人血小板衍生生长因子B在大肠杆菌中的表达及对骨组织修复的影响

目的:为研究人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)在大肠杆菌中的表达及其在治疗骨折愈合、骨质疏松等疾病中的作用,克隆了PDGF-B的成熟肽基因并进行了序列分析。方法:从脐静脉内皮细胞提取总RNA,经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出包含全长编码人PDGF-B基因cDNA,再以此为模板,用特异引物进行PCR扩增出PDGF-B成熟肽基因;将目的基因连接到载体pGEM-T上,进行序列测定。之后将此片段克隆到表达载体pQE30,构建成表达质粒pQE30-PDGFB。结果:重组质粒经酶切及PCR鉴定,证实PDGF-B成熟肽基因克隆成功,序列正确。结论:PDGFB基因的成功克隆和原核表达载体的构建,为促进骨修复功能研究及基因工程生产奠定了基础。     

骨形成发生蛋白-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的：克隆人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因。方法：根据Genebank人骨形态发生蛋白-7基因序列合成两条引物，从培养的人胎儿软骨细胞中提取mRNA，利用bnestep RT—PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白-7成熟肽的基因序列，将PCR扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5a进行克隆筛选鉴定及测序。结果：琼脂糖凝胶电泳检测RT—PCR产物显示-长约456bp的条带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约456bp的片段，DNA测序结果与Genebank中的序列相符。结论：利用RT—PCR技术可成功的从人胎儿软骨细胞中克隆出人BMP-7成熟肽基因。     

转化生长因子β1基因克隆及重组真核表达质粒的构建

背景：通过基因转移方法研究某一外源性基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段，与病毒载体相比，应用DcDNA4．0-TGF-β1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性，有更高的安全性。目的：通过克隆转化生长因子β1基因，观察构建重组转化生长因子β1基因真核表达质粒的可行性。设计、时间及地点：以细胞为观察对象的体外实验，于200703／2008—02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。材料：2月龄清洁级健康SD大鼠，雌雄不拘，用于分离细胞中RNA。方法：从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子B1的mRNA，反转录聚合酶链反应扩增后，克隆入pGEM—T载体，PCR鉴定重组子；酶切下目的基因转化生长因子B1，再亚克隆入载体pcDNA4．0质粒，酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。主要观察指标：TGF-β1 cDNA、pGEM—T—TGF-β1和重组子pcDNA4．0-TGF—β1的表达。结果：经过反转录一聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带；PCR扩增鉴定得到pGEM—T—TGF-β1。酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4．0-TGF-β1，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。结论：成功克隆大鼠转化生长因子β1基因，并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体。     

副溶血弧菌TDH基因的克隆与表达

目的对副溶血弧菌TDH基因进行克隆、鉴定与表达，为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究TDH的功能奠定基础。方法用聚合酶链反应(PCR)扩增TDH基因将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上，经测序反应确定无误后，再将PCR产物与原核表达载体pQE100构建表达TDH的重组质粒，将重组质粒先转化人大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经双酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行SDS-PAGE电泳。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，其表达的蛋白质相对分子质量为24000。结论TDH基因成功克隆到表达质粒内并表达，为制备单抗、诊断试剂与其致病机制研究奠定了基础。     

构建Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体

目的：构建赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因去信号肽片段的原核表达载体，并对其进行克隆表达。方法：实验于2004—12／2005—12在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成。以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板，PCR扩增Loa22基因去信号肽片段，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切、PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒克隆。经DNA测序正确后，转化大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达，通过SDS—PAGE鉴定表达产物。结果：PCR获得长516bp的片段。Loa22基因去信号肽片段与pGEX-4T-1的重组质粒构建成功。重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达Mr45000的融合蛋白。结论：制备了Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体，为钩体新型疫苗的研究奠定基础。     

乳腺癌相关分子人乳腺珠蛋白基因的克隆及原核表达

[目的]克隆乳腺癌相关分子人乳腺珠蛋白（hmnan mammaglobin，hMAM）基因并诱导其表达，为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础，从而为早期发现乳腺癌提供科学的监测方法。[方法]从乳腺癌组织提取总RNA，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增hMAM基因编码序列．将扩增产物克隆至PGEM-T载体中，DNA测序。用限制性内切酶切下目的基因，与相同酶切的表达载体pQFA0连接、筛选、鉴定，构建pOE40-hMAM融合表达质粒，以硫代半乳糖苷（IPTG）诱导在大肠杆菌M15中表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析表达结果.[结果]琼脂糖凝胶电泳显示聚合酶链反应（PCR）扩增产物的分子量大小与预期相符。对重组质粒分析表明，插入片段的序列与文献报道hMAM基因编码序列一致。在IPTFG的诱导下，M15重组菌高效表达出一个相对分子质量约为34kD的产物。[结论]重组表达质粒pQE40hMAM表达成功。     

人胰激肽释放酶基因的克隆及表达载体的构建

目的 :克隆中国人胰组织激肽释放酶基因 ,构建原核、真核表达载体 ,为开发生产人源激肽释放酶基因工程产品及人源激肽释放酶基因药物奠定基础。方法 :提取人胰腺组织总RNA ,逆转录后琼脂糖电泳初步鉴定PCR产物。将激肽释放酶cDNA回收、补平后插入克隆质粒KS ,酶切鉴定后 ,对激肽释放酶基因进行序列测定分析。用双酶切法 ,插入原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。酶切鉴定后 ,进行序列测定分析。结果 :本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比 ,碱基序列相同。测序分析表明人胰组织激肽释放酶基因经酶切 ,正确插入到原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。结论 :克隆并构建成功中国人组织激肽释放酶基因的原核、真核表达载体 ,可用于基因工程产品及基因药物的深入研究工作     

sox4不同结构域的真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建并鉴定sox4四段不同结构域的重组真核表达质粒。方法：以HL-60细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增出sox4基因cDNA,将产物克隆进真核载体pCMV—Flag质粒内,构建含sox4不同结构域的重组真核表达质粒。将pCMV—Flag—sox4重组质粒转染293T细胞,Westernblot检测sox4蛋白表达。结果：核酸序列分析sox4已成功插入pCMV—Flag载体中,转染pCMV—Flag-sox4的293T细胞中检测到表达的sox4蛋白。结论：成功构建了含sox4基因的重组真核表达质粒。     

降钙素基因相关肽表达载体的构建

背景:为研究降钙素基因相关肽基因治疗在骨质疏松中的应用,首先要建立高效的降钙素基因相关肽基因载体。目的:构建降钙素基因相关肽真核表达载体pBaBb-puro-CGRP。方法:设计引物并通过PCR扩增出降钙素基因相关肽,酶切后用T4DNA连接酶将其与pBaBb-puro进行连接,经过转化、阳性克隆筛选后,进行酶切和测序鉴定。结果与结论:经PCR扩增获得了含430bp的降钙素基因相关肽基因编码序列,经过酶切、连接、转化后,挑选10个菌落进行PCR检测,筛查到8个菌落含有重组质粒,进一步行酶切和测序鉴定,结果与理论预期完全相符。提示实验成功构建了pBaBb-puro-CGRP真核表达载体。     

副溶血弧菌TDH基因的克隆与表达

目的　对副溶血弧菌TDH基因进行克隆、鉴定与表达 ,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究TDH的功能奠定基础。方法　用聚合酶链反应 (PCR)扩增TDH基因将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体 pQE10 0构建表达TDH的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经双酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS PAGE电泳。结果　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 2 4 0 0 0。结论　TDH基因成功克隆到表达质粒内并表达 ,为制备单抗、诊断试剂与其致病机制研究奠定了基础。     

单链可变区片段与趋化因子融合的独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒的构建及表达

本研究目的在于克隆小鼠B细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv-MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB／c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的Ig VH和Ig VL基因，重组PCR法用一段编码（Gly4Ser），连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方法，选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列，连接scFv与MCP-3基因，获得scFv-MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGLo中，并在大肠杆菌中表达融合蛋白。测序结果表明：分别成功克隆A20细胞的Ig VH和Ig VL基因，并成功制备了scFv片段和scFv-MCP-3融合基因片段；限制性酶切方法证实，重组pGLo／scFv-MCP-3原核表达质粒中融合基因准确插入。SDS-PAGE电泳分析显示，融合蛋白分子量约65kD，与预期蛋白分子量一致，并且目的蛋白占菌体蛋白的30％。结论：本研究成功构建鼠源scFv片段与趋化因子MCP-3融合的独特型B细胞淋巴瘤疫苗表达质粒pGLo／scFv-MCP-3，并实现融合蛋白的初步表达。     

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景：survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。目的：构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。方法：以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coliTOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。结果与结论：将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24h比48h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。     

大鼠降钙素基因相关肽重组腺病毒的构建与鉴定

目的利用AdMaxTM腺病毒载体系统,构建大鼠降钙素基因相关肽（CGRP）基因重组腺病毒载体,包装重组腺病毒并鉴定。方法根据Genbank提供的大鼠CGRP序列信息（NM₀01033956.1）,合成序列全长,PCR方法扩增目的基因,将CGRP/His基因片段亚克隆至穿梭质粒pDC316,形成重组质粒pDC316-CGRP/His,挑选测序正确的质粒与骨架质粒pBHGloxdelE13cre共转染293A细胞,包装出重组腺病毒Ad-CGRP/His,利用PCR和Western鉴定基因的表达。结果 （1）成功构建pDC316-rCGRP/His重组质粒。（2）包装出表达rCGRP/His的重组腺病毒。结论成功构建携带大鼠CGRP基因的重组腺病毒载体,并获得表达rCGRP/His的重组腺病毒,为深入研究CGRP基因并开展相关的基因治疗研究奠定基础。     

幽门螺杆菌尿素酶基因的克隆及表达

目的构建幽门螺杆菌尿素酶基因B亚单位（ureB）的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法以幽门螺杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增尿素酶基因B亚单位,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接克隆载体并测序,构建重组原核表达载体。结果成功扩增出1710bp的目的基因,测序结果证实与预期一致,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达。结论在大肠杆菌中成功表达幽门螺杆菌尿素酶基因B亚单位蛋白,为幽门螺杆菌疫苗的研发奠定了基础。     

靶向克隆法构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体

目的 利用PCR 产物靶向克隆法构建细胞穿透肽-凋亡素(PEP-1-VP3)的原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3 质粒为模板,PCR 扩增VP3 基因的366 bp 片段,应用靶向克隆酶,将VP3 基因插入到线性pET15b-PEP-1,得到重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Nde Ⅰ和BamHⅠ双酶切图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳可见366 bp 特征性的VP3 片段,重组的质粒经过双酶切获得了一个大小为440 bp 的特征性PEP-1-VP3 片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA 编码区成功地克隆入了pET15b-PEP-1,且其序列与GeneBank 中VP3 cDNA 序列完全一致.结论 靶向克隆法可快速、高效地构建PEP-1-VP3 基因的原核表达载体,为制备PEP-1-VP3 融合蛋白奠定基础.     

铜绿假单胞菌mexA基因的克隆及其序列分析

目的克隆铜绿假单胞菌临床菌株mexA基因并进行序列分析。方法从临床分离多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA基因与PUC18克隆载体连接,对重组质粒进行测序验证。结果成功地克隆了mexA基因,重组质粒(PUC/mexA)经测序与Genebank检索的mexA基因序列进行对比证实为99.9%同源。结论所构建的铜绿假单胞菌临床菌株mexA基因克隆适于进一步的克隆表达。     

真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B的构建及在293T细胞中的表达

[摘要] 目的: 构建人基因PDGF-B真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B,并在293T细胞中进行瞬间表达。方法: 采用PCR方法从购自美国典型培养物保藏中心含有PDGF-B基因全长cDAN序列的质粒中扩增出PDGF-B的cDAN片段，并与真核表达载体pIRES-EGFP连接，双酶切鉴定，最后采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将pIRES-EGFP-PDGF-B转入293T细胞中，利用荧光显微镜和Western blotting进行表达鉴定。结果: 成功克隆了PDGF-B基因全长cDAN，真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B被成功构建，双酶切鉴定正确，表达载体能在293T细胞内正确地表达成熟的PDGF-B蛋白，并可分泌到细胞外。结论: 成功构建了pIRES-EGFP-PDGF-B真核表达载体，为进一步利用PDGF-B对脊髓损伤进行基因治疗奠定基础。     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白ESAT6基因，并构建重组表达质粒。方法 根据Genbank中ESAT6基因序列，针对其编码区合成引物，采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因，并连接到T载体，然后定向克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 经双内切酶消化所切下的片段，大小与预计相符；测序结果证实基因序列正确，符合表达框架。结论 成功构建了重组原核表达质粒pGEX-ESAT6。     

慢性髓性白血病bcr／abl融合基因的克隆与表达

目的：克隆bcr／abl融合基因融合位点基因片段。方法：以慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞株总RNA作为模板,采用RT—PCR方法扩增包含Bcr／abl（b3a2）融合位点基因片段。将RT—PCR物按正确的阅读框架,定向克隆到pEGFP—N3的下游,将重组质粒转化大肠杆JM109大肠杆菌,用PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定,并进行序列的测定。结果：扩增出470bp的Bcr／abl融合位点基因片段,构建重组质粒pEGFP—bcr／abl,酶切产物的大小分别与预期相符。结论：成功地扩增bcr／abl融合位点基因片段及构建真核表达重组质粒pEGFP—bcr／abl,为在体外表达重组bcr／abl蛋白奠定基础。     

EB病毒BMRF1基因原核表达载体的构建

目的克隆EB病毒早期蛋白P54的编码基因BMRF1，构建原核表达载体，为相应蛋白的表达和应用奠定基础。方法以含EB病毒的B95-8细胞培养上清为模板，PER扩增出BMRF1基因。PER产物经BamH I和Xho I双酶切后克隆至原核表达载体pGEX-5T，用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PER扩增的特异性片段长度为1233bp，以此构建的重组质粒pGEX-5T-BMRF1双酶切的片段大小与预期符合，重组克隆外源基因的测序结果与GenBank中的EB病毒BMRF1基因eDNA序列一致。结论成功构建了pGEX-5T-BMRF1原核表达载体。