CD137信号对CIK细胞增殖和功能的调节作用

目的:探讨CD137信号对CIK细胞的增殖和功能调节作用.方法:分离健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs),实验组在常规CIK培养体系中加入CD137单抗(CD137-CIK组),对照组在常规CIK培养体系中加入鼠IgG1同型对照(IgG1-CIK组).苔盼蓝拒染法细胞计数分析细胞增殖;流式细胞术检测细胞表型及细胞内因子的表达;LDH酶释放法检测CIK细胞杀伤活性.结果:CD137-CIK组细胞体外扩增效率显著高于IgG1-CIK组,CD137-CIK组细胞浓度最高达(9.87±0.57)×106/ml;IgG1-CIK组最高为(7.02±0.68)×106/ml;CD137-CIK组和IgG1-CIK组细胞中CD3 CD56 细胞比例至28天分别达到(39.86±4.69)%和(29.14±5.12)%(P＜0.05);经CD137mAb作用后,其体外杀伤肺癌细胞株A549活性明显高于对照组(P＜0.05);第0、7、14、21天流式检测IFN-γ表达,实验组CD3 CD56 细胞IFN-γ的表达显著高于对照组.结论:CD137mAb介导的共刺激信号可以促进CIK细胞的体外增殖活性,并增强CIK细胞体外抗瘤作用.其中CD137-CIK组CD3 CD56 细胞的比例及其IFN-γ表达显著提高,这可能是CD137信号增强CIK抗瘤作用的重要原因.     

CD69在人外周血活化的γδT细胞表面的表达

目的:观察CD69在人外周血γδT细胞表面的表达及与γδT细胞活化的关系.方法:抗CD3单克隆抗体及结核杆菌低分子多肽刺激人外周血单个核细胞(PBMC)及纯化的T细胞,流式细胞仪检测不同时相γδT细胞表面CD69分子的表达率.结果:抗CD3单抗、Mtb抗原刺激PBMC后3h,γδT细胞表面即表达CD69,24h达高峰;单独抗CD3或Mtb抗原刺激纯化的T细胞,CD69分子表达升高不明显,加入激发型抗CD28单抗作为第二信号,CD69表达率明显升高.结论:CD69分子在活化的γδT细胞表面高表达,可作为γδT细胞完全活化的一个指标.     

内皮细胞表达CD137分子介导对T细胞的抑制效应

目的研究内皮细胞表达的CD137分子与活化的T细胞表达的CD137L交联后对T细胞的刺激效应.方法将活化的内皮细胞与活化的T细胞共培养,ELISA检测共培养上清中IL-2、IL-10和IFN-γ的含量;流式细胞仪检测内皮细胞表面标志分子CD25、CD69的表达变化;CCK-8试剂盒检测T细胞存活率,并观察用融合蛋白抗-CD137阻断CD137-CD137L共刺激通路后T细胞分泌细胞因子的变化.结果采用细胞共培养后,T细胞分泌IL-2、IL-10和IFN-γ的水平下降,而且CD25、CD69的表达水平降低,T细胞存活率下降,应用抗-CD137单克隆抗体阻断CD137-CD137L相互作用后,IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌水平升高,CD25、CD69的表达上调,T细胞存活率上升.结论活化的内皮细胞诱导表达CD137蛋白分子与活化的T细胞上诱导表达的CD137L相互作用,通过CD137L向T细胞内传递抑制信号,抑制了T细胞合成和分泌细胞因子的功能.表明CD137-CD137L信号通路在内皮细胞与T细胞的信号作用中有着重要的地位.     

曲古抑菌素A抑制小鼠CD4+T细胞活化的机制

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对小鼠脾脏CD4+T细胞相关分子的基因转录和表达以及对活化信号转导途径的影响,探讨TSA影响CD4+T细胞活化的作用机制。方法采用2、20、200 nmol/L倍比浓度TSA作用于C57BL小鼠脾脏中分离出的CD4+T细胞24 h,观察对CD3,CD28以及IL-2基因转录和表达的影响;观察TSA对采用抗CD3,CD28单抗激活CD4+T细胞表达蛋白酶ZAP70和PI3K的影响。结果 TSA能抑制CD4+T细胞CD28基因转录和分子表达,且与作用浓度相关;能抑制抗体激活的小鼠CD4+T细胞表达PI3K蛋白,而对CD3分子活化信号下游的ZAP70蛋白的表达无明显影响;TSA还能抑制CD4+T细胞IL-2的基因转录和显著减少激活的CD4+T细胞表达IL-2(P<0.01)。结论 TSA通过抑制CD28基因转录和分子表达,影响激活CD4+T细胞活化过程中共刺激信号向细胞内的传导,减少IL-2的分泌,从而降低CD4+T细胞的免疫活性。     

系统性红斑狼疮患者外周血CD137及其配体表达的变化

目的 探讨T细胞亚群表面协同刺激分子CD137及其在单核细胞表面的配体CD137L表达与系统性红斑狼疮（SLE）发病机制的关系。方法 采用流式细胞仪检测技术对SLE患者和正常人外周血T细胞亚群表面CD137及单核细胞表面CD137L的表达进行分析。 结果 与正常人相比,SLE患者CD4＋T细胞和CD8＋T细胞表达共刺激分子CD137增高,单核细胞表达共刺激分子CD137L增加;SLE患者外周血CD4＋T细胞表达的CD137与24 h尿蛋白定量、球蛋白、SLE病情活动指数(SLEDAI)呈正相关性,与C3呈负相关性;CD8＋T细胞表达的CD137的与24 h尿蛋白定量、SLEDAI呈正相关性。结论 共刺激分子CD137和CD137L表达异常在SLE发病机制中可能有重要作用。     

CD137信号下调乳腺癌患者外周血Treg细胞的免疫抑制功能

目的探讨CD137信号对CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）的生物学效应及机制。方法采用激发型抗人CD137单抗加入PHA刺激的乳腺癌患者外周血T细胞培养体系及Treg细胞培养体系中,利用细胞计数及^3H-TdR掺入法分析T细胞的增殖,流式细胞术分析细胞膜分子和Foxp3表达,ELISA分析细胞因子的分泌。结果CD137分子表达于乳腺癌患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞膜;抗人CD137单抗加入PHA活化的乳腺癌患者T细胞培养体系后,T细胞增殖明显增加,Foxp3^＋Treg细胞比例明显下降;激发CD137信号可下调CD4^＋CD25^＋Treg细胞的Foxp3表达,抑制Treg细胞产生TGF-β1和IL-10,以及下调Treg细胞对PHA刺激的CD4^＋CD25^-T细胞增殖的抑制效应。结论CD137信号可抑制Treg细胞的免疫抑制功能,CD137可能是对Treg细胞进行免疫干预的重要靶点。     

熊果酸对刀豆蛋白A诱导小鼠T细胞增殖与激活的影响

目的研究熊果酸(Ursolic acid,UA)对小鼠T细胞活化和增殖的影响,并探讨其免疫调节机制。方法以刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠T细胞活化和增殖,用MTT法测定细胞增殖,利用流式细胞术检测T细胞早期活化标志CD69、中期活化标志CD25与晚期活化标志CD71的表达情况。结果在ConA刺激下48 h后,小鼠T淋巴细胞MTT吸收度显著高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。熊果酸(10～40μM)组与ConA组比较显著降低了MTT吸收度,差异具有统计学意义(P<0.01)。在ConA刺激淋巴细胞18 h后,小鼠T细胞CD3 CD69 表达率显著高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),ConA刺激36 h后,T细胞CD3 CD25 表达率显著高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),ConA刺激48 h后,T细胞CD3 CD71 显著高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。熊果酸组在浓度为10～40μM时与ConA组比较,均能显著降低CD25、CD69、CD71的表达率,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论熊果酸可以显著的抑制多克隆刺激剂ConA介导的小鼠T细胞的活化和增殖。     

共刺激分子CD28单克隆抗体制备的新策略

目的 发展一种制备抗人CD28单克隆抗体的新方法。方法 构建编码人CD28基因的逆转录病毒表达系统,感染BALB／c小鼠骨髓瘤细胞NS－1,使其细胞膜表达CD28抗原并用于免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果 获得分泌抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为E66－3S,IgG亚类鉴定为IgG1。该株单抗能够特异性识别CD28阳性的T细胞,并完全阻断标准CD28抗体与细胞表面CD28抗原结合。在亚剂量分裂原的共刺激下,具有促进T淋巴细胞活化和增殖作用。结论 E66－3S具有高度特异性和共刺激活性,为临床免疫治疗奠定了基础,同时,也为进一步制备其它膜抗原的单克隆抗体提供了一种新途径。     

原发性肾病综合征患者外周血共刺激分子CD28的表达及其临床意义

目的研究原发性肾病综合征(PNS)患者外周血共刺激分子CD28的表达变化特点,以及这种变化与激素敏感性的关系,探讨其在PNS免疫发病机制中的作用。方法采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析方法,对32例PNS患者外周血T细胞亚群和共刺激分子CD28的表达进行研究。结果(1)肾病综合征发作组(包括激素有效组和无效组)共刺激分子CD28表达明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.001),并且CD4 CD28 T细胞和CD8 CD28 T细胞均明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)激素有效组尿蛋白转阴后CD28分子水平明显上升,且CD4 CD28 T细胞和CD8 CD28 T细胞均较治疗前明显上升,差异有统计学意义(P<0.01);而激素无效组上述三个指标在激素治疗前后的变化无统计学意义(P>0.05)。(3)不完全缓解组和持续缓解组CD28 T细胞、CD4 CD28 T细胞和CD8 CD28 T细胞均恢复至正常对照组水平。(4)首发和复发患者之间共刺激分子CD28、CD4 CD28 T细胞和CD8 CD28 T细胞之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论PNS患者外周血T细胞活化所必需的共刺激分子CD28异常表达可能在PNS发生和病变进展中起着重要作用;糖皮质激素可使PNS患者外周血CD28异常表达被逐渐纠正,可能是其治疗肾病综合征的机制之一。     

Graves’病患者外周血T细胞表面膜型CD28及血清中可溶性CD28的表达及其意义

目的分析Graves′病(Graves′disease,GD)患者外周血T细胞表面膜型CD28及血清中可溶性CD28的表达水平,探讨CD28分子在GD免疫病理机制中的作用。方法选取105例GD患者为试验组,67例健康者为对照组,通过溶血及流式细胞术检测所有受试对象外周血T细胞表面膜型CD28的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中可溶性CD28的含量。结果试验组外周血CD4+CD28+T细胞为(23.367±8.562)%,CD8+CD28+T细胞为(10.156±3.114)%,较对照组[分别为(30.786±5.143)%和(17.200±3.624)%]显著减少(P<0.0.5、P<0.0.1),血清中可溶性CD28水平观察组[(2.35±0.58)μg/L]较对照组[(0.53±0.23)μg/L]显著增加(P<0.01)。结论共刺激分子CD28很有可能参与了GD的免疫病理机制。     

冠心病患者外周血CD4+CD28-T细胞和CD4+CD25+T细胞亚群变化

目的 探讨冠心病患者外周血CD4 CD28-T细胞和CD4 CD25 调节性T细胞(Treg)亚组的变化及意义.方法 入选病例为我院从2005年6月到2005年12月共28例行冠状动脉支架术治疗的冠心病患者(不稳定性心绞痛16例、稳定性心绞痛12例),以同时冠脉造影正常11例胸痛综合症患者为对照.借助三色荧光标记技术对外周血CD4 CD28-T细胞和CD4 CD25 Treg占CD4 T细胞比例进行流式细胞术测定.结果 不稳定性心绞痛患者外周血Treg/CD4 T细胞比例[(6.55±2.45)%]显著低于稳定性心绞痛组[(14.01±4.92)%]和胸痛综合征组[(13.55±3.87)%](P＜0.05),而CD4 CD28-/CD4 T细胞比例[(10.55±4.76)%]则明显高于稳定性心绞痛组[(2.64±1.33)%]和胸痛综合征组[(2.75±1.55)%](P＜0.05).结论 不稳定性心绞痛患者外周血Treg比例减少而CD4 CD28-T细胞比例升高,Treg比例降低可能使外周免疫耐受失去平衡,参与了动脉粥样硬化的发生发展.     

共刺激分子CD28单克隆抗体制备的新策略

目的发展一种制备抗人ＣＤ２８单克隆抗体的新方法。方法构建编码人ＣＤ２８基因的逆转录病毒表达系统,感染 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－ｌ,使其细胞膜表达ＣＤ２８抗原并用于免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果获得分泌抗人 ＣＤ２８单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为Ｅ６６－３Ｓ,ＩｇＧ亚类鉴定为ＩｇＧ１。该株单抗能够特异性识别ＣＤ２８阳性的Ｔ细 胞,并完全阻断标准ＣＤ２８抗体与细胞表面ＣＤ２８抗原结合。在亚剂量分裂原的共刺激下,具有促进Ｔ淋巴细胞活化和 增殖作用。结论Ｅ６６－３Ｓ具有高度特异性和共刺激活性,为临床免疫治疗奠定了基础,同时,也为进一步制备其它膜抗 原的单克隆抗体提供了一种新途径．     

Research on the effects of CD137 signaling on the function of CD3-CD56+NK cells

Objective:To investigate the effects of CD137 signaling on the regulation of CD3-CD56+NK cells function. Methods: CD3-CD56+NK cells were treated with CD137 mAb or mouse IgG1 isotype control to study the effects of CD137 signaling on the function of CD3-CD56+NK cells. Cytotoxicity was measured by LDH activity in the supernatants of cell cultures; NKG2D and LFA-1 expression on CD3-CD56+NK cells were analyzed by flow cytometry. Results: CD137 was expressed on activated CD3-CD56+NK cells. The CD137 mAb enhanced...     

CD28单克隆抗体对病毒性心肌炎小鼠的治疗作用

目的探讨CD28单克隆抗体（CD28 mAb）对柯萨奇病毒B3（CVB3）病毒性心肌炎（VMC）小鼠的死亡率、心肌病理改变及病毒滴度的影响。方法随机将106只BALB/c小鼠分为CD28 mAb组16只、病毒组40只、IgG组40只及正常对照组10只,腹腔注射半数组织感染量(TCID50 )为10-6/mL的柯萨奇B3病毒0.15?mL,正常对照组接种0.15?mL?的Eagle氏液。CD28 mAb组、IgG组接种病毒后6、72?h分别接种CD28 mAb(0.1?mg/kg)和IgG(0.1mg/kg)。于接种病毒后第7天处死所有小鼠,取心脏,在光镜下观察心肌病理变化,采用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）检测心肌组织中CVB3mRNA的表达。结果CD28单克隆抗体组小鼠死亡率、心肌病理积分、心肌CVB3mRNA均低于病毒对照组(P均＜0.05)。结论CD28单克隆抗体可降低心肌病毒滴度,减轻VMC小鼠心肌炎症,降低VMC小鼠死亡率。     

慢性粒细胞白血病患者PBMCs中CD4+CD25+细胞体外增殖及对CD4+CD25-细胞增殖的影响

目的 探讨慢性粒细胞白血病(CML)患者外周血单个核细胞(PBMCs)来源的CD4 CD25 细胞体外增殖及对CD4 CD25-细胞增殖的影响.方法 以免疫磁性分离方法(MACS)分选出CML患者外周单个核细胞中的CD4 CD25 及CD4 CD25-细胞后,用流式细胞仪分析细胞的纯度及活力;再以小鼠抗人CD3单抗、小鼠抗人CD28单抗及rh IL-2作为刺激因子,CD4 CD25 细胞与CD4 CD25-细胞共培养,观察CD4 CD25 细胞对CD4 D25-细胞增殖的抑制效应.结果 (1)分选后健康对照组及CML患者PBMC中CD4 CD25 细胞纯度分别为(84.93±2.55)%、(86.32±2.40)%,两者相比,无显著差异(P＞0.05);(2)经MACS分选后正常对照组与CML患者CD4 CD25 细胞活力分别为(98.12±0.68)%、(97.33±0.78)%,两者相比,无显著差异(P＞0.05);(3)无论是健康对照还是CML患者的CD4 CD25 细胞均具有明显抑制效应性细胞如CD4 CD25-细胞的增殖,随着CD4 CD25 细胞数的增加,这种抑制增殖的能力也相应增加,当CD4 CD25 T:CD4 CD25-T为1:1时,抑制率最大.结论 MACS分选法能够分选出高纯度及高活力的CD4 CD25 细胞,分选后CD4 CD25 细胞在体外均能抑制CD4 CD25-细胞增殖,且这种抑制效应呈一定效靶比关系.     

CD28、CD40通路共刺激对淋巴细胞增殖反应的影响及CsA的抑制作用

目的：探讨CD28、CD40通路共刺激后淋巴细胞增殖反应的变化及免疫抑制剂环孢素A(CsA)、抗CTLA4单克隆抗体对共刺激通路激活后淋巴细胞增殖反应的影响。方法：采用单克隆抗体与淋巴细胞表面CD3、CD28及CD40L分子结合产生相应刺激信号,根据刺激条件不同设组为：①抗CD3单抗单刺激(A组)(剂量为10μg／L、100μg／L、1000μg,／L);②抗CD3单抗 抗CD28单抗(B组);③抗CD3单抗 抗CD40L单抗(C组);④抗CD3单抗 抗CTLA4单抗(D组)共刺激(A、B、C、D组中抗CD3单抗剂量固定为100μg／L,其余3种单抗各设10μg／L、100μg／L、1000μg／L3种剂量);⑤抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CD40L单抗(E组);⑥抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CTLA4单抗(F组)共刺激(E、F组中抗CD3单抗和抗CD28单抗的剂量固定为100μg／L,抗CD40L单抗和抗CTLA4单抗的剂量各设10μg／L、100μg／L、1000μg／L);⑦CsA干预组：抗CD3单抗 CsA(G组);⑧抗CD3单抗 抗CD28单抗 CsA(H组);⑨抗CD3单抗 抗CD28单抗 抗CD40L单抗 CsA(I组),G、H、I组中所有单抗浓度均固定为100μg／L,CsA浓度设为10μg／L、100μg／L、1000μg／L。采用[^3H]-TdR同位素掺人法测定淋巴细胞增殖水平,液体闪烁计数仪测定放射性计数值。结果：用抗CD3单抗 抗CD28单抗共刺激后,淋巴细胞增殖反应明显高于抗CD3单刺激,而在抗CD3单抗 抗CD40L单抗刺激组,淋巴细胞增殖反应低于抗CD3单刺激组。抗CTLA4单抗所提供的刺激信号可抑制抗CD3单刺激及抗CD3 抗CD28共刺激导致的淋巴细胞增殖反应,并且随着抗CTLA4单抗剂量的增加,抑制作用增强。CsA对共刺激后的淋巴细胞增殖反应有抑制作用,且随着剂量增大其抑制作用也增强,但对单刺激后增殖反应的抑制作用更为明显。结论：CD28共刺激通路在淋巴细胞活化中起着关键作用。抗CD40L单抗的刺激作用可能被其对T细胞与抗原递呈细胞(APC,包括B细胞等)间的阻断效应所掩盖。抗CTLA4单抗及CsA对共刺激后淋巴细胞的增殖反应均有抑制作用。     

共刺激分子CD28/CTLA-4:B7在强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞中的表达

目的 探讨CD28、CTLA-4（CD152）、B7—1（CD80）及B7—2（CD86）共刺激分子在强直性脊柱炎（AS）患者的外周血淋巴细胞上的表达异常与免疫功能紊乱的关系。方法 采用流式细胞仪检测69例AS患者和50例健康对照者CD28和CTLA-4在外周血CD3^＋、CD4^＋T和CD3^＋、CD8^＋T细胞上的表达及CD80和CD86在CD19^＋B细胞上的表达。用ELISA法测定血清中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM的水平。结果 AS患者CD3^＋、CD4^＋T和CD3^＋、CD8^＋T细胞上的CD28和CTLA-4，CD19^＋B细胞上CD80和CD86的表达较正常对照组显著增高（P〈0．05）；AS患者血清中2种免疫球蛋白IgG、IgA的水平较正常对照组显著增高（P〈0．01）。结论 AS患者T细胞上表达过量的CD28，与B细胞的B7结合，激活T、B细胞，产生大量免疫球蛋白，同时刺激激活的T细胞表达CTLA-4，使T细胞不能充分表现效应功能。     

类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞凋亡及其相关信号蛋白表达的检测和临床意义

目的探讨CD4~＋T细胞凋亡在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）发病机制中的作用及其凋亡机制。方法应用流式细胞术分析类风湿关节炎患者及健康对照组外周血CD4~＋T细胞凋亡指标AnnexinV水平及凋亡相关信号蛋白Caspase-3,Caspase-8,促凋亡基因Fas和抑凋亡基因Bcl-2表达水平;同时对CD4~＋T细胞凋亡相关信号蛋白ESR、RF和DAS 28水平与临床活动相关指标进行相关性分析。结果与健康对照组相比,RA活动期患者CD4~＋T细胞数增加[（40.91±2.73）%vs（31.40±2.71）%,P〈0.05],CD4~＋T cell凋亡指标AnnexinV水平减少[（2.27±1.43）%vs（8.10±2.06）%,P〈0.05];RA患者外周血中CD4~＋T细胞促凋亡基因Fas表达较健康对照组降低差异无统计学意义[（63.12±4.61）%vs（84.13±1.72）%,P〈0.01],抑凋亡基因Bcl-2表达增加[（93.58±2.36）%vs（75.14±5.70）%,P〈0.05],Caspase-8减少[（18.54±15.23）%vs（3.02±1.39）%,P〈0.05],Caspase-3表达无差异无统计学意义[（2.17±1.19）%vs（2.53±1.46）%,P〉0.05];CD4~＋T细胞促凋亡基因Fas表达与DAS28评分呈负相关（r=-0.89,P=0.04,P〈0.05）,Bcl-2与DAS28评分呈正相关（r=-0.97,P=0.00,P〈0.01）。结论RA患者CD4~＋T细胞数量增多与其凋亡减少有关,这可能是导致该病自身免疫反应不能控制的重要原因之一。RA患者外周血CD4~＋T细胞凋亡减少与促凋亡基因Fas表达降低、凋亡相关蛋白Caspase-8表达下降及抑凋亡基因Bcl-2表达增高有关。Fas和Bcl-2的表达可作为评价临床活动性的敏感指标。     

同种异体NK细胞对CD34+早期急性髓系白血病细胞的细胞毒效应

目的 探讨同种异体NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞的细胞毒效应.方法 免疫磁珠法分离5例健康个体NK细胞,乳酸脱氢酶释放法测定不同效靶比时NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞KG1a的杀伤活性,甲基纤维素克隆形成实验检测NK细胞对KG1a细胞的克隆形成抑制率,同时与NK杀伤敏感细胞株K562比较.结果 急性髓系白血病细胞株KG1a中CD34抗原表达率为(98.0±1.1)%,分选后的NK细胞(CD3CDl6 CD56 细胞)纯度为(93.2±3.7)%.不同效靶比时NK细胞对KG1a细胞均有杀伤活性,均能抑制其克隆形成.随着效靶比的增高,其杀伤活性和克隆抑制率随之增高(P＜0.05).同一效靶比时,NK细胞对KG1a的杀伤活性和克隆抑制率低于K562(P＜0.05).结论 同种异体NK细胞对CD34 早期急性髓系白血病细胞具有细胞毒效应.