计，研究模板。Mg²⁺，dNTPs，引物和DNA聚合酶等因素，对DDRT-PCR反应体系的影响。结果与结论：20 μL 的反应体系中含有dNTPs 150 μmol·L^-1，Taq酶0.6 U，锚定引物2 μmol·L^-1 ,随机引物1 μmol·L^-1，Mg²⁺ 2.5 mmol·L^-1，2 μL 10×buffer和2.5 μg的cDNA模板。各因素影响程度依次为Taq酶＞cDNA 模板＞dNTPs＞Mg²⁺＞引物。     

喀西茄AFLP技术体系的建立与优化

目的研究建立一套适合于喀西茄的AFLP技术体系。方法比较CTAB法和改良CTAB法提取DNA的效果;设置不同浓度梯度的引物、dNTPs和Mg2+,优化选择性扩增体系。结果改良CTAB法提取的DNA质量优于CTAB法,加入50 ng/μl的两种引物各1.0μl,2 mmol/L dNTPs 2.4μl和25 mmol/LMg2+1.6μl的选择性扩增体系最优。结论建立了适合于喀西茄的AFLP技术体系。     

基于方差分析优化菊花ISSR-PCR反应体系

目的 对影响药用菊花ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础.方法 基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg~(2+)、dNTP和引物等4因素3水平对药用菊花反应体系进行优化.结果 药用菊花ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.00 U,Mg~(2+)2.00 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,引物0.50μmol/L.结论 Taq酶、Mg~(2+)、dNTP等对ISSR反应结果有极显著影响.所建立的药用菊花ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究.     

三角叶黄连ISSR反应体系的建立与优化

目的 针对三角叶黄连ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系,为进一步研究三角叶黄连的种质资源遗传多样性奠定基础.方法 通过筛选引物并设定影响三角叶黄连ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测其不同反应体系的扩增效果,分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立三角叶黄连ISSR-PCR稳定可靠的反应体系.结果 建立了可用于三角叶黄连ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25 μLPCR反应体系中,内含10×PCR Buffer 2.5 μL,1.5 mmol/L Mg~(2+),200 μmol/L dNTP,0.3 μmol/L 引物,40 ng模板,1.0 U Taq DNA聚合酶.扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性60 s,72℃延伸90 s,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存.结论 所建立的三角叶黄连ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,可以较好地应用于三角叶黄连的种质资源遗传多样性及居群鉴别的研究.     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq酶1.00 U、Mg2+1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25mmol/L、引物0.50μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

铁皮石斛居群差异的研究ⅡISSR指纹标记方法的建立与优化

目的:针对铁皮石斛ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR分子指纹标记反应体系,为进一步研究铁皮石斛的居群差异奠定基础。方法:通过筛选引物并设定影响铁皮石斛ISSR反应的诸因子的不同浓度,检测IS-SR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立铁皮石斛ISSR稳定可靠的反应体系。结果与结论:首次建立了可用于铁皮石斛ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25μL PCR反应体系中,10×Taq酶配套缓冲液,1.5 U Taq DNA聚合酶,1.2～1.8 mmol.L^-1MgCl₂,80μmol.L^-1dNTP,0.2μmol.L^-1引物,DNA模板约20 ng,退火温度52～60℃;实验表明:Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响。所建立的铁皮石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可以较好地应用于铁皮石斛的居群鉴别及居群分子生态的研究。