大鼠毛囊干细胞体外培养及基因转染方法

目的：探讨大鼠毛囊干细胞体外培养和基因转染的方法.方法：采用组织块法分离、培养大鼠触须隆突部毛囊干细胞,经Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化后,采用碱性磷酸酶染色和细胞免疫荧光染色进行细胞鉴定,测定细胞生长曲线,并分别采用脂质体和慢病毒质粒进行毛囊干细胞基因转染.结果：经两次Ⅳ型胶原贴壁筛选后,毛囊干细胞呈克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特征,碱性磷酸酶染色阳性,角蛋白-15、整合素-α6和整合素-β1表达均为阳性.细胞生长曲线显示毛囊干细胞在接种后第3天时出现干细胞克隆;第5天和第6天时细胞处于对数生长期.脂质体介导的毛囊干细胞基因转染率为1.55％～17.21％,中位数9.63％;慢病毒介导的毛囊干细胞基因转染率为62.14％ ～79.42％,中位数71.52％.结论：采用组织块法分离、培养大鼠触须隆突部毛囊干细胞,经Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化后,毛囊干细胞可保持较好的生长状态和较强的克隆形成能力,且慢病毒介导毛囊干细胞基因转染比脂质体转染更高效、稳定.     

黄芪诱导表皮干细胞增殖构建组织工程皮肤治疗皮肤缺损

目的:观察黄芪对人表皮干细胞增殖的影响,并探讨采用表皮干细胞构建组织工程皮肤用于皮肤缺损修复治疗的可能性.方法:利用胶原快速贴附法分离纯化人表皮干细胞,以含黄芪、成纤维细胞条件培养液的表皮干细胞培养液进行体外培养,通过β1整合素和角蛋白19免疫组化染色、细胞克隆形成率测定,对培养细胞进行鉴定;并将表皮干细胞与真皮支架材料复合构建组织工程复合皮肤,移植于兔耳全层皮肤缺损创面,观察创面愈合情况及毛囊的组织学变化.结果:人表皮干细胞表达β1整合素和角蛋白19,呈明显克隆性生长,其克隆形成率明显高于角质细胞对照组;兔耳创面愈合后8周可见新生毛囊形成.结论:在本实验条件下,黄芪能诱导表皮干细胞增殖,表皮干细胞可参与创面新生毛囊结构的形成,具有构建组织工程皮肤完整修复皮肤结构和功能的应用前景.     

大鼠MSCs的体外分离、培养及鉴定的实验研究

[目的]体外分离、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）。[方法]密度梯度离心法体外分离、培养7周龄sD大鼠MSCs,利用差速贴壁原理纯化MSCs,并通过形态学观察、细胞表面抗原标志物、多细胞系诱导分化对其进行鉴定。[结果]第3代（P3代）不表达抗原CD34,表达抗原CD44,符合MSCs表面标志物特征。[结论]密度梯度离心法能够建立稳定的MSCs体外分离培养体系。     

嗅鞘细胞的原代培养

目的：探讨大鼠嗅鞘细（olfactory ensheathing cells，OECs）培养纯化方法并对其形态学进行研究。方法：取材后采用差速贴壁法和NGFRp75免疫吸附法相结合的纯化培养方法培养嗅鞘细胞，并分不同阶段进行观察和NGFRp75免疫组化染色鉴定。结果：成功培养出高纯度的嗅鞘细胞，胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形三种类型，突起细长编织成网状为其特点。结论：用差速贴壁法和NGFRp75免疫吸附法相结合的纯化培养方法得到的嗅鞘细胞纯度达95％以上，证实是一种简单经济而又有实效的嗅鞘细胞培养方法。     

复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的影响

目的研究复叶耳蕨总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化的影响。方法采用全骨髓差速贴壁法体外分离、纯化和培养大鼠骨髓间充质干细胞;取P3代细胞,分实验组和对照组,用流式细胞仪测定细胞表面标志物鉴定细胞,采用MTT法检测细胞生长曲线。显微镜下观察两组的细胞形态和组织化学染色的钙化结节;速率法测定碱性磷酸酶(ALP)活性和RT-PCR检测骨髓间充质干细胞诱导分化过程中骨桥蛋白和I型胶原的mRNA表达来鉴定成骨作用。结果体外培养的细胞表达表面标志;复叶耳蕨总黄酮对骨髓间充质干细胞内ALP活性增高并形成明显钙结节;PCR结果显示复叶耳蕨总黄酮上调骨桥蛋白和I型胶原的mRNA表达。结论 20μg/mL复叶耳蕨总黄酮可促进大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为成骨样细胞。     

乳鼠心肌细胞的培养

目的：原代培养乳鼠心肌细胞及进行形态学观察。方法：胰蛋白酶和Ⅱ型胶原分离消化心肌组织，差速贴壁和化学方法纯化心肌细胞。结果：12h心肌细胞基本贴壁，1—3天形成细胞簇，并出现同步搏动。结论：胰蛋白酶和胶原酶混合使用可以分离出数量较多、状态良好的心肌细胞。     

成肌细胞体外培养中两种纯化方法的比较

目的：比较成肌细胞体外培养中两种纯化方法的优劣。方法：将鸡胚成肌细胞进行体外培养，分别用差速贴壁法和Percoll液梯度离心法纯化成肌细胞。每组培养皿中放置3块盖玻片。每天观察两组细胞的增殖情况，细胞贴壁后第7d更换融合培养基，继续培养6d，取出盖玻片进行HE染色，观察细胞融合情况。结果：两组细胞都有融合，但梯度离心法纯化后培养的细胞融合率较贴壁组高，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：梯度离心法纯化的成肌细胞培养后细胞纯度更高，建议用此法进行成肌细胞的纯化。     

壮骨颗粒对骨髓间充质干细胞分化影响的实验研究

目的：探索壮骨颗粒对骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖和分化的影响。方法：通过全骨髓贴壁法分离3～4月龄的正常新西兰大白兔的骨髓,利用差速贴壁原理纯化MSCs并通过形态学（光镜）、流式细胞仪对大白兔MSCs表面抗原测定对其进行鉴定,建立稳定的MSCs培养体系,分别添加壮骨颗粒组和硫酸氨基葡萄糖组工作液,然后分别进行增殖活性以及分化活性的测定。结果：壮骨颗粒组和硫酸氨基葡萄糖组软骨细胞的增殖和分化活性均高于空白组（P〈0.01）;壮骨颗粒组的增殖活性高于硫酸氨基葡萄糖组,2组软骨细胞分化相差不大。结论：壮骨颗粒可以明显促进MSCs增殖和分化。     

左归丸含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化中碱性磷酸酶含量的影响

目的:研究左归丸含药血清对间充质干细胞骨向分化过程中碱性磷酸酶含量变化的影响。方法:采用全骨髓贴壁法培养间充质干细胞,连续进行3次差速贴壁法纯化间充质干细胞。常规诱导组以β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C诱导间充质干细胞骨向分化,实验组在常规诱导组基础上加以左归丸含药血清。使用茜素红染色钙结节、碱性磷酸酶染色鉴定诱导成功。分别在0,7,14,21 d用比色法检测细胞中碱性磷酸酶含量。结果:全骨髓贴壁法和差速贴壁法联合使用可得到较为均一间充质干细胞。用比色法测得碱性磷酸酶含量随着诱导时间延长而增加。结论:大鼠间充质干细胞经药物诱导后可以分化为成骨细胞。左归丸含药血清能够促使诱导过程中碱性磷酸酶含量表达增加。     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定

目的：建立成年小鼠骨髓间充质干细胞（MSC）的分离和培养方法，并对其表面标志进行鉴定，为其应用提供实验依据。方法：应用体外细胞培养技术将小鼠MSC自股骨、胫骨中分离、纯化和培养，倒置显微镜观察其生长过程，流式细胞仪检测MSC表面抗体的表达。结果：使用全骨髓贴壁分离方法分离、扩增的MSC贴壁后形态较均一，生长良好，细胞表达CD29，CD44，但CD34和CD45表达阴性。结论：可以用全骨髓贴壁法从小鼠骨髓分离培养出MSC，在体外进行有效扩增，为以小鼠为模型研究MSC在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的运用提供实验基础。     

人骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨一种优化的骨髓问充质干细胞（Bonemarrow stromal stem cells,BMSCs）获取、分离、培养、鉴定的方法,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法：抽取健康自愿者骨髓,采用密度梯度离心法分离贴壁培养BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,结合流式细胞技术来间接鉴定BMSCs。结果：首次换液时间为5—6d,20d左右细胞逐渐汇集可以进行传代,获得纯化的人的BMSCs。结论：采用密度梯度离心法分离贴壁培养的方法能够分离纯化的人BMSCs,9代以前生长迅速,形态稳定,可传至11代,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

活血健脾补肾法对MSC移植在结肠炎大鼠肠道增殖分化的影响

目的：探讨中医活血健脾补肾法对骨髓间充质干细胞（MSC）移植在结肠炎大鼠肠道增殖分化的影响。方法：雌性SD大鼠以5%2、4、6,三硝基苯磺酸（TNBs）诱导形成结肠炎模型,造模后随机分为模型对照组、MSC移植组、活血组、健脾组、补肾组,第2天将体外分离培养的雄性SD大鼠MSC经尾静脉注射到各组雌性大鼠体内。疗程结束后,取大鼠结肠组织,免疫组化法检测其肠道干细胞标记物Musashi-1、端粒酶逆转录酶（TERT）的表达。结果：免疫组化检测到MSC移植组及中药治疗各组大鼠结肠黏膜组织Musashi-1及TERT均有阳性表达,其中活血组与MSC移植组比较差异有显著性意义。结论： 活血法代表方药桃红四物汤较明显促进MSC在结肠炎大鼠肠道增殖分化。     

三种抗高血压药对血管平滑肌细胞增殖的影响研究

目的：探讨拉西地平、福辛普利钠、坎地沙坦酯这三类临床常用抗高血压药对人动脉血管平滑肌细胞增殖的影响,对比三者差异,为临床抗高血压用药提供新思路.方法：采用组织块贴壁法原代培养人脐带动脉血管平滑肌细胞,并传2～3代,采用免疫组织化学染色法鉴定;应用MTS法检测拉西地平、福辛普利钠、坎地沙坦酯对人动脉血管平滑肌细胞增殖的作用.结果：组织块贴壁法原代培养HUA-SMCs,传3代后,阳性细胞率为90％;拉西地平、福辛普利钠对人动脉血管平滑肌细胞的增殖均有抑制作用,而坎地沙坦酯对人动脉血管平滑肌细胞增殖的抑制作用无统计学意义.结论：拉西地平、福辛普利钠在治疗高血压时还可以抑制血管平滑肌细胞异常增殖,对血管有保护作用,而另一种抗高血压坎地沙坦酯则无此作用.     

构树叶中的细胞毒成分（英文）

目的：研究构树叶的化学成分。方法：采用D101型大孔吸附树脂、硅胶、ODS和半制备型高效液相色谱等分离方法对构树叶提取物分离纯化,通过1D,2DNMR技术确定其结构,并采用MTT法对分得化合物进行细胞毒活性测定,同时比色法和采用高效液相色谱法建立了对构树叶中总黄酮和cosmosiin的含量测定方法。结果：分离鉴定了6个化合物,它们的结构鉴定为：（＋）-pinoresinol-4′-O-β-D-glucopyransyl-4″-O-β-D-apiofuranoside（1）,cosmosiin（2）,luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside（3）,liriodendrin（4）,3,5,4′-trihydroxy-bibenzyl-3-O-β-D-glucoside（5）,apigenin-6-C-β-D-glycopyranside（6）。结论：化合物1为一个新的木脂素,化合物5,6为首次从该属植物中分离,化合物1,4,6对HepG-2细胞株有不同程度的抑制活性,而化合物2,3,5对HepG-2细胞株没有活性;根据含量测定结果得知,确定构树叶的最佳采收时间为9月份。     

中药强心饮含药血清对心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的：研究强心饮对肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNF—α）诱导新生大鼠心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts CFs）增殖和胶原合成的影响,探讨其抑制心肌纤维化的作用机制。方法：采用胰酶消化法分离培养乳鼠CFs,建立TNF—α诱导新生大鼠CFs纤维化病理模型,分别采用四氮唑蓝（MTT）比色法、羟脯氨酸法检测不同浓度强心饮含药血清对CFs增殖和胶原含量影响。结果：TNF—α能够刺激CFs增殖和胶原合成,与空白组相比差异显著（P〈0．05）;强心饮抑制TNF—α诱导CFs增殖和胶原合成（P均〈0．05）。结论：强心饮通过抑制TNF—α诱导的CFs增殖和胶原合成,发挥有效的抗心肌纤维化作用。     

马钱苷对黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型黑素合成的影响

目的：探讨马钱苷对黑素瘤细胞A375与角质形成细胞Hacat共培养模型黑素合成的影响。方法：将A375细胞和Hacat细胞构建共培养模型,以不同浓度马钱苷进行干预,通过MTY法、NaOH裂解法、多巴氧化法分别测定共培养模型的细胞增殖率、黑素含量和酪氨酸酶活性。结果：与阴性对照组相比,马钱苷10-mol／L、1016moL／L和10-7mol／L组对共培养细胞增殖率无显著性差异（P〉0．05）。马钱苷10-mol／L和10。mol／L组对共培养模型黑素合成及酪氨酸酶活性有极显著性差异（P〈0．01）。与阳性对照组相比,马钱苷10。moL／L组对共培养模型酪氨酸酶活性有极显著性差异（P〈0．01）,马钱苷10山mol／L和10。mol／L组对共培养模型黑素合成无显著差异（P〉0．05）。结论：马钱苷可能通过抑制酪氨酸酶活性减少共培养模型黑素合成。     

补肾活血方对噪声性听损伤防治作用的实验研究

目的：观察补肾活血中药对豚鼠噪声性听损伤的防治作用。方法：将豚鼠随机分为正常对照组、模型对照组、预防组和治疗组。后3组豚鼠暴露在频率为4kHz强度为110dB SPL的稳态白噪声中6h×6天。预防组和治疗组分别于噪声暴露前7天和噪声暴露结束后给予中药灌胃,预防组同期灌胃相同剂量的生理盐水,正常组不予给药,均连续13天。以听性脑干诱发电位（ABR）评价各组豚鼠听功能的变化;耳蜗基底膜铺片计数比较外毛细胞损伤率;扫描电镜观察耳蜗毛细胞形态学变化;耳蜗螺旋韧带铺片观察血管纹充盈情况。结果：与模型组和治疗组比较,预防组豚鼠的ABR阈值、毛细胞损伤率均明显降低（P〈0.05）,波潜伏期显著缩短（P〈0.01）,电镜下毛细胞受损程度较轻,光镜下血管纹呈轻度缺血;与模型组比较,治疗组豚鼠的ABR阈值明显降低（P〈0.05）,波潜伏期显著缩短（P〈0.01）,但毛细胞损伤率无明显差异（P〉0.05）;电镜下两组毛细胞损伤程度均较重,但光镜下血管纹缺血程度相对较轻。结论：补肾活血方对噪声性听力损伤具有显著的预防作用,在改善听功能方面具有一定的治疗作用,预防效果明显优于治疗效果。     

补肾壮骨颗粒含药血清对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的：探讨补肾壮骨颗粒含药血清对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞（ MSCs）体外增殖的影响。方法：选用10只6月龄SD大鼠去卵巢制作骨质疏松模型,对骨质疏松骨髓间充质干细胞进行分离和体外培养,传代后的 MSCs分为OP组、OP＋补肾壮骨颗粒含药血清组和OP＋空白血清组,倒置显微镜观察各组MSCs的生长情况,进行形态学观察,并用四甲基偶氮唑蓝（ MTT）法测定生长曲线。结果：OP＋含药血清组,MSCs呈典型的集落生长,细胞呈长梭形,突起细长且多,细胞增殖较旺盛,细胞数量不断增加,随着传代次数的增多,细胞增殖速度减慢。OP组及OP＋空白血清组MSCs接种后胞体立体感下降,体积较大,细胞偏圆形,突起收缩,增殖速度较慢,细胞数量减少;随着传代次数的增多,细胞增殖速度显著减慢。OP＋补肾壮骨颗粒含药血清组骨髓间充质干细胞增殖能力明显提高,生长曲线有显著性差异。结论：补肾壮骨颗粒含药血清能促进去卵巢骨质疏松大鼠MSCs的增殖。     

山楂核中具有抗肿瘤活性化合物的分离(英文)

目的:对山楂核的化学成分及生物活性进行研究。方法:运用大孔吸附树脂D101,硅胶,ODS和制备高效液相色谱等方法分离化合物,通过多种波谱方法进行结构鉴定。此外,还对化合物进行了OPM2和RPMI-8226两组细胞株的细胞毒活性测试。结果:从山楂核中得到4个化合物:(7S,8S)-4-[2-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-(hydroxymethyl)ethoxy]-3,5-dimethoxybenzaldehyde(1),(+)-balanophonin(2),erythro-guaiacylglycerol-β-coniferylaldehydeether(3),buddlenolA(4)。结论:化合物1为一新降木脂素。化合物24为属内首次分离得到。活性测试结果表明化合物14的抗肿瘤活性不明显。