刺五加Actin 基因cDNA 全长序列的克隆与生物信息学分析

目的：克隆刺五加Actin 基因的全长cDNA 序列,并对其进行生物信息学分析。方法：以刺五加的叶片为材料,提取总RNA,逆转录为cDNA,根据初步克隆到的刺五加Actin 基因保守序列设计引物,利用套式PCR 进行3' 和5'RACE 扩增,得到Actin 基因的3' 和5' 端cDNA 序列片段,拼接获得cDNA 全长。将该序列进行BLAST 比对、相似度分析,并对刺五加Actin1 蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果：刺五加的Actin 基因全长1 507 bp,命名为ESActin1,注册号KC469585 。该基因开放阅读框（ORF）长1 134 bp,编码377 个氨基酸,5' 端非编码区长140 bp,3' 端非编码区长233 bp。ESActin1 与GenBank 中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在75%以上,蛋白质序列的相似性在94%以上。结论：首次报道了刺五加Actin 基因的全长cDNA 序列,为刺五加的分子生物学研究奠定基础。     

刺五加鲨烯环氧酶基因cDNA的克隆及序列分析

目的:对刺五加鲨烯环氧酶基因的cDNA进行克隆及序列分析。方法:采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参SE基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SE基因的cDNA序列。结果:克隆了2个序列不同的cDNA(SE1和SE2),开放阅读框分别长1 665,1 629 bp,分别编码554,542个氨基酸。SE1,SE2间的核苷酸和氨基酸一致性分别为91.49%,92.55%,两者与三七SE1的氨基酸序列相似性最高,分别为93.45%,94.87%。SE1,SE2均含有1个FAD结合区域,SE1,SE2推测的氨基酸分别存在2个和4个跨膜螺旋。结论:首次分离并报道了刺五加的2个SE基因cDNA序列,为刺五加的次生代谢工程研究奠定了基础。     

刺五加GAPDH基因组DNA的克隆与分析

目的克隆刺五加GAPDH基因的DNA及启动子序列,并进行生物信息学分析。方法以刺五加的基因组DNA为模板,采用PCR和TAIL-PCR技术克隆GAPDH基因的全长DNA序列及5’端上游启动子序列,并对其进行生物信息学分析。结果克隆到长4 103 bp的刺五加GAPDH基因全长DNA及启动子序列。该基因共包含12个外显子和11个内含子,其剪切均符合GT-AG原则。刺五加GAPDH的启动子片段长1 304 bp,转录起始位点A位于起始密码子ATG上游61 bp处。启动子除含有TATA-box、CAAT-box等基本元件外,还有诸多与激素应答、光响应和胁迫信号等有关的顺式作用调控元件。结论首次克隆到刺五加GAPDH基因的全长DNA及启动子序列,为深入研究GAPDH基因结构特征与功能奠定基础。     

刺五加MDD基因启动子的克隆与生物信息学分析

目的克隆并分析刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的启动子序列。方法根据刺五加MDD基因的c DNA序列,采用PCR扩增和热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术,克隆MDD基因5’端的DNA序列及启动子序列。利用Plant CARE等软件对其进行生物信息学分析。结果克隆得到长1 423 bp的刺五加MDD基因启动子序列及长1 024 bp的5’端DNA序列。该启动子序列含有49个TATA-box、25个CAAT-box。还含有脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、胚乳表达必须顺式作用元件、干旱胁迫响应元件、光响应元件等多种顺式作用元件,以及2个MYBHv1与2个MBY结合位点。结论首次克隆并分析了刺五加MDD基因的启动子序列,为该基因的表达调控奠定了基础。     

刺五加Actin基因cDNA全长序列的克隆与生物信息学分析

目的：克隆刺五加Aetin基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。方法i以刺五加的叶片为材料,提取总RNA,逆转录为cDNA,根据初步克隆到的刺五加Actin基因保守序列设计引物,利用套式PCR进行3’和5＇RACE扩增,得到Aetin基因的3’和5’端cDNA序列片段,拼接获得cDNA全长。将该序列进行BLAST比对、相似度分析,并对刺五加Aetinl蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果：刺五加的Aetin基因全长1507bp,命名为ESActinl,注册号KC469585。该基因开放阅读框（ORF）长1134bp,编码377个氨基酸,5’端非编码区长140bp,3’端非编码区长233bp。ESAetin1与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在75％以上,蛋白质序列的相似性在94％以上。结论：首次报道了刺五加Actin基因的全长cDNA序列,为刺五加的分子生物学研究奠定基础。     

刺五加肌动蛋白基因的克隆和表达稳定性分析

目的 克隆刺五加Eleutherococcus senticosus的肌动蛋白(actin,ACT)基因并使其成为可用的内参基因.方法 运用RT-PCR法克隆ACT基因的部分序列,并以其为内参基因进行半定量PCR和real-time PCR分析.结果 克隆了长度为1 031bp的刺五加ACT基因,推测其编码343个氨基酸,与光皮桦Betula luminifera、陆地棉Gossypium hirsutum、茶树Camellia sinensis的ACT氨基酸序列同源性分别为99.42％、98.83％、98.54％.刺五加ACT基因在不同器官和不同生长发育时期的表达量基本恒定,以其为内参基因的半定量PCR和real-time PCR均具有良好的扩增效果和重现性.结论 首次分离并报道了刺五加ACT的cDNA克隆,证实该序列可以作为基因表达分析的内参基因,建立了其real-time PCR反应体系.     

针刺影响的衰老相关基因全长序列的克隆及分析

脑衰老在机体衰老中起重要作用。脑衰老相关疾病如老年期痴呆 ,主要表现为脑萎缩、认知障碍和学习记忆能力缺陷 ,已成为人类死亡的主要因素。“调神益智 ,平肝通络”针法是在长期的临床实践中针对脑衰老本虚标实的病机特点而设 ,主要用于脑衰老和相关老年期痴呆的治疗。临床研究表明 ,显效率为45 % ,有效率为87% ,并可有效地改善患者的血脂粘度 ,减少自由基的生成 ,减少大脑皮层凋亡细胞数 ,提高患者的学习记忆能力。在此基础上 ,采用了mRNA差示法分析了快速老化鼠SAMP10脑衰老相关基因的表达及针刺的干预作用。研究表明 ,伴衰老多种基因…     

滇龙胆GrGPPS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆单萜化合物合成的关键酶牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GrGPPS,进行序列特征分析和原核表达。方法 根据三年生滇龙胆转录组GrGPPS基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增得到GrGPPS cDNA序列,并进行TA克隆、测序及序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrGPPS,转入Escherichia coli Rosetta（DE3）中,在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下进行表达。结果 GrGPPS cDNA全长1 107 bp,编码369个氨基酸;序列分析表明,GrGPPS基因是异戊烯基合成酶家族的成员;氨基酸序列系统发育分析表明,GrGPPS与金鱼草AmGPPS亲缘关系最近;构建pGEX-4T-1-GrGPPS重组质粒,获得稳定的pGEX-4T-1-GrGPPS原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论 克隆了GrGPPS基因,建立pGEX-4T-1-GrGPPS稳定的原核表达体系,为进一步纯化和鉴定GPPS蛋白并研究其结构和功能奠定基础。     

刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息学及表达分析

目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达最具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.     

刺五加液泡膜内在蛋白基因的克隆与表达分析

目的克隆刺五加的液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIP)基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆刺五加TIP基因cDNA的全长序列。以GAPDH为内参照基因,通过RT-PCR法检测TIP基因在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果刺五加TIP基因cDNA的全长1 080 bp,开放阅读框长756 bp,编码251个氨基酸的蛋白,该蛋白包含TIP家族的标志性序列。刺五加的TIP蛋白具有6个跨膜螺旋,定位于液泡膜。表达分析结果显示,刺五加TIP基因在不同生长发育时期和不同器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。其中盛花期的表达量最高,是最低量果实快速生长期的2.07倍;各器官中,叶片的表达量最高,是最低量根的1.73倍。结论首次分离到刺五加TIP基因的cDNA全长序列,并证实其在盛花期的叶中表达量最高,为进一步研究TIP基因对刺五加水分代谢的影响奠定基础。     

刺五加β-香树酯醇合成酶基因的克隆及其表达与皂苷量的相关性

目的克隆刺五加的β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因,并分析其表达对皂苷量的影响。方法利用同源克隆法克隆刺五加的bAS基因。利用Real time PCR技术,分析刺五加bAS基因的表达规律,分光光度法测定总皂苷量。结果克隆到cDNA长度分别为1223、1226 bp的刺五加bAS1、bAS2基因。bAS1和bAS2基因在各时期和器官中均有表达,但表达量差异显著(P0.05)。bAS1基因在萌芽期的表达量最高,之后迅速降低,并基本维持恒定。在整个生长期中bAS2表现出低→高→低的表达特点。bAS1基因在各器官中的表达量基本恒定,bAS2基因在叶片中的表达量最高。茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,bAS1基因的表达未发生显著变化,bAS2的表达量显著上升。刺五加的皂苷量与bAS2呈极显著的正相关关系(P0.01),bAS1基因未达显著水平。结论 bAS2可能是催化刺五加三萜皂苷生物合成的关键酶。     

刺五加GPS基因克隆及表达特征与皂苷含量相关性研究

目的克隆刺五加香叶基焦磷酸合成酶(geranyl pyrophosphate synthase,GPS)基因的cDNA序列并分析基因序列特征、不同器官中基因表达水平及其与皂苷含量的相关性。方法提取刺五加的RNA,逆转录为cDNA。根据转录组测序结果中编码GPS的unigene(c37362.graph_c0),设计特异性引物,经过PCR扩增GPS基因的cDNA全长。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析GPS基因在不同器官中的表达水平,并通过分光光度法检测刺五加总皂苷含量。结果克隆得到长1260bp、编码419个氨基酸的刺五加GPS基因cDNA。GPS蛋白定位于线粒体内且不存在跨膜区域。GPS基因在各个器官中均有表达,在叶片中的表达量最高,是根中表达量的5.26倍。GPS基因的相对表达量与皂苷量呈现出同升同降的变化趋势,表现为显著正相关关系(r=0.851,P0.05)。结论首次克隆获得刺五加GPS基因的cDNA全长序列,明确了刺五加GPS基因的表达量与皂苷含量之间存在正相关关系。     

黑龙江省刺五加根及根茎的组织特征研究

目的研究黑龙江省刺五加根及根茎的组织特征。方法应用显微鉴定方法进行研究。结果详细地描述了黑龙江省刺五加根及根茎的组织特征。结论该结果为黑龙江省刺五加的真伪鉴别,进一步开发利用提供了参考依据。     

刺五加转录组和差异性表达分析

目的获得刺五加Eleutherococcus senticosus转录组数据库和差异表达基因。方法采用皂苷高含量组和低含量组2个样本作为受试材料,采用二代测序方法中的Illumina Hi Seq 4000进行转录组测序,并进行系统的生物信息学分析。结果共获得8.34 Gb数据,拼接得到77 087条Unigenes,与5个基因数据库进行比对,可归类于55个Geneontology(GO)分类中,涉及到116个KEGG标准代谢通路。通过差异性分析发现,差异性表达基因共530条,其中上调基因占42.08%,下调基因占57.92%,相差较大。进行GO和Pathway富集,得到408个GO注释和40个代谢通路。结论对刺五加转录组进行拼接、组装和功能注释,得到大量转录本信息,为刺五加分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据库资源。     

刺五加化学成分及自由基清除活性研究

目的研究长白山区植物刺五加的化学成分及其自由基清除活性。方法采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、半制备HPLC等色谱方法进行分离纯化,通过波谱技术鉴定其结构,并对化合物进行自由基清除活性测定。结果从刺五加中分离得到了11个化合物,分别鉴定为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(1)、邻苯二甲酸二异丁酯(2)、落叶松脂醇(3)、tripterygiol(4)、8,8′-bisdihydrosiringenin(5)、异嗪皮啶(6)、丁香脂素(7)、蛇菰宁(8)、3,3′-dimethoxy-4,8′-oxyneoligna-9,4′,7′,9′-tetraol(9)、1-(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-2-[4″-(3-hydroxypropyl)-2″,6″-dimethoxyphenoxy]propane-1,3-diol(10),芝麻脂素(11)。结论化合物1～5和8～11为首次从刺五加中得到,且发现化合物3、4、6和7具有较好的自由基清除活性,其对DPPH清除作用的IC50值分别为0.01、0.01、0.01和0.66μg/mL,可为发现抗氧化和抗衰老药物先导化合物提供参考。     

刺五加亚精胺合成酶基因的克隆及内生真菌对其表达的影响

目的 克隆刺五加亚精胺合成酶(spermidine synthase,SPDS)基因,并分析内生真菌对其表达的影响.方法 采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加SPDS基因全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析.RT-PCR法检测内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1对SPDS基因表达的影响.结果 刺五加SPDS基因的cDNA全长为1 541 bp,开放阅读框长1 002 bp,编码333个氨基酸的蛋白,包含SPDS家族的基本结构和标志性序列.RT-PCR结果显示,内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达量(P＜0.05),最大表达量出现在菌株P116-1b回接90 d时,是对照的2.06倍.结论 首次克隆了刺五加SPDS基因的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加SPDS基因的表达,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷量的机制及刺五加的抗逆性改良奠定了基础.     

刺五加组织培养与细胞工程进展

综述了国内外对刺五加组织培养与细胞工程研究的现状。分别从体细胞胚胎发生的影响因素外植体的发育程度和类型、培养基、植物生长调节剂的种类和浓度以及作用特点、体细胞胚胎的形态发生过程与解剖学和人工种子的包埋与萌发;茎尖外植体的离体培养与快速繁殖;根癌农杆菌和发根农杆菌对愈伤组织和新生体胚的遗化转化;毛状根培养生产刺五加次生代谢产物的研究现状进行了评述,并进一步分析了其中存在的问题,提出了一些建议。