高级糖基化终末产物与糖尿病视网膜病变的关系

高级糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)的堆积是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)主要的致病因素,其可促进视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞AGE受体(receptor of AGE,RAGE)的表达、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的分泌及细胞凋亡损伤.RPE细胞参与构成视网膜的外屏障,具有屏障、滤过、吞噬和分泌等作用,在维持视网膜正常生理功能方面具有重要作用,RPE细胞的功能损害会导致多种视网膜疾病.通过研究AGE对RPE细胞的损伤,探讨AGE在DR发生发展中的作用,有利于寻找有效防治DR的新途径.     

氧化损伤对视网膜色素上皮细胞中基质金属蛋白酶表达的影响

目的探讨氧化损伤对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞金属蛋白酶(MMP-2,9)及其组织抑制剂(TIMP-1)表达的影响。方法将不同浓度的H2O2处理传代的细胞，检测活力后，采用明胶酶谱法和RT—PCR技术定量分析RPE细胞中MMP-2，9的蛋白水平和mRNA含量。采用RT—PCR和ELISA分别测定TIMP-1的mRNA表达和培养液中的浓度。结果不同浓度H2O2对RPE细胞增殖没有影响，MMP-2均呈高表达，但mRNA和蛋白均没有变化；MMP-9表达相对弱，且随着H2O2浓度的升高而增强，ELISA法检测不同浓度H2O2处理的RPE细胞培养液中TIMP-1浓度无显著差别。结论不同H2O2浓度下MMP-2、TIMP表达无明显差异，MMP-9随着H2O2浓度增加表达增强，表明糖尿病视网膜病变中存在的氧化损伤导致MMP-9表达升高。     

高级糖基化终末产物对人视网膜色素上皮细胞的作用机制研究

目的 探讨高级糖基化终末产物(AGEs)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞的作用机制.方法 原代培养人RPE细胞,在传代细胞生长状态良好的情况下,无血清的Dulbecco改良Eagle培养基同步化24 h,进行分组:(1)C组:BSA浓度为0.1 g/L,各作用24、48 h,分别为C1、C2组;(2)NC组:葡萄糖浓度为5.6 mmol/L,各作用24、48 h,分别为NC1、NC2组;(3)A组:AGEs浓度分别为0.1、0.2、0.4 g/L,各作用24、48 h,作用24 h依次为A1组、A2组、A3组,作用48 h依次为A4组、A5组、A6组.免疫组织化学检测AGEs受体(RAGE)、过氧化物酶体增生物激活受体γ辅助激活因子-1α(PGC-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达;激光共聚焦显微镜检测核因子-κB (NF-κB)的活化.通过图像分析软件IPP6.0和统计软件SPSS 17.0进行定量分析.结果 A组RPE细胞较C组和NC组RAGE、PGC-1α和VEGF蛋白的表达明显增加,且随着AGEs浓度的升高和刺激时间的延长而增加(F=294.5、228.3、241.5,P＜0.05);随着AGEs浓度的升高和刺激时间的延长,NF-κB的活化增加.结论 AGEs的堆积可导致其受体RAGE在RPE细胞表达增加,并促进核转录共同激活因子PGC-1α蛋白的表达和NF-cB的活化,促进RPE细胞VEGF的分泌.     

苏拉明对体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 观察苏拉明(suramin)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(retinalpigment epithelial cells)生长、增殖的影响。方法 以300mg·L~(-1)苏拉明作用于培养的视网膜色素上皮细胞,于不同的时间点行细胞计数,绘制生长曲线,台盼蓝染色判定细胞的活性;将不同浓度的苏拉明(0、100、200、300、400mg·L~(-1))加入RPE细胞培养液,72h后用四甲基唑盐(MTT)比色法测吸光值A,并计算不同浓度条件下的细胞增殖抑制率;流式细胞技术检测细胞周期变化。结果 苏拉明在所设浓度内均抑制RPE细胞增殖,并存在时间-效应及剂量-效应关系,最大增殖抑制率约78％,72h时IC_(50)为272mg·L~(-1)。FCM示suramin使G_2/M期细胞增加了14.2％。结论 苏拉明能抑制体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖,可作为防治增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的候选药物作进一步研究。     

米诺环素对糖基化终末产物所致大鼠视网膜微血管渗漏的作用及其机制研究

目的研究基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在糖基化终末产物（AGEs）所致血-视网膜屏障损害中的作用,评估米诺环素对AGEs所致血-视网膜屏障损害的治疗作用。方法 36只SD大鼠用随机数字表法分为牛血清白蛋白（BSA）组、AGEs-BSA组和AGEs-BSA＋米诺环素组。BSA组和AGEs-BSA组分别自尾静脉注入BSA和AGEs-BSA,每日1次,每次40mg/kg,AGEs-BSA＋米诺环素组在每日注射AGEs-BSA的同时隔日腹腔注射米诺环素45mg/kg。14d后,每组取6只大鼠用伊文思蓝（EB）法观察并比较各组视网膜血管的通透性,其余大鼠处死后,采用RT-PCR及Westernblot法观察视网膜MMP-9的表达。结果 AGEs-BSA组MMP-9mRNA和蛋白水平均较BSA组升高,差异有统计学意义（P〈0.01）,同时,视网膜微血管渗透性也显著升高（P〈0.01）。而在AGEs-BSA＋米诺环素组大鼠视网膜基因和蛋白水平的MMP-9均被抑制（P〈0.01）,同时视网膜微血管渗漏被部分逆转（P〈0.01）。视网膜微血管的渗透性与MMP-9蛋白的表达呈正相关（r=0.891,P=0.000）。结论 AGEs所致的视网膜微血管渗漏与MMP-9的高表达有密切关系,AGEs的作用至少部分是通过MMP-9实现的。米诺环素能部分逆转AGEs-MMP-9途径所致的血管渗漏。     

川芎嗪对糖基化终末产物诱导人视网膜色素上皮细胞表达低氧诱导因子-1α的影响

慢性高血糖所致机体内糖基化终末产物（AGEs）的形成及不断积累是导致早期糖尿病视网膜病变（DR）的重要原因。Treins等发现AGEs活化低氧诱导因子-1α（HIF—1α）刺激VEGF的表达，可能对DR的发展起到了很重要的作用。中药川芎嗪治疗DR已有临床报道及实验研究结果证实．但它对DR的疗效是否通过对HIF-1α的表达产生影响而起作用，尚未见有关报道。我们通过研究川芎嗪对AGEs诱导人视网膜色素上皮（RPE）细胞HIF-1α表达的影响．探讨川芎嗪治疗DR的分子机制。     

曲尼司特对体外培养人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的:观察曲尼司特对体外培养人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增殖的影响。方法:用不同浓度的曲尼司特0(对照组),12.5,25,50,100mg/L作用于体外培养的3~5代人RPE细胞(RPE-19细胞株),在倒置显微镜下、结合HE染色观察细胞形态,并采用细胞角蛋白CK18对细胞进行鉴定。分别在作用12,24,48h后采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞抑制率,蛋白质印迹法(Western-Blot)和免疫组织化学法观察不同浓度的曲尼司特作用24h后细胞表达转化生成因子-β1(TGF-β1)、血小板衍化生长因子受体A(PDGFR-A)蛋白的情况。结果:相同时间点不同浓度曲尼司特对细胞抑制率随浓度增加而增大,差异有统计学意义(P<0.05)。TGF-β1蛋白表达定位于细胞浆,PDGFR-A蛋白定位于胞膜和胞浆,它们的表达量都随曲尼司特浓度的增加而下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:曲尼司特可以抑制人RPE细胞的增殖,并有剂量依赖性,其机制可能与下调TGF-β1和PDGFR-A蛋白表达有关。     

曲安奈德对体外培养的人视网膜色素上皮细胞HSP47表达的影响

目的 探讨曲安奈德(TA)对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞热休克蛋白47(HSP47)表达的影响.方法 研究RPE细胞分别在0、50、200μg/mL TA的培养条件下,通过RT-PCR检测HSP47 mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 与0μg/mL TA组比较,50μg/mL及200μg/mL TA组HSP47 mRNA和蛋白的表达量明显下降(P<0.05),蛋白水平亦明显下降(P<0.05).结论 HSP47对胶原的成熟起着重要作用,TA能有效抑制人RPE细胞HSP47的表达,可能是其防治增生性玻璃体视网膜病变(PVR)及增生型糖尿病视网膜病变(PDR)的一个重要机制.     

曲安奈德对培养人视网膜色素上皮细胞表达survivin的影响

目的 观察曲安奈德(TA)对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达survivin基因的影响,探讨TA治疗增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的机制.方法 四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法和流式细胞术检测不同质量浓度(0.01、0.1、1.0 g/L)TA对人RPE细胞增生及凋亡的作用,免疫组织化学法、RT-PCR检测药物在蛋白和基因水平对survivin表达的影响. 结果 在不同质量浓度的TA作用下,人RPE细胞的增生受到抑制,凋亡率增加,在蛋白水平和基因水平,药物均对RPE细胞survivin的表达有明显的抑制作用,且均与药物的作用时间和剂量呈正相关.各组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 TA能抑制人RPE细胞的增生及survivin蛋白和mRNA在人RPE细胞的表达,诱导RPE细胞的凋亡.     

Modulation of matrix metalloproteinase and TIMP-1 expression by cytokines in human RPE cells

PURPOSE: The balance between matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of MMPs (TIMPs) is crucial for homeostasis of ocular extracellular matrices. To assess altered MMP activity as a determinant in the migration of human retinal pigment epithelial (RPE) cells, expression characteristics of several MMPs and TIMP-1 in RPE cell cultures were investigated. METHODS: Expression studies were performed with RT-PCR, ELISA, and immunofluorescence analysis. Secretion of MMP-2 was demonstrated by zymography. Migration of cytokine-stimulated RPE cells was evaluated with microporous membranes of permeable chambers. RESULTS: MMP-1, -2, -3, and -9; MT2-MMP; and TIMP-1 were expressed in cultured RPE cells. MMP-2 was detected on the cell surface and in secreted inactive and active forms. TGF-beta(2), IL-1beta, and TNF-alpha enhanced secretion of MMP-1, -2, and -3. TGF-beta(2) also stimulated MT2-MMP cell surface expression and release of TIMP-1. The mRNA levels of MMP-1, -2, and -3 and TIMP-1 were markedly increased by TNF-alpha and TGF-beta(2). MMP-2 mRNA levels were also upregulated by PDGF-BB. Migration of RPE cells stimulated by TGF-beta(2) or PDGF-BB was inhibited in presence of a synthetic MMP inhibitor. CONCLUSIONS: Proinflammatory cytokines and TGF-beta(2) play an important role in the upregulation of expression of MMP-1, -2, and -3 in RPE cells and account for a directional shift in the balance between MMPs and TIMPs. Facilitation of RPE cell migration stimulated by cytokines (i.e., TGF-beta(2) or PDGF-BB) in ocular diseases may be due to increased release of MMPs, in the presence of comparatively lower levels of their inhibitors.     

补体C5b-9复合物对人视网膜色素上皮细胞TGF-β_2表达的影响

目的 观察补体C5b-9复合物对人视网膜色素上皮(RPE)细胞TGF-β2表达的影响.方法 采用大鼠血清接触兔红细胞提取补体C5b-9复合物.提纯、鉴定后的补体C5b-9复合物作用于体外培养的人RPE细胞,用半定量RT-PCR法测量TGF-β2表达水平.结果 补体C5b-9复合物刺激质量浓度为80μg/mL和40μg/mL时,光学显微镜示REP细胞结构破坏;低于或等于20μg/mL时,光学显微镜未见REP细胞结构明显改变.20μg/mL补体C5b-9复合物作用RPE细胞4h后,TGF-β2 mRNA表达水平可提高2倍.结论 补体C5b-9复合物对RPE细胞的破坏作用有溶破量和亚溶破量之分,亚溶破量可诱导RPE细胞TGF-β2表达上调.     

Increased levels of advanced glycation end products in human cataractous lenses

PURPOSE: To investigate the occurrence of advanced glycation end products (AGEs) formed oxidatively (pentosidine and N(epsilon)-carboxymethyl lysine [CML]) or nonoxidatively (imidazolone) in human lenses and the relation of AGEs to lens coloration, cataract type, and patients' diabetic state. SETTING: Departments of Ophthalmology and Internal Medicine III, University of Jena, Jena, Germany. METHODS: Pentosidine, CML, and imidazolone concentrations were measured in the water-soluble protein fraction of 44 cataractous lenses (from 24 nondiabetic and 20 diabetic donors) and 6 noncataractous control lenses. RESULTS: Pentosidine, CML, and imidazolone were higher in cataractous lenses than in control lenses (pentosidine, 3.7 pmol/mg +/- 5.3 (SD) and 1.9 +/- 1.7 pmol/mg, respectively; CML, 3.0 +/- 2.2 nmol/mg and 1.3 +/- 0.7 nmol/mg, respectively; imidazoline, 80.4 +/- 93.3 AU/mg and 19.6 +/- 18.5 AU/mg, respectively). Among the cataractous lenses, the highest AGE concentrations were found in mature cataracts, with a statistically significant increase in CML. The AGE content increased relative to the intensity of brown coloration of the lens; the brown coloration also indicated the highest rise of imidazolone compared to pentosidine and CML. Lenses from diabetic donors had generally similar pentosidine values and elevated CML and imidazolone levels compared to lenses from nondiabetic donors. The pentosidine, CML, and imidazolone levels in the lenses correlated significantly with one another but not with patient age. CONCLUSION: Advanced glycation end products formed oxidatively and nonoxidatively occurred to a higher degree in cataractous lenses than in noncataractous lenses. The strong relationship between the lenses' AGE content, color/opacity, and the state of the cataract may indicate that advanced glycation plays a pivotal role in cataract formation.     

柔红霉素对培养人视网膜色素上皮细胞BAK和BCL-XL表达的影响

目的 观察BAK和BCL-XL在正常培养和经柔红霉素处理后的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中的表达。方法 人RPE细胞培养液中加入终浓度为200μg·L~(-1)柔红霉素作用12h,更换新鲜培养液继续培养24h后,运用抗BAK和BCL-XL的多克隆抗体进行免疫细胞化学染色,观察2种基因在RPE细胞中表达的变化。结果 BAK和BCL-XL在正常RPE细胞中均存在表达,但前者的染色强度大于后者(P<0.05),2者光密度分别为56.4±5.7和32.4±4.7,经柔红霉素处理后,RPE细胞BAK的染色强度增加(P<0.05),而BCL-XL的染色强度不变(P>0.05),其光密度值分别为79.2±6.5和34.7±3.9。结论 BAK和BCL-XL在人RPE细胞中存在表达。柔红霉素可以促进BAK的表达,这可能是其诱导RPE细胞凋亡的机理之一。     

视网膜微血管周细胞内明胶酶的表达及影响

目的　检测糖基化终产物 (AGE)对培养的牛视网膜微血管周细胞 (BRPs)分泌明胶酶的作用 ,以探讨糖尿病视网膜病变 (DRP)的发病机制。方法　不同质量浓度AGE( 0、8、3 2、12 5、5 0 0、2 0 0 0 μg/mL)与BRPs作用 4d后 ,明胶酶谱分析细胞所分泌的明胶酶。结果　正常BRPs有明胶酶 A的分泌 ,相对分子质量分别为 72 0 0 0的原酶及 62 0 0 0的活性酶 ;扫描单位分别为 13 3 73± 6 66及 160 18± 15 2 9,另有少量 92 0 0 0的明胶酶 B分泌 ,扫描单位 93 0 1± 5 89。AGE能以剂量依赖的方式抑制BRPs内明胶酶 A的分泌 (原酶和活性酶与AGE相关系数分别为r =-0 798及r =-0 73 4,P <0 0 1)。结论　周细胞分泌明胶酶 A的下降可能是DRP中基底膜增厚的重要原因之一     

晚期糖基化终产物对人晶状体上皮细胞TTase表达的影响

目的：观察晚期糖基化终产物对人晶状体上皮细胞硫醇转移酶表达及活性的影响。
　　方法：将体外人晶状体上皮细胞用 AGEs-BSA 浓度为1.5mg/mL,胎牛血清体积分数为10%的DMEM培养液培养,同时设定相同浓度的BSA对照组及空白对照组,分别于0,1,2,3,4 d收集细胞,测定晶状体上皮细胞内ROS含量、TTase 活性, qRT-PCR 检测 TTase mRNA 表达情况, Western blot检测TTase蛋白质表达。
　　结果：与对照组相比, AGEs-BSA干预后,细胞内ROS含量呈时间依赖性增高,差异有显著统计学意义(P<0.01), BSA干预后ROS的表达与对照组无显著差异。 AGEs可诱导TTase的 mRNA表达逐渐增高,2 d时达到峰值,约为正常对照组的5.06倍( P<0.01);而BSA处理组和对照组TTase的mRNA表达差异无统计学意义( P>0.05)。与TTase的mRNA表达类似, TTase活性升高,在3 d达到峰值,为正常对照组的2.01倍( P<0.01)。 Western blot检测发现,TTase蛋白质表达逐渐增加,从3d开始TTase表达与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：AGEs可能是通过诱导人晶状体上皮细胞发生氧化应激,致使TTase表达上调,活性增强。     

糖基化终末产物与糖尿病瞳孔功能异常的关系

目的探讨虹膜中糖基化终末产物（AGEs）的表达及血浆AGEs质量浓度与糖尿病患者瞳孔功能障碍的关系,并探讨其发病机制。方法对糖尿病并发白内障患者的瞳孔散大难易度与单纯白内障患者进行对照研究。依据白内障手术前瞳孔散大是否能够达到6mm,将2型糖尿病并发白内障患者分为瞳孔功能异常组24例和瞳孔功能正常组21例,单纯白内障组患者21例作为对照。采用竞争性酶联免疫吸附分析法测定各组患者血浆AGEs的吸光度（A）值;采用免疫组织化学法分别检测上述各组患者虹膜组织中AGEs的表达强度。结果 3组在性别、年龄、眼压和糖尿病病程方面差异均无统计学意义（P〉0.05）。瞳孔功能异常组、瞳孔功能正常组和单纯白内障组血浆AGEs质量浓度分别为7.625±1.69、5.904±1.27和3.726±1.35,组间差异均有统计学意义（F=312.431,P〈0.05）;瞳孔功能正常组和单纯白内障组的血浆AGEs质量浓度明显低于瞳孔功能异常组,差异均有统计学意义（t1=2.017,P〈0.05;t2=2.018,P〈0.05）。瞳孔功能异常组、瞳孔功能正常组和单纯白内障组AGEs在虹膜组织中的表达强度值分别为109.13±19.47、79.71±13.06和40.92±11.91,差异有统计学意义（F=188.32,P〈0.05）,瞳孔功能正常组和单纯白内障组的AGEs表达值明显低于瞳孔功能异常组,差异均有统计学意义（t1=2.017,P〈0.05;t2=2.023,P〈0.05）。结论 AGEs在糖尿病瞳孔功能异常患者虹膜组织中呈高表达,其血浆AGEs质量浓度亦明显升高,提示AGEs在虹膜组织中的积聚与糖尿病患者瞳孔功能异常有关,可能是其发病机制之一。     

Immunohistochemical localization of advanced glycation end products in pinguecula

Background Advanced glycation end products (AGEs) are known to be deposited in the target organ of ageing. In addition, the deposition of AGEs accelerate the process of ageing. We investigated the immunohistochemical localization of AGEs in pinguecula, one of the ocular changes related with ageing process. Methods Surgical specimens of conjunctiva with or without pinguecula were prepared from nine patients, respectively. Immunohistochemical localization of AGEs was investigated using monoclonal antibodies to-(carboxymethyl)lysine, pentosidine, imidazolone, and pyrraline. Results Moderate to strong immunoreactivities to AGEs were detected in the subepithelial amorphous deposits of all the surgical specimens with pinguecula. In contrast, no or weak immunoreactivities to AGEs were detected in the surgical specimens without pinguecula. Conclusions Pinguecula is an aggregation of AGEs-modified proteins. The presence of pinguecula would be an index of local irradiation of ultraviolet rays and decreased antioxidant activities. Financial interest: none     

Bax过表达对培养人视网膜色素上皮细胞bak和bcl-xl表达的影响

目的观察bak和bclxl在正常培养和经bax转染后的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中的表达。方法采用脂质体对正常培养人RPE细胞进行bax基因的转染,筛选阳性转染的细胞。实验分为正常细胞组,空载体组和基因转染组。运用抗bak和bclxl的多克隆抗体进行免疫细胞化学染色,观察两种基因在RPE细胞中的表达的变化。结果bak和bclxl各组细胞中都存在阳性表达。bak在三组细胞中的染色光密度分别为56.4±5.7,52.3±5.1和75.4±7.5,其中转基因组的染色强度高于正常和空载体组(P<0.05)。bclxl在三组细胞中的染色光密度分别为32.4±4.7,29.5±4.2和28.7±4.3,染色强度在三组之间没有明显差别(P>0.05)。结论bak和bclxl在正常人RPE细胞中存在表达。bax转染可以促进细胞bak的表达,这可能是其诱导RPE细胞凋亡的机制之一。     

糖基化终末产物在青光眼中的研究进展

糖基化终末产物(AGEs)体内多种组织中累积,通过调节相关因子表达及激活信号通路等诱发一系列生物学反应,引起年龄相关性疾病及神经退行性病变,如阿尔茨海默病、帕金森病、动脉粥样硬化。青光眼是一种视神经退行性病变,最终导致不可逆的视野缺失,是全球仅次于白内障导致视力丧失的主要原因。青光眼患者视网膜等眼组织中过多AGEs累积,通过激活信号通路、引发生物反应,对组织、细胞的结构及功能造成损伤,参与青光眼发生发展的病理过程。本文主要阐述AGEs在青光眼发病机制、治疗、筛查等相关研究中的最新进展,为青光眼的防治提供新的思路和研究方法。