人类14-3-3ζ和GCH1蛋白相互作用的初步研究

目的 寻找人类14-3-3ζ蛋白的相互作用蛋白,为进一步揭示14-3-3ζ的作用机理提供线索.方法 以14-3-3ζ为"诱饵",利用酵母双杂交系统筛选人脑cDNA文库得到"猎物"蛋白,通过GST pulldown技术和哺乳动物细胞内免疫共沉淀技术验证14-3-3ζ和"猎物"蛋白的特异性结合.结果 首次利用酵母双杂交cDNA文库筛选技术发现了14-3-3ζ能够与GTP环化水解酶Ⅰ(GTP cyclohydrolase 1,GCH1)相互作用,并通过了体内和体外的蛋白质结合实验证实了这两个蛋白质之间的特异性相互作用.结论 发现并验证了14-3-3ζ与GCH1之间的蛋白质相互作用,为进一步深入研究这两种蛋白质的功能及所引起的相关疾病的发病机理提供了新的线索.     

信号蛋白质14-3-3研究进展

14 - 3- 3信号蛋白质家族是一组高度保守 ,分布十分广泛的多功能真核生物蛋白质 ,具有 7个亚型 ,与各种信号肽分子包括激酶、磷酸酶、膜转移受体等结合 ,参与细胞内信号传导包括有丝分裂信号转导、细胞周期调节、细胞凋亡等 ,并对朊蛋白病有重要诊断价值     

14-3-3蛋白的研究进展

14-3-3是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族,主要以同源/异源二聚体形式存在,通过磷酸化丝/苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的2个结构域结合。7种不同亚型的高度保守的14-3-3蛋白与人类细胞中多种不同的信号通路有密切的关系。14-3-3通过调节靶蛋白间的相互作用在信号转导途径中发挥调控作用。     

与14-3-3ζ相互作用的蛋白Polo样激酶1的筛选与鉴定

目的:应用酵母双杂交系统筛选与14-3-3ζ相互作用的蛋白,进一步鉴定其与Polo样激酶1(Plk1)相互作用。方法:构建pGBKT7-14-3-3ζ诱饵表达载体,筛选HeLa细胞cDNA文库中与14-3-3ζ相互作用蛋白,进一步通过共转酵母、免疫荧光以及外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验验证两者的相互作用。结果:通过酵母双杂交系统筛选出的阳性相互作用蛋白中包括Plk1,进一步通过共转酵母,外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验证实两者的相互作用,免疫荧光实验证实两者共定位于有丝分裂过程中胞质分裂期的中体。结论:Plk1是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在中体的成熟,有丝分裂期染色体的分离,胞质分裂以及DNA的损伤应答等环节发挥重要作用,其与14-3-3ζ的相互作用为14-3-3蛋白家族参与有丝分裂(M期)的调控提供了直接证据。     

蛋白14-3-3蛋白亚型与癌症

14-3-3蛋白家族在真核细胞中广泛表达且高度保守,据报道其与心血管疾病、神经元损伤、帕金森病以及支气管哮喘等疾病有关联,近年来研究发现14-3-3蛋白与癌症的发生和发展也密切相关,而涉及的癌症包括胆管癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、口腔癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、卡波济肉瘤、脑膜癌、直肠癌、星形细胞瘤等几乎所有常见癌症。14-3-3蛋白对癌症增殖、转移、凋亡以及耐药等影响作用已经得到证实,其调控机制也得到部分揭示,并且已合成了影响14-3-3蛋白与其他蛋白相互作用的特异小分子阻断药物。人体内的14-3-3蛋白家族包含β,ε,γ,η,θ(τ),ζ和σ7种亚型,不同亚型有不同的组织定位和功能。阐明各亚型在不同肿瘤中的分布、作用及其调控机制,对我们进一步认识和治疗癌症均有一定的指导意义。     

14-3-3蛋白在生殖细胞中的作用

14-3-3蛋白是在所有真核细胞中广泛表达的一类高度保守的酸性蛋白家族,主要通过磷酸化依赖的方式与靶蛋白结合从而发挥其调控作用。到目前为止,我们已经发现14-3-3蛋白能与超过300种蛋白质相互作用,几乎参与细胞的所有重要生理、病理过程。14-3-3蛋白在受精卵和卵母细胞中既与通道蛋白、烟碱乙酰胆碱受体相互作用,又参与信号转导、细胞凋亡和细胞周期的调控并且在精子的发生中发挥重要作用。本文主要对14-3-3蛋白在生殖细胞中的可能功能作一简要介绍。     

siRNA干扰14-3-3ζ基因可体外促进人胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的探讨siRNA干扰14-3-3ζ基因对人胃腺癌细胞系SGC-7901增殖凋亡的影响及其作用机制。方法利用siRNA干扰技术降低14-3-3ζ基因的正常表达的SGC-7901细胞为实验组,siRNA-control的对照组和未加处理的空白组。用实时荧光定量PCR和Western blot检测14-3-3ζ基因mRNA的表达水平和蛋白表达水平;CCK8实验检测各组SGC-7901细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Western blot检测周期和凋亡相关蛋白P53、cyclin D1、PUMA、Bax和Bcl-2。结果 siRNA干扰组14-3-3ζ基因的mRNA和蛋白表达水平低于空白组和对照组(P0.05);CCK8检测细胞增殖较对照组显著降低(P0.05);siRNA干扰组细胞周期G0/G1的比率较对照组高,而G2/M和S期则显著降低(P0.05);siRNA干扰组的细胞凋亡率也显著升高(P0.05);相关通路蛋白在siRNA干扰组中cyclin D1和Bcl-2表达降低,P53、PUMA、Bax蛋白表达增高(P0.05)。结论 siRNA干扰14-3-3ζ可以通过P53通路,下调cyclin D1抑制SGC-7901细胞增殖并阻滞周期,上调PUMA、Bax蛋白和下调Bcl-2蛋白促进细胞凋亡。     

大鼠脂肪细胞中14-3-3蛋白与葡萄糖转运子4的相互作用

目的研究在大鼠脂肪细胞中,14-3-3蛋白与葡萄糖转运子4(GLUT4)之间是否存在相互作用。方法用胶原酶I消化雄性SD大鼠附睾上的脂肪垫,获得分离的脂肪细胞。在纯化的细胞中,采用低渗裂解和甘油梯度速率沉降技术获得3个含有GLUT4的组分:T、H和L。用交联了1F8(GLUT4特异性单抗)的琼脂糖微珠对脂肪细胞总提取物以及上述3个组分分别进行免疫吸附实验,经吸附后在上清液和微珠的洗脱液中分别进行14-3-3蛋白和GLUT4的免疫印迹分析。结果在脂肪细胞的总提取物以及上述GLUT4的3个组分T、H和L中,14-3-3蛋白都能够与GLUT4发生免疫共沉淀。共沉淀下来的14-3-3蛋白在免疫印迹分析时显示为2个条带,其相对分子质量分别约为29 ku和60 ku,提示14-3-3蛋白可能以二聚体的形式与GLUT4发生相互作用。结论在生理条件下,14-3-3蛋白与GLUT4在大鼠脂肪细胞中存在相互作用。     

14-3-3γ过表达通过抑制促凋亡分子Bax转位保护多巴胺能细胞对抗MPP~+的毒性作用

目的:探讨14-3-3γ蛋白过表达能否抑制促凋亡分子Bax对抗MPP+对多巴胺能细胞的毒性作用。方法:用腺病毒载体携带人14-3-3γ基因感染PC12细胞,使14-3-3蛋白在细胞中过表达,通过Western Blot检测14-3-3γ、Bax、细胞色素c、caspase 3蛋白质的表达、DAPI染色法检测细胞凋亡、MTT法和自动生化检测法测定细胞活力及LDH酶的活性。结果:14-3-3γ蛋白的过表达能抑制Bax转位到线粒体,抑制LDH的活性(MPP+组41.18±2.71,m14-3-3γ组39.45±3.16,14-3-3γ组13.54±1.82),提高细胞活力(MPP+组49.86±6.27%,m14-3-3γ组52.35±5.59%,14-3-3γ组81.02±5.83%),从而抑制了MPP+诱导的PC12细胞的凋亡(MPP+组49.38±7.31%,m14-3-3γ组46.54±5.49%,14-3-3γ组8.76±3.59%)。结论:14-3-3γ蛋白可以通过对促凋亡分子Bax转位的抑制对抗MPP+对PC12细胞的毒性作用,最终达到细胞保护作用。     

经典型蛋白激酶Cγ及其相互作用蛋白14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元氧-糖剥夺缺血损伤中的作用

目的 探讨经典型蛋白激酶Cγ (cPKCγ)及其相互作用蛋白14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元氧-糖剥夺(OGD)缺血损伤中的作用。方法 利用cPKCγ基因敲除(cPKCγ^-/-)小鼠和原代培养脑皮层神经元1h OGD/24h复糖复氧(R)模拟离体细胞缺血模型,给予14-3-3γ抑制剂R18干扰,采用免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白免疫印迹(Western blotting)和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,验证cPKCγ与14-3-3γ的相互作用及其对原代培养小鼠脑皮层神经元1h OGD/24h R缺血损伤的影响。结果 Co-IP结果证明,14-3-3γ与cPKCγ在小鼠脑皮层中确实存在相互作用;1h OGD/24h R处理使原代培养野生型(cPKCγ ^+/+)小鼠脑皮层神经元内cPKCγ蛋白水平明显降低,而14-3-3γ蛋白水平显著增加(P<0.05,每组n=6);对于原代培养cPKCγ^-/-小鼠脑皮层神经元,尽管14-3-3γ表达水平明显高于cPKCγ^+/+小鼠脑皮层神经元,但1h OGD/24h R处理却使14-3-3γ表达水平显著降低(P<0.05, 每组n=6),提示cPKCγ可影响神经元内14-3-3γ的表达水平。此外,MTT结果表明,14-3-3γ抑制剂R18 (100μmol/L)可显著加重1h OGD/24h R处理原代培养cPKCγ^-/-和cPKCγ^+/+小鼠脑皮层神经元的缺血损伤(P<0.05,每组n=6)。结论 cPKCγ与14-3-3γ在小鼠脑皮层神经元内存在相互作用并影响14-3-3γ的蛋白表达水平,cPKCγ和14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元缺血/低氧损伤中起保护作用。     

14-3-3γ对烧伤及LPS诱导所致大鼠心肌损伤的保护作用

目的: 研究14-3-3γ在烧伤及脂多糖(LPS)引起的心肌损伤中的保护作用。方法: 体内实验建立大鼠烧伤及LPS损伤模型,检测3、6、12、24 h各时点心功能及心肌细胞14-3-3γ蛋白表达水平的改变;体外实验采用新生大鼠心肌细胞,构建pFLAG-14-3-3γ质粒,于LPS损伤前24 h转染至心肌细胞,实验结束后检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH) 活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔(mPTP)开放。结果: 烧伤及LPS损伤模型大鼠心电图ST段均有明显改变,心肌细胞14-3-3γ蛋白表达水平均显著升高。转染了pFLAG-14-3-3γ质粒的心肌细胞能明显对抗随后的LPS损伤,与未转染组比较,14-3-3γ能明显提高细胞存活率,降低LDH活性,减少细胞凋亡,抑制mPTP的开放。结论: 14-3-3γ可能通过抑制mPTP的开放对烧伤及LPS所致的心肌损伤起保护作用。     

吲哚-3-甲醇酸性代谢产物辐射防护作用的研究

目的 探讨吲哚-3-甲醇(I3C)酸性代谢产物的辐射损伤防护作用.方法 采用细胞克隆形成实验检测细胞的存活分数;采用Western Blot方法检测蛋白表达水平.结果 采用正常纤维上皮细胞184A1,发现7种I3C酸性代谢产物表现出不同的辐射损伤防护效果,其中CTET(1μmol/L)、LTET(1μmol/L)、HI-IM(1 μmol/L)和3,3'-二吲哚甲烷(DIM)(0.3 μmol/L)4种代谢产物在细胞γ-射线照射前24 h预处理细胞均不同程度地提高了辐照细胞的存活分数,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),而CT(1μmol/L)、LTr-1(1 μmol/L)和ICZ(1μmol/L)3种代谢产物则对辐照细胞存活分数无影响(P＞0.05).进一步研究发现CTET、LTET、HI-IM和DIM可导致ATM、BRCA1和NBS1蛋白磷酸化水平的改变.同样,CT、LTr-1和ICZ对这些蛋白的磷酸化水平不产生影响.另外,HI-IM可明显降低辐射损伤诱导的细胞坏死和细胞凋亡.结论 CTET、LTET、HI-IM和DIM 4种I3C酸性代谢产物可明显降低184A1细胞的辐射敏感性,即具有辐射防护作用,其机制可能与其调节DNA损伤与修复蛋白磷酸化和细胞凋亡有关.     

人参皂甙Rb1抑制1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶所致的内质网应激对多巴胺能神经元的保护作用

目的:研究内质网应激反应在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)小鼠模型黑质区多巴胺能神经元凋亡的作用.方法:将小鼠随机分为MPTP模型组、Rb1干预剂组和对照组.观察行为学,免疫组织化学和免疫蛋白印迹法观察黑质酪氨酸羟化酶(TH)、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、半胱氨酸蛋白酶-12 (caspase-12)和半胱氨酸蛋白酶-3 (caspase-3)的表达.结果:与对照组相比,模型组小鼠出现典型PD症状,TH阳性神经元明显丢失、蛋白水平下降,GRP78、caspase-12、caspase-3阳性细胞及蛋白水平增加;经人参皂甙Rb1处理后,上述变化均减轻.结论:内质网应激(ERS)在MPTP诱导的PD小鼠模型多巴胺能神经元凋亡中可起重要作用,人参皂甙Rb1可通过抑制ERS而对PD小鼠具有一定的神经保护作用.     

双氢青蒿素诱导人前列腺癌细胞系PC-3凋亡

目的探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对人前列腺癌细胞系PC-3的凋亡诱导作用,并探讨其可能机制。方法人前列腺癌PC-3细胞经不同浓度(0、25、50和100μmol/L)DHA处理48 h,用FCM法检测各组细胞凋亡率。用荧光定量PCR检测细胞中HSP70 mRNA的表达。用蛋白质印迹法检测细胞中HSP70蛋白、凋亡酶激活因子(Apaf-1)及caspase-3的表达;荧光定量PCR及蛋白质印迹法增加两组,即100μmol/L HSP70抑制剂槲皮素(quercetin)作为阳性药物对照组,以DMSO作为溶剂对照组。结果 DHA能明显诱导PC-3细胞凋亡(P0.05)。不同浓度DHA能明显下调HSP70 mRNA及蛋白表达水平(P0.05),上调Apaf-1及caspase-3蛋白表达水平(P0.05)。结论双氢青蒿素能诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡,其作用机制可能是DHA干扰HSP70的表达,促进caspase信号通路中Apaf-1及caspase-3表达。     

过表达miR-5195-3p对结直肠癌细胞凋亡的影响

目的探讨miR-5195-3p对Runx相关转录因子3(RUNX3)的靶向调节作用及对结直肠癌细胞凋亡的影响。方法 RT-qPCR和Western blot分别检测结直肠癌组织与癌旁组织中miR-5195-3p和RUNX3蛋白的表达。将人结肠癌细胞系SW480随机分为5组:对照组(control)、miR-5195-3p mimic组、mimic control组、miR-5195-3p inhibitor组、inhibitor control组。Wetsern blot检测RUNX3的蛋白表达;流式细胞仪检测细胞凋亡。在SW480细胞中转染RUNX3过表达质粒后检测细胞凋亡。结果与癌旁组织中相比,miR-5195-3p在结直肠癌组织中的表达显著升高,RUNX3的蛋白表达明显降低(P0.05)。过表达miR-5195-3p显著下调了SW480细胞中RUNX3的表达,并降低细胞凋亡水平(P0.05);抑制miR-5195-3p明显上调RUNX3的表达,并上调细胞凋亡水平(P0.05)。此外与miR-5195-3p mimic组相比,RUNX3过表达质粒的共转染组显著降低细胞凋亡水平(P0.05)。结论 miR-5195-3p可能作为促癌基因在结直肠癌中发挥作用,其作用与靶向调节RUNX3相关。     

酵母中与α1-肾上腺素受体C末端相互作用的蛋白质

α1-肾上腺素受体 (α1-AR)在交感神经系统调节心血管生理功能过程中具有非常重要的作用。α1-AR 3种亚型由不同的基因编码 ,它们在蛋白结构、G蛋白偶联、组织分布、信号转导、受体调节以及生理功能方面都有所不同。目前已经清楚 ,α1-AR 3种亚型在它们的跨膜区的序列同源性高达 70 % ,其胞桨C末端却几乎没有相似的序列。最近 ,文献报道发现有蛋白质可以直接与β -肾上腺素受体C末端结合并调节受体的功能。但α1A-AR与非G蛋白质相互作用的研究尚鲜有报道。目的 :寻找与α1-AR相互作用的蛋白质 ,为研究α1-AR的信号转导机制提供新的线…     

内质网应激介导糖原合成酶激酶-3β促进肝细胞凋亡

目的 探讨细胞内信号分子GSK3β在内质网应激(ERS)诱导肝细胞凋亡中的作用.方法 以小鼠肝癌细胞株Hepa 1细胞为研究对象,化学药物衣霉素(20 μg/ml)为ERS诱导剂,建立肝细胞凋亡模型.化学药物SB216763特异性抑制GSK3β活性,在衣霉素诱导细胞凋亡前1h给予干预处理.乙酰氧基甲酯(AM)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)对活细胞/凋亡细胞进行检测;再利用培养细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)的检测评价细胞死亡情况;Western blot检测p-GSK3β蛋白、ERS相关凋亡蛋白GRP78、CHOP、caspase-12以及caspase-3、cleaved caspase-3蛋白的表达.结果 研究表明,衣霉素诱导的ERS促进GSK3β活性升高;抑制GSK3β活性缓解了衣霉素诱导的ERS:GRP78、CHOP和caspase-12的表达被抑制;与此同时抑制GSK3β活性显著减轻了ERS诱导的Hepa 1细胞凋亡.与ERS诱导Hepa 1凋亡模型组相比,SB216763干预组PI染色的凋亡细胞显著减少,培养细胞上清中的LDH显著下降;此外,Western blot结果显示GSK3β活性抑制减少了cleaved caspase-3活性蛋白的表达.结论 GSK3β是ERS诱导细胞凋亡通路中的一种重要信号分子,抑制GSK3β活性通过减轻ERS而改善肝细胞凋亡.     

小鼠脑14-3-3蛋白ζ亚型cDNA克隆及其原核表达分析

14-3-3是一类脑中丰富存在的蛋白质。在许多神经疾病患者的脑脊液中含量升高。最近的研究显示该蛋白相关于Parkinson病的病理过程。本研究采用RT-PCR法从小鼠脑中分离出编码14-3-3ζ亚型的cDNA片段,构建了基因重组质粒,分析了14-3-3ζ亚型cDNA在原核细胞中的表达并制备了基因重组蛋白。结果显示,RT-PCR扩增产物为738bp,编码245个氨基酸。重组质粒在原核细胞中的表达受IPTG诱导呈时间依赖性递增。纯化的目的蛋白在SDS-PAGE中的表观分子量为32kD,在Su-perdexS-200HR中的表观分子量为96kD。每升菌液可收获目的蛋白4.0mg。研究结果提示,14-3-3ζ亚型cDNA在原核细胞中高水平表达,基因重组蛋白易纯化可用于制备抗体和研究其生理功能。     

3-甲基腺嘌呤对喜树碱诱导的宫颈癌Hela 细胞凋亡的影响

目的:本研究探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对喜树碱(Camptothecin,CPT)诱导的Hela 细胞凋亡的影响。方法:用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT 方法)检测CPT 对Hela 细胞作用的最佳药物浓度和时间,以及不同药物对Hela 细胞增殖活性的影响;用免疫印迹及免疫荧光检测不同药物作用于Hela 细胞后,Hela 细胞自噬标志蛋白微管相关蛋白1 轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62 及凋亡相关蛋白的变化;DAPI 核染色观察细胞凋亡。结果:CPT 作用于Hela 细胞后,Hela 细胞增殖活性明显下降,并且可诱导自噬现象的发生。CPT 和3-MA 联合作用较单独CPT 作用Hela 细胞的增殖活性降低,细胞自噬水平下降,凋亡率明显升高。结论:CPT 在诱导Hela 细胞凋亡的同时可诱导自噬,通过3-MA 抑制自噬可增强Hela 细胞对CPT 作用的敏感性。     

14-3-3tau蛋白通过ERK信号通路调控BeWo细胞的侵袭功能

目的:探讨14-3-3tau蛋白对滋养细胞侵袭功能的影响及可能机制。方法:免疫组化法检测人早孕期绒毛、蜕膜以及人绒癌滋养细胞株BeWo中14-3-3tau的表达。RNA干扰方法下调BeWo细胞14-3-3tau的表达,RT-PCR和Western blotting方法检测E钙黏附素及转录因子snail的表达变化,Transwell小室方法检测侵袭细胞数目的变化。用U0126特异性阻断胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号通路,观察下调14-3-3tau对BeWo细胞侵袭能力的变化。结果:(1)14-3-3tau在早孕期绒毛外细胞滋养细胞和侵袭入蜕膜组织的游离型滋养细胞以及BeWo细胞中均有表达。(2)下调BeWo细胞14-3-3tau表达后,E钙黏附素表达下降,Snail表达增加,穿过Transwell小室的细胞数增加(P0.05)。(3)U0126阻断14-3-3tau下调引起的BeWo细胞侵袭增加(P0.05)。结论:14-3-3tau通过ERK1/2信号通路抑制滋养细胞的侵袭能力。