人红细胞血型糖蛋白A单克隆抗体的初步鉴定

目的：制备高效价的人红细胞血型糖蛋白A单克隆抗体（GPA McAb),为研制快速全血凝集试剂提供关键的双功能抗体成分。方法：首先用MNGP亚型GPA,经SPDP与小鼠血清白蛋白连接后,常规免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备GPA McAb;用ELISA和血凝方法对克隆进行筛选和鉴定。结果：4次融合共获3个可分泌高效价GPA McAb细胞株（3F6、5C7和5G3）。分泌的单克隆抗体均与GPA发生特异性反应,但均不引起人A、B、AB和O型红细胞凝集,属于人红细胞GPA的特异性非凝集抗体。在3株抗体中,2株为IgG1亚型,1株为IgG2亚型。结论：小分子GPA经与同种动物（免疫用动物）血清白蛋白连接后用作免疫抗原,研制的2株IgG1亚型抗体可用于全血凝集试剂中双功能抗体的制备。     

重组人内抑素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗重组人内抑素(ES)单克隆抗体(McAb)并进行鉴定。方法利用重组人ES为抗原,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,间接ELISA法对细胞培养上清进行筛检,对能稳定分泌抗重组人ES的细胞株,进行扩大培养。体内诱生法制备腹水并对其初步鉴定。结果获得3B4、1D10、1G5、2D10,4株能稳定分泌抗重组人ESMcAb的杂交瘤细胞株,并对3B4和1D10两株给予鉴定,其免疫亚型为IgG2a、IgG3。腹水ELISA效价为10-6、10-5。通过蛋白免疫印迹法和免疫组化证明抗体有特异性和敏感性。结论成功制备分泌抗重组人ES的杂交瘤细胞株,为研究人ES的表达及相关领域奠定了基础。     

SARS冠状病毒单克隆抗体制备及在肺尸检标本染色中的应用

目的制备抗SARS冠状病毒的单克隆抗体,用于SARS的实验室诊断。方法灭活SARS冠状病毒(PUMC01)全病毒免疫BALB／C小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(NS-1)融合,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光法(IFA)及免疫印迹法对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定,并用其中一株(M2)杂交瘤诱生的腹水单克隆抗体对SARS患者尸检肺组织切片进行免疫组织化学染色。结果共筛选出6株杂交瘤细胞,ELISA及IFA法证实其分泌的单克隆抗体与SARS冠状病毒有特异性反应,与其他常见呼吸道病原体均无交叉反应。免疫双扩散方法鉴定1株杂交瘤细胞(M2)为免疫球蛋白IgG3型,其余5株均为IgG1型。免疫印迹试验显示1株杂交瘤细胞(M2)分泌的抗体与相对分子质量68000的蛋白有特异性反应;4株杂交瘤细胞分泌的抗体与相对分子质量27000的蛋白有特异性反应,1株在免疫印迹上未见到结果。SARS患者尸检肺组织病理切片免疫组织化学染色阳性,在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及巨噬细胞的胞浆均可见阳性颗粒。结论我们制备的6株单克隆抗体是抗SARS冠状病毒的特异性单克隆抗体,用于SARS尸检肺组织免疫组化染色,结果阳性。     

十七种哺乳动物二级抗体的制备和辣根过氧化物酶标记

目的制备兔抗17种哺乳动物的二级抗体,并进行辣根过氧化物酶标记,为哺乳血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀法粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化哺乳动物的IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗哺乳动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗哺乳动物的二级抗体进行辣根过氧化物酶标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blot方法考察标记抗体的特异性。结果纯化了恒河猴、东北虎、布氏田鼠、黑线姬鼠、斑羚、原驼、果子狸、食蟹猴、梅花鹿、长爪沙鼠、马鹿、骆驼、大仓鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17种哺乳动物的血清IgG,分别免疫大耳白兔制备了这17种哺乳动物的兔抗血清,免疫双扩散法测定兔抗这17种哺乳动物的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗恒河猴IgG、兔抗东北虎IgG、兔抗布氏田鼠IgG、兔抗黑线姬鼠IgG、兔抗斑羚IgG、兔抗原驼IgG、兔抗果子狸IgG、兔抗食蟹猴IgG、兔抗梅花鹿IgG、兔抗长爪沙鼠IgG、兔抗马鹿IgG、兔抗骆驼IgG、兔抗大仓鼠IgG、兔抗豚鹿IgG、兔抗熊猴IgG、兔抗大耳羊IgG和兔抗雪貂IgG等17种哺乳动物的二级抗体进行了辣根过氧化物酶标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶(2000～60000)左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗17种哺乳动物的二级抗体,为哺乳动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

人巨细胞病毒单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定

目的制备具有中和人巨细胞病毒(HCMV)感染作用的单克隆抗体并对其进行生物学活性鉴定.方法用HCMV抗原免疫Balb/c小鼠5、6次后,取致敏的脾脏B淋巴细胞和HGPRT-SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,间接ELISA法筛选克隆.挑取分泌抗体的杂交瘤株,再用间接ELISA进行鉴定,最终获得抗HCMV的阳性杂交瘤细胞株,用Ouchterlony法鉴定McAb的亚类.小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞,取腹水经盐析法提纯IgG.Lowry法测定蛋白质浓度,在第6代HF细胞株及原代培养新生乳鼠脑神经细胞上进行微量中和实验.结果获得了4株杂交瘤细胞株,制备的F9McAbs盐析后蛋白质浓度为11.2 g/L,血清学试验证明该McAbs能和HCMV抗原进行特异性结合,制备的IgG具有高度特异性.且体外实验已证实,该McAb具有中和抗体的性质.结论通过杂交瘤技术制备的HCMV单克隆抗体能在体外中和HCMV致病变效应,为该McAb作为抗人巨细胞病毒治疗药物的研发奠定了基础.     

载脂蛋白H单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备及鉴定载脂蛋白H Aport单克隆抗体。方法从人血清中分离纯化Aport免疫小鼠后取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选出两株杂交瘤细胞株2C5和3H4，制备腹水后，用硫酸胺沉淀等方法纯化。获得Aport单抗。结果两株细胞产生的单抗皆属于IgG1，与其它载脂蛋白无交叉反应，细胞株连续传代3个月仍能稳定分泌Aport单抗，且效价稳定。结论2C5和3H4两株细胞能分泌合格的Aport单抗。     

重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

目的：制备重组创伤弧菌溶细胞素（recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC）鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素（Vibrio vulnificus cytolysin,VVC）致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a（＋）-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型,ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经ELISA检测,血清有效稀释度达1：12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型。     

抗重组人白细胞介素12单克隆抗体的制备及其生物学特性

以纯化的重组人白细胞介素12（rhIL-12）蛋白为抗原,制备具有生物活性的rhIL-12单克隆抗体（McAb）,并对其特性进行研究鉴定,为肿瘤及免疫相关性疾病的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。方法： 以纯化的rhIL-12p70免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术,用间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及多次克隆化,培养制备杂交瘤细胞系,用clutathione sepharose 4B进行纯化。采用间接ELISA及Western blotting等方法对McAb的Ig亚类（型）腹水效价及特异性进行鉴定。结果：建立了3株持续分泌rhIL-12p70　McAb的杂交瘤细胞株,3株细胞染色体数目均为100条左右,证实为杂交瘤细胞,所分泌的抗体为2株IgG1亚类及1株IgG2a亚类,轻链属k型,小鼠腹水效价测定分别为1∶5.9×106、1∶2.9×10⁷、1∶3.6×10⁷,亲和力依次为EM5>EM6>EV9。结论：成功地制备了3株能稳定分泌抗rhIL-12p70的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高。     

食蟹猴水痘带状疱疹病毒相关抗体研究初探

目的 初步了解食蟹猴猴水痘带状疱疹病毒感染情况.方法 用水痘带状疱疹病毒IgG ELISA试剂盒对经B病毒抗体检测为阴性的中国3个猴场的3岁左右食蟹猴,进行猴水痘带状疱疹病毒(SVV)抗体检测.结果 3个猴场SVV抗体阳性率分别是14.55％,30.95％,27.66％.在血清学测试期间,所有血清阳性的猴没有出现皮疹.结论 猴感染水痘带状疱疹病毒后,会潜伏在神经节,激活后产生带状疱疹症状,这是一种潜在风险,应引起重视.     

分泌载脂蛋白AII单克隆抗体杂交瘤的建立

以人血清载脂蛋白AⅡ为抗原,免疫BALB/C小鼠,将脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养,特异性筛选及克隆化,获得1-C1、2-C2两株分泌抗人血清载脂蛋白AⅡ单克隆抗体杂交瘤细胞株。免疫双扩散确定它们分泌抗体的亚型均为IgG1;吸收试验及ELISA交叉试验表明单克隆抗体的特异性;ELISA测定其培养上清中抗体效价都为1:100,诱生腹水效价分别为1:10000和1:5000;两株杂交瘤细胞染色体均数分别为96.34±6.06、95.01±5.38;采用Protein A Sepharose 4B层析柱纯化了1-C1杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体。