三叶青愈伤组织培养及其总黄酮含量的研究

目的:通过三叶青愈伤组织诱导、增殖、分化及其总黄酮含量测定,探讨用三叶青愈伤组织生产三叶青黄酮的可行性。方法:以无菌苗叶片、野生三叶青叶片和茎段为外植体,诱导形成愈伤组织;经不同培养基培养后,选取两种典型的愈伤组织、叶片和块根为材料,以乙醇为溶剂,超声波提取总黄酮,用NaNO2-Al(NO3)3显色,在500nm处用分光光度计测总黄酮含量。结果:三叶青愈伤组织的最佳诱导培养基为2/3MS+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LNAA,最佳增殖培养基为MS+2.0mg/L6-BA+2.0mg/LNAA,最佳生根培养基为1/2MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA。三叶青总黄酮含量在块根中为31.135mg/g,在叶片中为12.830mg/g,在愈伤组织中高达18.047mg/g。结论:三叶青愈伤组织中总黄酮含量较高,用愈伤组织可大规模生产三叶青黄酮,满足医药市场的迫切需求。     

三叶青松散型和致密型愈伤组织悬浮培养及黄酮积累的比较研究

目的比较三叶青松散型和致密型愈伤组织悬浮培养细胞生长及其次生代谢产物黄酮的积累情况。方法将三叶青叶诱导的愈伤组织在不同外源植物激素种类和配比的培养基上多次继代培养,筛选获得松散型和致密型愈伤组织,分别建立相应悬浮细胞体系,研究了两种悬浮培养细胞生长和总黄酮积累的动态。结果三叶青松散型愈伤组织悬浮培养的继代周期为8 d,增加质量倍数最高达到3.68倍,黄酮积累的最大值11.7 mg/g,较最初接种时的浓度增加34.5%,该悬浮系继代4～5次后生命力衰退且褐化加重;而致密型愈伤组织悬浮培养的继代周期为20 d,增加质量倍数最高达到2.65倍,黄酮积累的最大值40.9 mg/g,较最初接种时的浓度增加212.2%,该悬浮系继代多次细胞无明显变化。结论与松散型愈伤组织悬浮培养相比,致密型愈伤组织悬浮培养更有利于继代培养和次生代谢产物的积累。     

三叶青愈伤组织诱导增殖体系建立及天然有机物促进总黄酮合成的研究

目的建立三叶青愈伤组织诱导增殖体系,探讨不同天然有机物对三叶青愈伤组织中总黄酮生物合成的影响,优化三叶青的培养体系,为植物细胞规模化生产三叶青总黄酮奠定基础。方法以诱导率、增殖率为指标,选择MS、6-BA、NAA浓度作为考察对象,采用正交试验方法确定三叶青愈伤组织最佳诱导增殖培养基;以总黄酮含量为指标,选择椰乳、土豆泥、香蕉泥浓度作为考察对象,研究天然有机物配比的浓度。结果最佳三叶青愈伤组织诱导培养基为2/3MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA,其诱导率为70%,增殖率为85%,愈伤组织膨大,呈青绿色颗粒状,无褐化现象;发现天然有机物椰乳、土豆泥和香蕉泥均能提高三叶青愈伤组织中总黄酮的生物合成,确定最佳天然有机物配比组合为10%椰乳+150 g/L土豆泥+80g/L香蕉泥,其诱导三叶青愈伤组织总黄酮平均含量为59.256mg/g,较不添加天然有机物愈伤组织的总黄酮含量提高了49.88%。结论明确三叶青愈伤组织的诱导培养体系,发现不同天然有机物的配比能有效提高三叶青愈伤组织中总黄酮含量,大幅缩短三叶青总黄酮的生产周期,为规模化生产三叶青总黄酮提供参考依据。     

影响黄芪愈伤组织生长和黄芪黄酮合成的因素

目的 研究培养基成分和光照对黄芪愈伤组织生长和黄酮类化合物形成的影响.方法 使用不同培养基并改变其中碳源、氮源、磷酸盐、钙盐的浓度,在黑暗和光照条件下进行黄芪愈伤组织培养,分光光度法检测愈伤组织中黄酮类化合物的含量.结果 黄芪黄酮积累的最佳条件是(24±1)℃暗培养,培养基为MS基本培养基(附加0.5mg·L-12,4-D和1.0mg·L-16-BA),其中含有80g·L-1蔗糖,NH NO3-为12(氮源总浓度为60mmol·L-1),1.5mmol·L-1KH2PO4,1.496 mmol·L-1CaCl2.结论 蔗糖作为碳源最有利于黄芪愈伤组织生长和黄芪黄酮的生物合成.混合氮源有利于黄芪黄酮类化合物的合成.     

黄芩愈伤组织培养及黄芩苷合成调控的研究

目的研究黄芩愈伤组织培养和黄芩苷合成调控的规律。方法采用植物细胞培养技术诱导愈伤组织;HPLC法测定黄芩苷的量。结果黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的优势培养条件为在基本培养基MS中氮源浓度为60mmol/L(NH4 ∶NO3-为1∶1),KH2PO4浓度0.5~1.5mmol/L,附加80g/L蔗糖,0.3mg/LIAA,2mg/L6-BA和200mg/L蛋白胨,温度(25±1)℃,暗培养。培养40d后收获愈伤组织,生物量达28.7g/L,黄芩苷为167.4mg/g,明显高于野生黄芩的最高量。结论黄芩愈伤组织的生长和黄芩苷的积累并不同步,而是先生长后合成。蔗糖对黄芩苷的合成具有明显的调节作用,在蔗糖质量浓度小于3%时,能有效促进愈伤组织的生长,但对黄芩苷的合成没有刺激作用;当蔗糖质量浓度在3%~8%时,愈伤组织表现出明显的生长和次生代谢功能,黄芩愈伤组织的生长及黄芩苷合成明显增加;当蔗糖质量浓度在8%时,两者均达到最大值。     

罗布麻产黄酮悬浮细胞培养体系的建立

目的探讨建立产黄酮的罗布麻悬浮细胞培养体系。方法采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定样品中总黄酮含量。结果将新疆罗布麻无菌种子苗茎段和叶片分别接种于附加0.5mg/L 2,4-D+0.05mg/L 6-BA的MS、B5、IS、WPM培养基上,其愈伤组织诱导率均为100%,且来源于WPM培养基上叶片诱导的愈伤组织状态最佳,质地疏松、生长较快。利用叶片在WPM上诱导的愈伤组织制备悬浮种子液,并优化其接种量,发现生物量积累最大的接种量为30g/L。在此基础上,分析了一个生长周期内悬浮细胞的生长和黄酮累积量情况,发现悬浮细胞生长曲线和黄酮累积量类似"S"型,黄酮含量在培养的第21天达最大值,为30.69 mg/g(DW),该含量显著低于大田收获期罗布麻叶片中的黄酮含量,却高于茎和根中的含量。结论获得了生长状态好、质地疏松适合悬浮培养的愈伤组织,并初步建立其悬浮培养体系,该研究为利用罗布麻悬浮细胞培养技术规模化商业生产黄酮等有用物质奠定基础。     

不同理化因素对天山雪莲组培苗生长及总黄酮量的影响

目的研究不同理化因素对天山雪莲组培苗生长和总黄酮生物合成的影响。方法测定不同理化因素影响下天山雪莲组培苗干质量和总黄酮量。结果利于天山雪莲生长及黄酮积累的培养条件:MS培养基附加6-BA 0.5 mg/L,NAA 0.05mg/L,氮源浓度40 mmol/L,NH4+-NO3比例为15︰25,碳源蔗糖质量浓度40 g/L,pH值5.0～6.0,光照强度2 500 lx,温度25℃。结论各项最佳培养条件的组合总体上可以促进天山雪莲生长和总黄酮生物合成,氮源、碳源和温度对天山雪莲生长及总黄酮量的影响最为明显。     

培养条件对罗布麻愈伤组织中金丝桃苷和异槲皮苷积累的影响

目的 探究促进罗布麻愈伤组织积累金丝桃苷、异槲皮苷的培养条件.方法 以罗布麻无菌苗子叶为材料,在诱导培养基上诱导愈伤组织并继代,探索不同激素配比、培养基碳源、氮源和盐浓度对罗布麻愈伤组织生长率和金丝桃苷、异槲皮苷积累的影响.结果 (1)孵育在MS+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA培养基上的愈伤组织中,金丝桃苷、异槲皮苷含有量最高,分别为6.12 mg/g、7.23 mg/g;(2)培养基碳源为2.0 mg/L蔗糖+2.0 mg/L葡萄糖时,有利于愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷的积累,两种成分分别为7.45 mg/g、8.69 mg/g,是植物叶片的1.24倍和1.22倍;(3)当培养基氮源为2 475 mg/L NH4NO3,0 mg/L KNO3时,金丝桃苷、异槲皮苷含有量均最高,分别为8.67 mg/g、9.86 mg/g,是植物叶片的1.44倍和1.38倍;(4)培养基中添加150 mmol/L NaCl时,愈伤组织中金丝桃苷、异槲皮苷含有量最高,分别为10.07 mg/g、11.15 mg/g,是植物叶片的1.67倍和1.56倍.结论 通过改变培养条件,可以促进罗布麻愈伤组织中金丝桃苷和异槲皮苷的积累,为进一步以罗布麻愈伤组织为材,工业化生产金丝桃苷和异槲皮苷这两种重要的药效成分奠定基础.     

氮源和碳源对冬凌草愈伤组织生长及迷迭香酸的积累的影响

目的 研究碳源、氮源对冬凌草愈伤组织生长及其内迷迭香酸积累的影响.方法 改变培养基中蔗糖浓度和碳源种类,考察不同碳源及其浓度对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响.在总氮源不变的情况下改变NO3-/NH4+的比例,考察不同NO3-/NH4+比例对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响.结果 蔗糖是冬凌草愈伤组织培养中的最佳的碳源,其浓度为3%时,有利于冬凌草愈伤组织的生长和迷迭香酸的积累;NO3-/NH4+比例为1∶1时,愈伤增值倍数最高;NO3-/NH4+比例2∶1时,迷迭香酸的积累量最大.结论 实验确定了冬凌草愈伤组织培养的最佳碳源种类、浓度及氮源比例,表明不同碳源、氮源对冬凌草愈伤组织生长和次生代谢物合成有显著影响.     

杜仲愈伤组织与悬浮细胞中黄酮和绿原酸积累研究

目的:比较杜仲愈伤组织和悬浮细胞生长及其次生代谢产物黄酮和绿原酸的积累.方法:将杜仲无菌苗真叶诱导的愈伤组织进行悬浮培养,研究了悬浮培养物生长的动态和总黄酮类及绿原酸产量积累的动态.结果:杜仲愈伤组织中黄酮和绿原酸最高分别达到13.46,1.712 mg·g~(-1),而悬浮细胞中黄酮和绿原酸最高分别达到16.63,3.93 mg·g~(-1).结论:与愈伤组织相比,悬浮细胞具有生长周期短、速率快、黄酮和绿原酸积累量高的优势.     

不同激素对银杏愈伤组织黄酮积累的影响

目的研究不同激素对银杏愈伤组织的影响,探讨黄酮积累的最佳培养基。方法以银杏种子胚为材料,正交试验法确定2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤这4种激素对银杏愈伤组织诱导及黄酮积累量的影响。结果萘乙酸、6-苄基腺嘌呤与呋喃氨基嘌呤对银杏种子胚愈伤诱导率与黄酮积累影响显著。最佳愈伤组织诱导激素组合为1.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.1 mg/L 6-苄基腺嘌呤与0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤;最佳黄酮积累激素组合为3.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1.0 mg/L萘乙酸、0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤与0.5 mg/L呋喃氨基嘌呤。结论该条件下银杏愈伤诱导率和黄酮产量较理想,可用于银杏愈伤积累黄酮的培养。     

不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响

目的 研究不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累规律的影响.方法 改变培养基中碳源、氮源、磷酸盐、钙盐的浓度,比色法测定愈伤组织中皂苷的含量.结果 金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累的最适培养基成分为蔗糖40 g·L-1,KNO3∶NH4NO3为(1.9:1.65)g·L-1,1 mmol·L-1KH2PO4,4.5 mmol·L-1CaCl2.结论 蔗糖作为碳源最有利于金铁锁愈伤组织生物量的积累和金铁锁皂苷的生物合成.混合氮源有利于金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量的积累.     

冬凌草细胞悬浮培养技术研究

目的:建立冬凌草细胞悬浮培养体系。方法:采用冬凌草愈伤组织为原材料,以MS培养基为基础培养基,分别对激素种类及浓度、愈伤组织接种量、继代培养起始密度以及最佳继代时间进行考察,绘制悬浮细胞生长曲线。结果:冬凌草细胞悬浮培养最佳培养基配方为MS、0.5mg·L~(-1)NAA、0.5 mg·L~(-1)2,4-D、0.5 mg·L~(-1)6-BA,愈伤组织接种量为60 g·L~(-1),继代培养起始密度为液体培养基量的四分之一,最佳继代时间为8天。结论:冬凌草细胞悬浮体系的建立,原材料愈伤组织至关重要,只有获得较为疏松长势良好的颗粒状愈伤组织才能用以建立细胞悬浮培养体系,因此在对愈伤组织的继代培养过程中,如何降低愈伤组织褐化率,促进愈伤组织生长有待于进一步探索。     

培养条件对大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物积累的影响

目的:研究了培养条件对大叶白麻愈伤组织生长和三萜类化合物积累的影响.方法:以大叶白麻无菌苗下胚轴段为材,在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA培养基上诱导愈伤组织并继代,探索愈伤组织继代次数、光周期、培养基碳源和添加物对大叶白麻愈伤组织生长和三萜类化合物积累的影响.结果:(1)愈伤组织继代3次增长倍数最大,三萜类化合物的产量达最大值,分别为7.3倍和0.54%;(2)4种光周期处理中,16 h/d光照下的愈伤组织增长量、三萜类化合物含量最高,分别达到为7.2倍和0.52%;(3)蔗糖比葡萄糖、果糖更有利于愈伤组织的生物量增长和三萜类化合物的积累,以附加5%蔗糖最佳,分别为8.3倍和0.72%;(4)在3种含添加物的培养基中,以添加2 mg/L水杨酸的培养基上愈伤组织增长量最大,三萜类化合物含量也最高,分别为7.2倍和0.68%.结论:通过改变培养条件和培养基成分,可提高大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物的产量.     

外源激素配比对药用植物锁阳愈伤组织诱导的影响

目的 筛选最佳激素组合,提高锁阳组织培养效率.方法 以锁阳肉质茎维管组织作为外植体,以MS为基本培养基,基于正交实验设计研究三种外源激素配比(NAA、2,4-D和6-BA)以及蔗糖和琼脂浓度对锁阳愈伤组织诱导的影响.结果 NAA、2,4-D和6-BA三种激素对锁阳愈伤组织诱导均有显著影响,不同激素之间对出愈率的作用效应大小为2,4-D ＞NAA＞6-BA,诱导锁阳愈伤组织最佳激素配比为MS+NAA (1.0mg/L)+2,4-D (1.5mg/L)+6-BA(2.0mg/L).培养基中琼脂浓度和蔗糖浓度对锁阳愈伤组织诱导率有一定影响,蔗糖浓度以30g/L,琼脂浓度以4.5g/L时愈伤组织诱导率最高.结论 锁阳愈伤组织诱导最适培养基为MS+NAA (1.0mg/L)+2,4-D (1.5mg/L)+6-BA (2.0mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(4.5 g/L).     

蒺藜愈伤组织培养体系的建立及其总黄酮醇苷的测定

目的建立蒺藜Tribulus terrestris愈伤组织培养体系,并考察种子、全草及愈伤组织中总黄酮醇苷量。方法采用正交试验研究不同外植体、培养基、光照条件、激素种类及其配比等对蒺藜愈伤组织诱导和增殖的影响,确定蒺藜愈伤组织培养体系,采用HPLC测定其种子、全草及愈伤组织中总黄酮醇苷量。结果以蒺藜茎段为外植体,诱导愈伤组织的适宜培养基为MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L,25℃全天恒温暗培养;最佳增殖培养基为MS+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 0.2mg/L+ZT 1.0 mg/L,12 h/d光培养,p H 6.2,继代周期为35 d。种子、全草及愈伤组织中总黄酮醇苷量分别为1.46%、2.01%、5.22%。结论愈伤组织质地疏松,适合建立稳定高效的组织培养体系,其有效成分总黄酮醇苷量高于种子和全草。     

提高芍药愈伤组织中芍药苷和芍药内酯苷的含有量

目的进一步优化芍药愈伤组织中积累芍药双苷(芍药苷和芍药内酯苷)的培养条件。方法以芍药愈伤组织中芍药双苷的量为响应值,采用Plackett-Burman实验设计对8个影响愈伤组织生长和芍药双苷积累的植物激素(NAA、2,4-D、6-BA、TDZ)的质量浓度、蔗糖的含有量、Ca2+量、NH4+∶NO3-的比例及光照中筛选出了3个关键因素,通过最陡爬坡逼近和响应面优化方法确定这些因素的最适水平。结果三个因素的最佳条件为:40.20 g/L蔗糖、0.33 mg/L 6-BA和1.08 mg/L NAA。结论在此最优培养条件下,芍药愈伤组织合成芍药双苷的能力比优化前提高了33%,芍药双苷占愈伤组织干重含有量达到37.60 mg/g。     

长春花愈伤组织诱导及培养条件优化

目的：通过愈伤组织的诱导、增殖与培养条件的优化建立长春花愈伤组织培养体系。方法：以长春花的幼嫩叶片为外植体,在不同激素组合的脱分化、分化培养基上培养。考察抗氧化剂Vc对愈伤组织褐化的影响。结果：最佳诱导培养基为MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L 2,4-D;最佳继代培养基为MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/LNAA＋0.5 mg/L 2,4-D,并在该条件下进一步悬浮继代培养。10 mg/L Vc可有效抑制长春花愈伤组织的褐化。结论：激素KT对该愈伤组织的诱导效应不明显,NAA、2,4-D和6-BA均有一定的诱导效应;Vc具有抑制长春花愈伤组织褐化的作用。     

国槐种胚愈伤组织培养与异黄酮量的分析

目的 构建国槐Sophora japonica种胚愈伤组织培养体系,并对愈伤组织中的异黄酮量进行初步分析.方法 通过添加不同浓度不同种类的植物生长调节剂,得到国槐种胚愈伤组织诱导、悬浮细胞培养、异黄酮量最高的最佳培养基;通过对愈伤组织和悬浮细胞在生长中的生长量和异黄酮量进行测定,得到悬浮细胞最佳收获期.结果 国槐种胚愈伤组织诱导的最佳培养基为B5+2,4-D(1.0 mg/L) +6-BA(0.2 mg/L)+蔗糖(20 mg/L).固体培养基上,愈伤组织培养7d之后组织进入迅速生长期,第35天,愈伤组织的生长量达到最高(鲜质量7.413 7 g),但其异黄酮量均无显著变化.悬浮培养中,愈伤组织培养24 d达到最高生长量(鲜质量11.563 8g),24 d后进入衰亡期,继续培养细胞其鲜质量、干质量均呈现下降趋势,且细胞逐渐变褐,最终死亡,其中异黄酮量的变化趋势与生长曲线相反,在24 d达到最低(4.826 mg/g).结论 国槐种胚愈伤组织诱导、培养和异黄酮量与植物生长调节剂种类及浓度均具较大关联.     

水杨酸和茉莉酸甲酯对远志愈伤组织生长和相关酶活性及化学成分的影响

目的研究水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)对远志愈伤组织生长和相关酶活性及化学成分的影响。方法以远志继代愈伤组织为材料,加入SA(0、4、8、12、16、20、24、28、32mg/L)和MeJA(0、100、200、400、600、800、1 000μmol/L)不同浓度下暗培养30 d后,测定远志愈伤组织生长量、丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶活性、总酚、总黄酮含量及远志酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量。结果 MeJA对远志愈伤组织的生长具有抑制作用,12 mg/L水杨酸(SA)对远志愈伤组织的生长具有促进作用。SA和MeJA对远志愈伤组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量均具有促进作用,且随着SA和MeJA浓度的增大,SOD、CAT、POD活性先上升后下降,MDA含量持续上升。SA质量浓度为20 mg/L时,CAT、SOD活性达到最大值,分别为248.45、4 451.06U/mg,SA质量浓度为16 mg/L时,POD活性达到最大值,为7.22 U/mg;SA质量浓度为32 mg/L时,MDA含量达到最大值,为25.09 nmol/mg;MeJA浓度为600μmol/L时,CAT、SOD、POD活性达到最大值,分别为273.30、1 451.06、15.27 U/mg;MeJA浓度为1 000μmol/L时,MDA含量达到最大值,为27.10 nmol/mg。SA对远志愈伤组织中总黄酮的积累具有抑制作用,对总酚无显著影响;MeJA对远志愈伤组织中总酚、总黄酮的积累具有促进作用,MeJA浓度为600μmol/L时,总黄酮含量最高;MeJA浓度为400μmol/L时,总酚含量最高。SA和MeJA均对远志愈伤组织中远志酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖的积累具有促进作用,SA浓度为32 mg/L时,远志酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量最高;MeJA浓度为1 000μmol/L时远志酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖含量最高。结论 MeJA对远志愈伤组织生长具有抑制作用,12 mg/L的SA对其具有促进作用。SA和MeJA对SOD、POD、CAT活性,MDA含量及远志酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖的积累均具有促进作用。SA对远志愈伤组织中总黄酮的积累具有抑制作用,对总酚无显著影响,MeJA对远志愈伤组织中总酚、总黄酮的积累具有促进作用。