siRNA干扰FLOT2基因表达对肾细胞癌细胞增殖的影响

目的:探讨FLOT2在肾细胞癌细胞株中的表达,并观察小干扰RNA沉默FLOT2基因对肾细胞癌786-O细胞增殖能力的影响。方法:将化学合成的FLOT2的小干扰siRNA用脂质体 Lipofectamine2000转染至肾细胞癌786-O细胞;分别用RT-PCR、Western blot方法检测细胞转染前后FLOT2以及细胞增殖相关因子CCND1的表达。CCK-8与克隆形成实验检测其增殖情况。结果:转染FLOT2-siRNA的肾细胞癌786-O细胞,RT-PCR、Western blot检测显示FLOT2在基因及蛋白水平明显下调（P<0.05）;与对照组比较786-O细胞增殖能力明显下降（P<0.05）,细胞增殖相关因子CCND1明显下调（P<0.05）。结论:FLOT2在肾细胞癌细胞系中高表达,采用特异性FLOT2-siRNA 能够显著降低FLOT2和CCND1表达。干扰FLOT2表达能显著抑制786-O细胞的增殖,FLOT2基因可能参与了肾细胞癌的生物学行为。     

干扰MAP2基因表达对胶质瘤细胞生物学特性的影响

目的:通过RNA干扰降低胶质瘤细胞中MAP2表达后观察其对胶质瘤细胞生物学特性的影响。方法:RT-qPCR和Western blot测定胶质瘤细胞Hs683、U251中MAP2的基因和蛋白表达。构建shRNA MAP2质粒,转染胶质瘤细胞,筛选出MAP2低表达的胶质瘤细胞,并经Western blot验证。对转染后胶质瘤细胞行MTT检测细胞活性、PI-FACS检测细胞周期、Annexin V-APC单染法行细胞周期检测、Transwell实验检测细胞的迁移能力,并使用Western blot测定转染后胶质瘤细胞中α-管蛋白和乙酰化α-管蛋白的含量。结果:转染shRNA MAP2后胶质瘤细胞中MAP2的蛋白表达显著降低。分子生物学实验显示转染shRNA MAP2后胶质瘤细胞的活性降低、凋亡增加、细胞迁移能力下降、细胞周期有所变化但无特异性,代表微管稳固性的乙酰化α-管蛋白含量基本不变。结论:RNA干扰降低胶质瘤细胞Hs683、U251中MAP2表达后,能降低细胞活性、增加凋亡、降低细胞迁移能力,但这些变化似与微管的稳固性无关。     

EZH2基因沉默对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡影响的研究

目的:研究RNA干扰技术抑制zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)的表达对人胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响.方法:构建靶向EZH2基因的shRNA质粒并转染至U251细胞中,采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测EZH2 mRNA和蛋白的表达情况,利用四甲基偶氮哇盐(MTT)实验和Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验观察转染后U251细胞增殖和凋亡情况.结果:靶向EZH2基因的shRNA质粒成功抑制了U251细胞EZH2基因的表达,mRNA和蛋白表达抑制率分别为56.00％和88.73％;转染shRNA EZH2后,U251细胞的生长受到明显抑制(P＜0.01),在转染96 h后,生长抑制率达35.79％;转染48 h后,U251细胞早、晚期凋亡率分别为(26.59±0.83)％和(38.63±0.80)％,较阴性质粒组和空白对照组均增加,以晚期明显,差异有统计学意义,P＜0.01.结论:EZH2基因的沉默能有效抑制胶质瘤U251细胞的增殖、促进其凋亡,提示EZH2可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点.     

siRNA沉默EphB2表达对胰腺癌CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,靶向沉默人胰腺癌CFPAC-1细胞中的EphB2基因的表达,观察EphB2对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响.方法:构建靶向EphB2基因的siRNA干扰质粒,通过LipofectamineTM2000将干扰质粒转染进293T细胞,筛选出能有效抑制EphB2蛋白表达的干扰序列.构建含有效序列的慢病毒载体pLentiGFP-EphB2,感染CFPAC-1细胞,筛选出稳定干扰EphB2蛋白表达的CFPAC-1细胞系.定量PCR、Western blotting检测CFPAC-1细胞中EphB2mRNA和蛋白的表达,CCK8法和流式细胞术检测EphB2下调对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响.结果:成功构建了EphB2慢病毒干扰载体pLentiGFP-EphB2,获得稳定转染pLentiGFP-EphB2的CFPAC-1细胞(CFPAC-1 EphB2 RNAi).CFPAC-1EphB2 RNAi细胞中EphB2 mRNA和蛋白表达较空载体组显著降低,EphB2 mRNA的沉默效率为63％.与空载体组和未转染组相比,pLentiGFP-EphB2感染显著促进CFPAC-1细胞的增殖(1.89±0.17 vs l.63 ±0.13、1.71 ±0.22,P＜0.05),抑制细胞的凋亡[(7.02±1.27)％vs(13.37±1.89)％、(15.71±2.35)％,P＜0.05].结论:pLentiGFP-EphB2可有效下调胰腺癌CFPAC-1细胞中EphB2的表达,促进CFPAC-1细胞增殖和抑制其凋亡.     

有效bcl-2 siRNA对HL-60细胞生长的抑制作用

 目的　应用RNA干扰（RNAi）技术观察有效bcl-2 siRNA对白血病细胞HL-60凋亡的影响。方法　将有效bcl-2 siRNA转染入HL-60细胞;用MTT法、流式细胞术（FCM）及Hoechst 33258荧光染色法观察细胞增生及凋亡情况。结果　有效bcl-2 siRNA有抑制HL-60细胞生长及促进细胞凋亡的作用。结论　有效bcl-2 siRNA能特异性促进HL-60细胞凋亡,抑制其生长。     

siRNA干扰TWSG1 基因表达对胃癌MGC-803 细胞增殖及凋亡的影响

[摘要] 目的：探讨扭转原肠胚形成同系物1 基因（twisted gastrulation protein homolog 1,TWSG1）对胃癌MGC-803 细胞增殖及凋亡的影响。方法：设计3 条TWSG1 基因相关的siRNA,将对数生长期MGC-803 细胞分为空白对照组、阴性对照组、siRNA1干扰组、siRNA2 干扰组和siRNA3 干扰组,待细胞汇合率达70%～80%时分别转染空载体、连接siRNA1、siRNA2 和siRNA3 的载体。采用qPCR 和Western blotting 检测各组细胞TWSG1 mRNA和TWSG1 蛋白的表达水平,筛选干扰效率最高的稳定细胞株。用CCK-8 法检测各组细胞的增殖情况,用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。结果：各转染组细胞中siRNA1 干扰效率最高。与空白对照组和阴性对照组相比,siRNA干扰组细胞TWSG1 表达下调（P<0.05）,其细胞增殖显著增加（P<0.05）,凋亡显著减少（P<0.05）。结论：siRNA干扰MGC-803 细胞中TWSG1基因的表达后,可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。     

TAT-ASPP2融合蛋白的制备及其对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的:制备TAT-ASPP2融合蛋白,探讨其对人胶质瘤U-87MG细胞和U251细胞增殖的抑制作用。方法:设计TAT-ASPP2引物,应用IN-Fusion技术构建原核表达质粒pET-TAT-ASPP2,双酶切、DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导TAT-ASPP2融合蛋白的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定TAT-ASPP2融合蛋白。MTT法检测TAT-AS-PP2融合蛋白对U-87MG和U251细胞增殖的作用。结果:成功构建了原核表达质粒pET-TAT-ASPP2,转化E.coli BL21后成功表达TAT-ASPP2融合蛋白,其相对分子质量约为128000,并可被ASPP2特异性抗体所识别。TAT-ASPP2融合蛋白对U-87MG和U251细胞增殖的抑制率分别为(65.0±3.0)%和(64.7±2.5)%,而ASPP2蛋白则不能抑制U-87MG和U251细胞的增殖。结论:成功地克隆、表达及纯化TAT-ASPP2融合蛋白,该融合蛋白可抑制胶质瘤细胞的增殖。     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

OPN基因RNAi对U87胶质瘤细胞生长和侵袭的抑制作用

目的:探讨靶向骨桥蛋白基因(osteopontin,OPN)的siRNA片段对U87胶质瘤细胞生长和侵袭力的影响及其可能的作用机制.方法:根据OPN基因序列设计并合成的siRNA片段(OPN-RNAi)转染U87细胞.MTT法检测U87细胞增殖;Western blotting检测OPN及基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)2、MMP9蛋白的表达;Transwell小室侵袭实验检测U87细胞的侵袭力;明胶酶谱法检测MMP2、MMP9的酶活性.结果:体外合成的OPN-RNAi能有效抑制U87细胞中OPN蛋白的表达(P＜0.05),OPN-RNAi同时还能下调MMP2、MMP9蛋白的表达(P＜0.05)及其酶活性(P＜0.01),并抑制U87细胞的增殖(P＜0.05)和侵袭力(P＜0.05).结论:OPN-RNAi能够有效抑制U87胶质瘤细胞的生长及其侵袭力,其机制与其抑制OPN下游基因MMP2、MMP9的表达和酶活性有关.     

慢病毒载体介导RNAi稳定抑制VASH1表达对人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡影响的体外研究

目的 探讨运用慢病毒载体介导的RNA干扰技术抑制血管生成抑制因子1（VASH1）的表达对人脑胶质瘤U-87MG细胞增殖和凋亡的影响。方法 应用pGCL-GFP质粒构建针对VASH1的慢病毒shRNA载体,转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度的慢病毒转染人脑胶质瘤U-87MG细胞;通过RT-PCR和Western blot评价其对U-87MG细胞内VASH1表达的影响;用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察U-87MG细胞增殖活性的改变;用流式细胞仪（FCM）检测U-87MG细胞凋亡的变化。结果 与转染阴性对照组和空白组相比,转染pGCL-GFP-VASH1慢病毒载体的U-87MG细胞VASH1的mRNA 蛋白表达水平明显降低（P<0.01）;细胞的增殖活性显著上调（P<0.01）,细胞凋亡明显减少（P<0.01）。结论 VASH1 shRNA慢病毒载体可抑制VASH1在人脑胶质瘤U-87MG细胞中的表达,并增加肿瘤细胞的增殖活性,抑制细胞凋亡。     

RSK4基因表达及其对U87细胞增殖的影响

背景与目的:RSK4是非生长因子依赖的丝/苏氨酸蛋白激酶,参与多种信号通路。本研究构建了人RSK4基因的真核表达系统,研究其对胶质瘤的调控作用,为阐明RSK4功能奠定基础。方法:采用RT-PCR法从人正常乳腺上皮细胞MCF-10A细胞中扩增获得RSK4基因的编码区,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/RSK4。脂质体法介导pcDNA3.1(-)/RSK4质粒转染至U87细胞中,RT-PCR和Western blot检测表达情况。采用MTT法检测RSK4基因对U87细胞生长的影响。结果:转染pcDNA3.1(-)/RSK4组U87细胞增殖明显被抑制(P<0.05)。结论:RSK4可以抑制胶质瘤细胞的增殖。     

敲低DCLK1抑制神经胶质瘤细胞增殖、 迁移与侵袭CSCD

目的探讨双肾上腺皮质激素样激酶 1(DCLK1)对胶质瘤细胞增殖、迁移与侵袭的影响及其机制。方法 RT-qPCR、免疫组织化学染色和Western blot检测胶质瘤组织和细胞(U87和A172)中DCLK1 mRNA和蛋白的表达情况;sh-DCLK1和阴性对照(sh-Con)转染U87和A172细胞;MTT和Transwell法分析敲低DCLK1对神经胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;蛋白印迹法检测敲低DCLK1对神经胶质瘤细胞中TGF-β/Smads信号通路相关蛋白TGF-β1、p-Smad2、p-Smad7表达的影响;将已转染sh-DCLK1或sh-Con的U87细胞注射到BALB/c裸鼠颈部皮下,定期测量瘤体体积,收集瘤体并称重。结果胶质瘤组织和细胞中DCLK1 mRNA和蛋白表达较癌旁正常组织和正常神经胶质细胞均显著升高(P<0.001)。与sh-Con组比,sh-DCLK1组的胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力及细胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7表达显著降低(P<0.01;P<0.001);sh-DCLK1组裸鼠体内的瘤体体积和瘤体质量明显降低(P<0.001)。结论敲低DCLK1能抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与抑制TGF-β/Smads信号活性有关。     

Overexpression of LACTB,a Mitochondrial Protein That Inhibits Proliferation and Invasion in Glioma Cells

LACTB, a mitochondrial protein, was ubiquitously expressed in different mammalian tissues, such as liver, heart, and skeletal muscle. It has been shown that LACTB is downexpressed in breast cancers, and it suppresses the proliferation and promotes the apoptosis of breast cancers. However, its role in the progression and prognosis of glioma remains unknown. In this study, we analyzed the clinicopathological features and outcomes of LACTB expression in 98 glioma patients and investigated the effects of LACTB overexpression on the proliferation, invasion, and angiogenesis of glioma cells in vitro. We observed a significant decrease in LACTB expression in glioma, and downexpression of LACTB is correlated with a poor prognosis of glioma patients. Moreover, Cox regression analysis reveals that the LACTB is an independent prognostic indicator for glioma patients. Overexpression of LACTB could suppress the proliferation, invasion, and angiogenesis of glioma cells. In addition, overexpression of LACTB could inhibit the expression of PCNA, MMP2, MMP9, and VEGF. Taken together, these data indicate that LACTB may serve as a promising therapeutic target for gliomas.     

miR-126下调MMP-2抑制人脑胶质瘤细胞侵袭

目的初步探讨miR-126抑制人胶质瘤细胞侵袭的可能机制。方法化学合成miR-126,脂质体转染人脑胶质瘤U87细胞,应用RT-PCR、Western blot检测MMP-2基因和蛋白的表达情况,并应用Transwell小室检测转染前后细胞侵袭力的变化。结果miR-126上调后U87细胞的MMP-2基因和蛋白表达降低,并且细胞侵袭力明显降低。结论化学合成的miR-126在抑制人胶质瘤细胞侵袭过程中发挥重要作用,可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

沉默EZH2基因表达对肾癌细胞生物学行为的影响

目的 研究RNA干扰靶向沉默EZH2基因表达对ACHN肾癌细胞株增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法 应用Western blot法检测EZH2蛋白在人正常近端肾小管上皮细胞株HK-2和肾癌细胞株786-0和ACHN中的表达。脂质体法介导化学合成EZH2 siRNA转染ACHN细胞株,Western blot法检测转染后ACHN细胞EZH2蛋白的表达情况,CCK-8法检测转染后ACHN细胞增殖率,流式细胞术检测转染后ACHN细胞周期分布和凋亡情况。结果 肾癌细胞株786-0和ACHN中EZH2蛋白的表达水平明显高于人正常近端肾小管上皮细胞HK-2。RNA干扰EZH2基因可成功地敲减ACHN细胞EZH2蛋白的表达。EZH2-siRNA干扰后,实验组ACHN细胞生长明显受抑制,在转染后48和72 h细胞增殖受抑制效应著（P＜0.05）。细胞周期分析显示：siEZH2转染组G1期ACHN细胞比例呈增加趋势,而S期和G2期细胞比例呈减少趋势,其中在转染后48h G1期ACHN细胞比例显著增加,而S期和G2期细胞比例明显下降（P＜0.05）;凋亡分析显示：siEZH2转染组ACHN细胞凋亡率随转染后时间的延长而呈增加趋势,在转染后48和72 h细胞凋亡率增加最显著（P＜0.05）。结论 沉默EZH2基因表达可靶向肾癌ACHN细胞周期中G1/S限制点而阻滞细胞周期进展,同时可有效抑制肾癌细胞增殖和促进细胞凋亡。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对胶质瘤细胞增殖及MKK7表达的影响

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACI）对胶质瘤细胞增殖及MKK7表达的影响。方法 体外培养神经胶质瘤细胞株U251,用脂质体转染MKK7-siRNA1、MKK7-siRNA2和对照siRNA,48 h后Western blot检测MKK7表达及JNK/c-Jun活性,BrdU掺入实验检测细胞增殖情况;用0.5 μM组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A（trichostatin A, TSA）处理细胞8 h,DMSO作对照,Western blot检测MKK7、p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun表达或磷酸化水平;用TSA分别处理细胞8、12、24 h,检测各时间点细胞增殖率;用其他组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括伏立诺他（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）,丙戊酸（valproic acid, VPA）,M344处理细胞检测MKK7表达及细胞增殖。结果 同对照组相比,沉默MKK7表达抑制了JNK/c-Jun活性和细胞增殖（P=0.008）;TSA处理细胞8 h显著抑制MKK7表达及JNK/c-Jun活性,SAHA、M344、VPA均显著抑制MKK7表达。TSA处理细胞8 h没有抑制细胞增殖,处理12 h显著抑制增殖（P=0.006）, 24 h抑制效应更明显（P=0.002）; SAHA（P=0.001）, M344（P=0.008）或VPA（P=0.002）处理细胞12 h均抑制了细胞增殖。结论 组蛋白去乙酰化酶抑制剂可通过抑制MKK7表达抑制神经胶质瘤细胞增殖。