慢乙肝患者HBVP区基因变异与病情的相关性及阿德福韦酯治疗效果观察

目的观察乙型肝炎病毒（HBV）P区基因YMDD变异与慢性乙型肝炎（慢乙肝）病情的关系及阿得福韦酯的治疗效果。方法对167例慢乙肝患者血清行HBVP区基因测序检测YMDD变异（耐药株）;同时检测肝功能（ALT）、HBV—DNA水平。肝穿刺活检判断肝损伤程度。对检出耐药株者应用阿德福韦酯治疗1a。结果59例患者检出耐药株,占35．3％;其肝功能损伤程度为轻度10例,中度42例,重度7例;ALT、HBV．DNA水平显著高于未检出耐药株者,P〈0．05。服用阿德福韦酯1a后,肝损伤为轻、中、重者分别为28、27、4例;ALT及HBV．DNA冰平明显降低,P〈0．05。结论HBVP区基因变异可加重慢乙肝病情;阿德福韦酯治疗耐药的慢乙肝疗效较好。     

利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组HBV聚合酶RT区段蛋白。方法构建含有HBVP基因RT区段的杆状病毒转移载体pFastBac HT-RT，转化大肠埃希菌DH10B-ac进行重组，提取重组BacmidDNA质粒，转染昆虫细胞SD获得含有HBVP基因RT区段的重组杆状病毒。重组的杆状病毒再感染SO细胞进行HBVP基因RT区段蛋白表达，通过Western blot检测表达情况。结果成功构建了含HBVP基因RT区段的重组杆状病毒，昆虫细胞Sf9中能检测到HBVP基因RT区段蛋白的表达。结论利用杆状病毒表达系统能成功地表达HBVP基因RT区段蛋白。     

不同靶区RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制与表达

目的 观察针对乙型肝炎病毒（HBV）不同靶区发夹样RNA（shRNA）抑制HBV复制与表达的效率。方法 根据shRNA表达载体设计原则，设计并构建了针对HBVP、C、S和X区7种特异性和2种序列突变的shRNA表达载体，将其与1．3倍HBV全基因表达载体共转染于HepG2细胞，通过Southernblot和酶联免疫吸附法分别检测HBV DNA复制中间体和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平，来观察shRNA抗HBV复制与表达的效率。结果 发现针对HBV不同靶区shRNA均有抗HBV复制和表达效果，以P1、S2、C2、S1和X抑制HBV DNA复制效率较高，P1的抑制率高达95％。HBsAg表达受抑制情况与HBV DNA复制受抑制的程度相似，其中C2、C1和S2对HBsAg的抑制作用较强。结论 针对HBV四个开放性读码框进行RNA干扰对HBV复制和抗原表达均有抑制作用，其中P1和C2分别对HBV复制和表达的抑制效率较高。     

乙型肝炎病毒P22e蛋白经核因子-κB抑制HepG2细胞凋亡

目的 探讨核因子-κB(NF-κB)在乙型肝炎病毒P22e蛋白抑制HepG2细胞凋亡中的作用.方法 用含HBV P22e基因的重组pEGFP-C2HBVP22e质粒的肝癌细胞HepG2,以放线菌素-D(Act-D)、肿瘤坏死因子(TNF)α诱导该细胞凋亡,采用激光共聚焦显微镜、核蛋白电泳迁移率等技术,观察在HBV P22e抑制TNFα诱导HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞的凋亡过程中NF-κB的核转移、活化等情况.用NF-κB抑制剂ALLN抑制其信号通路,检测以Act-D、TNFα诱导的HepG2、HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞凋亡率的变化.对实验结果的数据分析用秩和检验和t检验. 结果激光共聚焦显微镜及电泳迁移率实验观察到HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞在发生凋亡前后,有明显的NF-κB向核内迁移活化现象.NF-κB抑制剂ALLN可使以Act-D、TNF α诱导HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞的凋亡率明显升高(6.19%±1.58%与39.99%±7.620/0,t=7.515,P<0.01).结论 在HBV P22e蛋白抑制肝癌细胞凋亡过程中,NF-κB信号途径起着重要作用.     

乙型肝炎病毒/P22蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的研究HBV／P22蛋白对肿瘤坏死因子（TNF）α诱导的HepG2细胞凋亡的影响。方法用放线菌素D和TNFo【分别诱导表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞（实验组）、表达空载体的HepG2细胞（阴性对照组）和HepG2细胞（空白对照组）凋亡，雅培试剂检测细胞上清液中HBeAg的表达，Westernblot及免疫细胞化学法检测HBV／P22蛋白表达，流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。体内实验：将前述三种细胞分别注射入裸鼠皮下，放线菌素D、TNF仅注射瘤体后，免疫组织化学法检测组织HBV／P22蛋白的表达，TUNEL法检测组织细胞凋亡率。结果实验组细胞培养上清液中HBeAg表达阳性，两对照组阴性；Westernblot及免疫细胞化学法检测均显示实验组细胞有HBV／P22蛋白表达，两对照组均为阴性；流式细胞仪和TUNEL结果均显示实验组细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。体内实验：实验组瘤体组织免疫组织化学检测结果显示HBV／P22蛋白表达阳性，TUNEL检测结果显示接种表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞裸鼠瘤组织细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。结论HBV／P22蛋白在体内外均可抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白在血清学诊断乙肝病毒复制中的研究

目的：探讨前S1蛋白（Pre—S1）在血清学诊断乙肝病毒复制中的意义。方法：选择慢性乙型肝炎患者血清250例。分别测定每份患者血清中HBV标志物、前S1蛋白和HBV DNA。结果：HBeAg（＋）组中前S1蛋白阳性率97．2％（70／72），HBV DNA阳性率100％（72／72）。HBeAg（-）组中前S1蛋白阳性率60．1％（107／178），HBV DNA阳性率63．5％（113／178）。前S1蛋白和HBV DNA的总符合率为89．6%（224／250），2者差异无统计学意义（P〉0．05）。HBeAg和HBV DNA的总符合率为54．8％（137／250），2者差异有统计学意义（P〈0．01）。HBsAg（-）中检出前S1蛋白阳性2例。结论：前S1蛋白比HBeAg更敏感地反映HBV复制情况，且可弥补由于HBsAg基因编码区突变造成的漏诊。     

拉米夫定联合替诺福韦治疗艾滋病合并慢性病毒性乙型肝炎的临床和实验研究

目的探讨拉米夫定（3TC）联合替诺福韦（TDF）治疗重症艾滋病（AIDS）合并慢性病毒性乙型肝炎（CHB）患者的疗效。方法收集患者住院治疗及随访阶段的实验室检查数据。高效抗反转录病毒（HAART）治疗前及治疗后24周、28周留取患者血标本,用巢式PCR扩增HBVP基因区,反转录．巢式PCR扩增HIV pol基因区,分析HBV及HIV是否发生耐药。结果患者随访1年身体状况佳,主要实验室检查基本正常,未发现HBV相关耐药,HIVRNA扩增结果为阴性。结论联合3TC与TDF两种药物的HAART方案能在短期内达到对HIV和HBV两种病毒的抑制,临床疗效显著。     

HBV 相关慢性肝衰竭患者白介素-17 及白介素-6检测分析

目的：探讨HBV相关慢性肝衰竭（HBV related chronic liver failure，HBV-CLF）患者细胞因子表达及其与预后的关系。方法：采用流式液相多重蛋白定量技术检测HBV—CLF患者及慢性乙型肝炎（CHB）患者血清IL．17及IL-6水平，并对HBV—CLF患者进行为期24周随访，分为死亡组及存活组。结果：HBV-CLF患者IL-17及IL-6水平高于CHB患者（P〈0．05）；HBV—CLF患者死亡组IL-17水平高于存活组（P〈0．05），两组间IL-6水平之差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：IL．17和IL-6可能与肝衰竭的发病机理有关，其中IL．17水平与患者预后有一定相关性。     

乙型肝炎病毒基因变异、p16蛋白失活与肝癌的相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）基因变异及肿瘤抑制基因p16蛋白失活与肝癌发生的关系。方法用基因芯片和核苷酸序列分析技术对114例HBV感染者（观察组）血清和43份肝组织标本中HBV DNA（前C区1814、1896、BCP区1762、1764位）进行分析，用流式细胞荧光染色法检测观察组和20例正常献血者（正常对照组）外周血白细胞中p16蛋白表达。结果观察组慢性重症乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者血清HBV基因总突变率显著高于慢性乙型肝炎患者（P〈0．01），肝硬化、肝癌肝组织HBV基因总突变率显著高于正常组织；正常对照组外周血自细胞中p16蛋白阳性率显著低于慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者，肝硬化、肝癌患者阳性率显著高于慢性乙型肝炎患者。结论HBV变异可能是肝癌发生的始动因子，而p16蛋白失活是肝癌发生的重要因素。     

乙型肝炎病毒外膜大蛋白血清学检测及临床意义

HBV的外膜蛋白主要包括主蛋白、中蛋白和大蛋白。大蛋白存在于感染性颗粒（Dane颗粒）和亚病毒管状颗粒上，是病毒形成完整外膜的重要标志，与病毒复制密切相关，对HBV复制过程具有反式激活作用，并与病毒颗粒从细胞内释放有关，过量乙肝病毒外膜大蛋白（HBV—LP）在肝细胞内质网积聚是导致内质网应激的关键因素，并与肝细胞毒性甚至肝癌相关。有研究表明，HBV—LP具有双重跨膜拓扑结构，这是HBV—LP发挥多种功能作用的依赖性结构，针对HBV—LP特殊构象制备的单克隆抗体，     

乙型肝炎病毒RNA上La蛋白结合位点缺失对S基因mRNA稳定性的影响

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）RNA上La蛋白结合位点的缺失对S基因mRNA在细胞内稳定性的影响，评价HBV RNA上这个位点对HBV生命周期的重要性，从而寻找新的抗HBV靶点。方法构建HBV突变载体，使其转录出来的HBV RNA缺失La蛋白结合位点；计算机预测突变后这个位点所在的HBV RNA片段的二级结构，将未突变的HBV载体和HBV突变载体分别瞬时转染HepG2细胞；半定量逆转录聚合酶链反应法检测HBV S基因的mRNA，酶联免疫吸附法检测乙型肝炎表面抗原。结果酶切鉴定和测序证明，成功构建了La蛋白结合相关位点部分碱基缺失的HBV突变载体——pHBV—mLa；突变后的HBV RNA二级结构同突变前的比较，完全改变；转染细胞后半定量逆转录聚合酶链反应法检测发现，突变后HBV S基因的mRNA水平显著降低（t′=12．703，P〈0．05）；酶联免疫吸附法检测发现突变引起乙型肝炎表面抗原表达明显下调（t=44．648，P〈0．01）。结论HBV RNA上La蛋白的结合位点以及局部特殊二级结构的形成，影响着自身转录后的稳定性，对于HBV的生命周期至关重要。     

乙型肝炎病毒cccDNA定量与乙型肝炎临床及病理关系

目的探讨慢性乙型肝炎（CHB）肝组织HBVcccDNA定量与乙型肝炎的关系。方法分别采用荧光定量PCR、酶联免疫吸附分析法（ELISA）检测48例CHB肝组织HBVcccDNA定量、肝组织和血清HB VDNA定量、乙型肝炎病毒标志物。同时用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法（SP）检测肝细胞中HBcAg表达。分析肝组织HBVcccDNA与组织和血清HBV DNA、HBeAg、肝细胞内HBcAg水平及肝脏炎症活动度的关系.结果1．肝组织HBVcccDNA定量与组织和血清HBV DNA定量呈正相关（r=0．837，P〈0．001；r=0．627，P〈0．005）；2．肝组织HBV cccDNA定量与肝细胞内HBcAg半定量呈正相关（r=0．618，P〈0．005）；3．肝组织HBV cccDNA定量与肝脏炎症活动度尤明显相关（P〉0．05）：4．HBeAg阳性较抗-HBe阳性患者肝组织HBV cccDNA定量、肝组织和血清HBV DNA定量高（P〈0．05）。结论荧光定量PCR法检测肝组织HBV cccDNA定量是评价HBV复制最直接可靠的指标，在CHB的诊断和抗病毒治疗中有重要意义。但与肝组织炎症无明显相关。     

乙型肝炎病毒基因型与聚合酶基因异质性

目的 对202株乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶基因(P基因)序列进行系统分析，研究HBV基因型间P基因差异，为进一步研究HBV基因型、P基因变异与病毒复制及核苷类似物耐药的关系提供参考。方法 采用计算机软件对GenBank中己发表的202株HBV全序列及P基因进行分析比较。结果 HBVP基因在各基因型具有自身特点：在反转录酶(rt)区，A基因型氨基酸的型内差异较小，C、D基因型氨基酸的型内差异较大，在rt区A—F6个高度保守区域，发现在基因型间及型内存在氨基酸水平的差异。结论 (1)P基因及其氨基酸存在基因型间和型内异质性，因而分析某些氨基酸差异是与耐药有关还是准株被选择的结果，应综合考虑在该位点是否存在基因型间或型内的氨基酸差异，(2)对核苷类似物抗病毒治疗应答以及治疗中耐药现象的发生在HBV不同基因型可能不同。     

不同HBV标志物模式的乙型肝炎患者HBV表面大蛋白的检测及与HBVDNA水平的相关性

目的通过检测乙型肝炎病毒标志物（HBVM：HBsAg／抗-HBs、HBeAg／抗一HBe、抗一HBc）不同模式的乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒外膜大蛋白（HBV—LP）、乙型肝炎病毒前s1抗原（HBVpreSl）、HBVDNA,探讨HBV—LP与HBVDNA及HBVM模式间的关系,研究HBV—LP用于乙型肝炎患者临床诊治的意义。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对HBV—LP、HBVpreS1和HBVM进行检测;采用荧光定量PCR方法对HBVDNA进行检测。结果乙型肝炎患者大蛋白检测结果与HBVDNA检测结果差异无统计学意义（X^2=1．97,P〉0．05）。HBV—LPA值随HBVDNA拷贝数的增加呈上升趋势,二者之间存在良好的相关性（r=0．565,P〈0．01）,在不同HBVDNA拷贝数组别间,HBV—LPA值差异有统计学意义（F=9．23,P〈0．01）。结论HBV—LP是反应HBV感染者体内病毒复制程度的良好的血清免疫学指标,血清中的HBV—LP与HBVDNA具有较好的相关性,特别是可作为HBeAg阴性患者体内监测病毒复制及预后判断的良好的血清学指标。     

慢性乙型肝炎病毒感染患者血清 preS1 Ag水平变化及意义

目的：探讨慢性乙型肝炎病毒（ HBV）感染患者血清表面抗原蛋白前S1抗原（ preS1Ag）水平变化及意义。方法选择确诊HBsAg阳性患者2545例（ HBV感染组）、HBsAg阴性即健康体检者172例（对照组）,均同步检测外周静脉血HBsAg、HBeAg、preS1Ag及HBV DNA。结果 HBV感染组中preS1Ag阳性1845例（72．50％）, HBeAg阳性808例（31．75％）,HBV DNA阳性1173例（46．09％）;对照组preS1Ag阳性4例（2．33％）;两组间preS1Ag阳性率比较差异有统计学意义（P＜0．05）。 HBV感染组preS1Ag阳性患者中HBsAg＞250 ng／mL、HbeAg阳性、HBV DNA≥103 copy／mL的比例均大于preS1Ag阴性患者（P均＜0．05）。 HBV感染组HBV DNA≥103 copy／mL的患者中,preS1Ag阳性组与preS1Ag阴性组间不同HBV DNA病毒载量差异无统计学意义（ P均＞0．05）。结论 preS1Ag能较好地反映HBV的感染状态及病毒复制情况。     

拉米夫定联合中药复方胶囊治疗慢性乙型肝炎疗效及其对乙型肝炎病毒YMDD变异的影响

拉米夫定在慢性乙型肝炎抗病毒（HBV）治疗上的广泛应用，是近年来乙型肝炎治疗上的重大进展，已成为慢性乙型肝炎的基础用药，但每年约有20%的患者出现HBVP基因YMDD变异。而中药通过调整机体免疫功能来治疗慢性乙型肝炎在临床上有一定的疗效。本研究采用中西医结合的方法，通过观察拉米夫定联合中药复方胶囊治疗慢性乙型肝炎的疗效及对YMDD变异的影响。     

慢性乙型肝炎、肝硬化患者肝组织病毒载量与肝组织损伤程度的关系

目的了解慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化患者肝内HBV载量的变化与肝组织损伤程度的关系及其对该类患者的预后意义。方法经血清学及肝穿刺病理组织学证实为CHB 46例,经血清学及影像学确诊、手术获得的肝硬化标本17例。采用实时荧光载量系统检测血清及肝组织HBV DNA载量,并观察肝组织炎症及纤维化程度。结果 （1）肝硬化组血清HBV DNA载量低于HBeAg阳性CHB组（P〈0.01）、高于HBeAg阴性CHB组（P〈0.001）;肝硬化组肝组织HBV DNA载量低于HBeAg阳性及HBeAg阴性CHB组（P〈0.001、P〈0.01）;HBeAg阳性及阴性CHB组的肝组织HBV DNA载量均高于血清HBV DNA载量（P〈0.05、P〈0.01）,肝硬化组肝组织HBV DNA载量低于血清（P〈0.001）。（2）CHB、肝硬化血清HBV DNA载量与肝组织的炎症及纤维化程度呈正相关（P〈0.05）,肝组织HBV DNA载量则与肝组织的炎症及纤维化程度呈明显负相关（P〈0.05）。结论肝组织HBV DNA较血清HBV DNA载量更能准确反映肝内HBV复制水平、肝组织损伤程度以及CHB、CHB肝硬化的进展程度。     

慢性乙型肝炎患者HBV核心区与聚合酶区特异性CTL表位变异分析

目的比较急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎与慢性重型乙型肝炎患者HBV C蛋白和Pol蛋白特异性CTL表位变异的差异,以探讨乙型肝炎重症化和慢性化的可能机理。方法对516例乙型肝炎患者的血清进行HLA-A2和A11分型;用巢式PCR扩增血清HBV C基因与Pol基因并对PCR产物进行序列测定;根据HBV S基因序列,用VirusBlast软件鉴定患者感染的HBV基因型;用Vector NTI软件对目前已知的HLA-A2限制性的4个C蛋白和5个Pol蛋白特异性CTL表位与HLA-A11限制性的1个C蛋白表位进行序列分析。结果 247例（47.86%）患者HLA-A2阳性,其中AHB 67例,CHB 109例,CSHB 71例;220例（42.64%）患者HLA-A11阳性,其中AHB 67例,CHB 107例,CSHB 46例;CTL表位变异分析结果如下：①在3组HLA-A2阳性患者,表位变异发生率无显著性差异（P〉0.05）;②在三组HLA-A2阳性HBV B基因型患者,P455-463和P816-824表位变异有极显著性差异（P〈0.01）;③在三组HLA-A2阳性HBV C基因型患者,各表位变异无显著性差异;④在三组HLA-A11阳性患者,C88-96表位变异发生率有显著性差异（P〈0.05）,三组HBV C基因型患者,表位变异发生率有极显著性差异（P〈0.01）,而在HBV B基因型患者,各表位变异无显著性差异（P〉0.05）。结论某些HBV C蛋白和Pol蛋白特异性CTL表位在AHB、CHB和CSHB患者间变异有明显差异,并且受感染病毒基因型的影响。CTL表位变异可能与乙型肝炎的重症化和慢性化机制相关。     

乙肝解毒胶囊治疗慢性乙型肝炎随机双盲阳性对照临床研究

目的：观察乙肝解毒胶囊治疗慢性乙型肝炎（CHB）的疗效及安全性。方法：60例CHB患者随机分为治疗组（乙肝解毒胶囊）及对照组（当飞利肝宁），每组30例，剂量为4粒／次，3次／d。共6个月，治疗期间检查患者肝功能、乙肝病毒标志物（HBV—M）及HBV DNA的变化。结果：6个月后，治疗组HBeAg、HBV DNA阴转率及HBeAg／HBeAb转换率比对照组明显改善（P〈0．05或0．01），治疗组HBV DNA下降幅度明显大于治疗组（P〈0．05）。治疗3个月和6个月后，HBV DNA水平下降幅率〉2log10 copies／ml的比例治疗组明显高于对照组（P〈0．05或0．01），两组患者的肝功能均有明显改善，但无明显差别（P〉0．05）。结论：乙肝解毒胶囊为有效、安全的抗HBV药物，值得进一步研究及临床应用。     

病毒性肝炎慢性HBV携带者血清中肝功能相关蛋白检测的临床意义

目的：了解慢性HBV携带者血清中肝功能相关蛋白胆碱脂酶（ChE）、白蛋白（Alb）、前白蛋白（PA）、转铁蛋白（TRF）、铁蛋白（FRT）、C反应蛋白（CRP）、铜蓝蛋白（CER）的水平，并且探讨这些蛋白对慢性HBV携带者的诊断价值。方法选取2012年1月至2014年7月在重庆医科大学附属永川医院就诊的86例慢性HBV携带者作为观察组，另外选取102例健康体检者作为对照组，分别检测其血清中ChE、Alb、PA、TRF、FRT、CRP、CER等生化指标，并对部分观察组人群进行肝穿刺活组织检查。计量资料组间比较采用独立样本t检验。结果观察组与对照组的CER水平分别为（0．20±0．04）g／L、（0．29±0．06）g／L，差异有统计学意义（t＝2.03，P＝0．03），其他指标差异均无统计学意义（P值均＞0．05）；观察组中，肝脏炎症程度高或纤维化程度高的患者血清中CER水平下降明显，差异均有统计学意义[（0．23±0．01）g／L vs （0．18±0．02）g／L，t＝－2．6，P＝0．01；（0．22±0．02）g／L vs （0．17±0．04）g／L， t＝－3．2，P＝0.004）。结论血清中CER水平的变化能反映早期肝脏炎症和纤维化程度，并可能成为慢性HBV携带者早期诊断与治疗的重要指标。