冻存血与新鲜血的DNA抽提效果的比较研究

目的探讨一种简单便捷、可用于PCR扩增的人体外周血标本冷冻保存的方法。方法外周血标本冷藏于普通冰箱冷冻室2-4周,采用常规方法,提取28例新鲜血标本及31例冻存血标本的DNA,经2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶分析软件半定量分析,比较冻存血和新鲜血的DNA抽提效果。采用PCR方法扩增抽提DNA标本的ABCB4基因外显子6,研究冻存血中提取的DNA能否用于PCR实验。结果新鲜血组的光强度值为24948.98±10246.97,冻存血组DNA标本的光强度值为22917.65±11545.63,两组间无显著性差异(P>0.05)。所有冻存血中提取的DNA标本,经PCR扩增均有目标带。结论简易冷冻保存的外周血标本中提取的DNA质量与新鲜血无明显差别。冻存血的DNA标本可以用于PCR实验。     

少量外周血提取RNA方法的研究

目的建立从少量外周血中提取RNA的方法,为相关分子生物学及遗传学研究提供条件。方法从13例健康成人各抽取外周血3份,每份0．3ml,一份立即提取RNA,一份放置室温3d,另一份放置-20℃保存21d,提取RNA,测定RNA产量、RNA的完整性及用RT—PCR方法检测其对不同基因的表达。结果从新鲜全血中提取RNA的产量相对较高,与从室温及冰冻保存的全血中提取的RNA的产量相比有统计学意义。三组提取RNA均有良好的完整性,均可用于RT—PCR。结论在用少量外周血标本做RT—PCR等研究时,可以用PreAnlytix方法提取少量血中RNA,为留取标本的方便。也可用室温或冰冻保存的全血标本     

系统性红斑狼疮患者长期冻存全血中RNA的提取

目的探讨从冻存1年以上的系统性红斑狼疮(SLE)患者的全血中提取RNA的实验方法。方法以-80℃冻存了1年以上的SLE患者的全血为材料,先分离一定量的外周血白细胞,再按总RNA提取试剂盒的步骤提取RNA。结果分光光度计检测,22例标本的总RNA量平均为(46.288±17.785)ng/μL,OD均值1.8～2.1,凝胶成像系统显示,RNA的电泳条带清晰,28S与18S比值为2∶1;以RT-PCR方法扩增β-actin基因,均出现了142 bp的目标条带,说明提取的RNA质量高、完整性好,可以满足RT-PCR扩增需要。结论从长期冻存的SLE患者的全血中可以提取RNA但存在一定的难度,冻存血量和预先分离白细胞是实验成功的关键。     

提取大鼠脂肪组织总RNA的方法探讨

目的：探索一种提取大鼠冻存脂肪组织总RNA的有效方法。方法：在Trizol分离试剂说明书基础上，参考文献提取脂肪组织RNA的方法，离心（10000rpm，10min）去除上层脂类液体后才开始抽提。结果：用此法提取的大鼠冻存脂肪组织总RNA，经电泳鉴定及进一步RT—PCR检测，仍未能显示出较高纯度和完整性。结论：提取大鼠冻存脂肪组织总RNA的方法还需进一步改进。     

全血标本保存条件对人总RNA提取效率的影响

目的探讨全血标本保存条件对RNA提取效率和RNA完整性的影响。方法从179例保存在不同温度、不同时间的全血标本中提取总RNA,测定其浓度和纯度、分析其完整性。另选20例标本研究冻融次数对RNA提取效率的影响。179例中的73例总RNA在-80℃下保存1周前、后分别测定浓度和纯度,观察两者差异。结果新鲜血来源的总RNA浓度最高,平均306.51ng/μl;冻融2次全血仍可获得足量的RNA,浓度181.98ng/μl,RNA完整性有所下降;-80℃保存1周的RNA,浓度和纯度都略有下降。结论利用Trizol法可从小体积全血标本中获取足量有效的总RNA;不同保存条件全血中所获取的总RNA浓度存在差异;总RNA-80℃短期保存也会略有降解。     

一种用Tripure试剂从冻存组织分离纯化RNA的方法

目的 探索一种使提取的冻存组织RNA纯度和完整性均较高的方法。方法 在Tripure分离试剂说明书基础上，结合异琉氰酸肥等提取RNA的方法，对提取组织RNA的操作步骤进行调整、改进。结果 用此法提取的冻存组织RNA，经电泳鉴定及进一步RT—PCR检测，显示RNA的纯度及模板性较好。结论 用此法提取的冻存组织RNA质量稳定可靠。     

影响外周血DNA提取质量因素分析

目的探讨人体外周血冻存标本存放时间对提取DNA质量的影响。方法使用外周血DNA提取试剂盒FlexiGene DNA Kit(250),对-80℃冻存1a、2a、3a和4a的外周血标本进行DNA提取,NanoDrop-2000分光光度仪检测DNA浓度和OD260/OD280比值,1%琼脂糖进行电泳检测,采用单因素方差分析比较DNA质量。结果冻存1a、2a和3a的外周血DNA浓度之间无差异(P>0.05),冻存4a的外周血提取DNA浓度明显低于冻存1~3aDNA的浓度(P<0.05)。冻存1a的外周血DNA纯度明显高于冻存2a及以上的样品(P<0.05)。结论外周血标本-80℃冻存时间超过3a对提取DNA的质量有明显的影响。     

瘢痕疙瘩家系外周血淋巴细胞永生化方法探讨

目的探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法,为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源。方法采用EB病毒转化技术,分别采用新鲜血法和冻存血法。将瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系。结果成功建立了一瘢痕疙瘩家系中27个个体的永生细胞株：新鲜血法较冻存血法可明显提高一次建系成功率。结论EB病毒转化技术可有效保存原来个体完整的基因组,为以后的相关研究提供了长期的DNA资源。新鲜血法明显优于冻存血法,更适用于永生化细胞库的建立。     

样本保存液和超低温冰箱保存对RT-PCR实验结果的影响

目的:通过对两种新鲜组织保存方法的比较,探讨一种简便、有效的用于抽提RNA的保存新鲜组织的方法。方法:采集人新鲜子宫内膜组织标本38例,其中26例组织用样本保存液(RNAstore Reagent)常温保存,12例组织冻存于-80℃冰箱,1周后提取总RNA。β-Actin基因mRNA的表达水平通过两种方法检测。一种经1.0%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察分析,另一种是使用ABI PRISM 7500 PCR仪进行荧光定量PCR检测。比较两组间β-Actin基因的光密度值和平均CT值的差异。结果:两种方法保存的新鲜组织标本均出现305 bp的目标带。OD值分别为2 368.24±678.01和2 493.35±696.181,平均CT值分别为13.64±3.31和14.08±1.57,两组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:在没有超低温冰箱的情况下,样本保存液(RNAstore Reagent)可以用来保存新鲜组织样本。     

﹣80°C冰箱长期冻存外周血造血干细胞研究

目的对外周血造血干细胞活性在深低温（-80℃）下保存3年的效果进行评价。方法对30例经MCS＋血细胞分离机采集所得的外周血造血干细胞加入细胞冻存保护剂分别予以-196℃液氮冻存和-80℃冰箱深低温冻存,并检测和比较冻存前后单个核细胞（mononuclear cells,MNC）、CD34＋细胞的计数及细胞回收率,细胞活性。结果 -80℃冰箱冻存组MNC、CD34＋细胞冻存3年与冻存前比较差异均无统计学意义冻存3年后MNC回收率与冻存1年后比较差异无统计学意义。3年后-80℃冰箱冻存组干细胞与-196℃液氮冻存组比较,差异无统计学意义。结论 -80℃冰箱深低温保存法快速、简便、安全、费用低廉,可有效用于外周血造血干细胞长期保存。     

全血贮存条件对离子交换高效液相色谱法检测HbA1c的影响

目的探讨不同温度、不同时段的贮存条件对全血HbA1c测定结果的影响。方法用离子交换高效液相色谱法检测全血HbA1c。取60例全血新鲜样本,每样本分装成15份,1份作为新鲜样本标准当天检测;5份4℃贮存,分别于3d、1周、2周、3周、4周后取出检测;3份-20℃、3份-40℃、3份-80％贮存,分别于1、3、6个月后取出检测,比较各个贮存条件下结果的平均值。结果4℃样本2周内的结果略高于当日结果2．5％左右,从第3周开始逐渐下降,第4周低于当日结果7．2％。-20℃、-40℃、3和6个月的结果都比当日结果低,且随时间延长有逐渐降低的趋势;除-80％冻存1个月的结果与当日结果差异无统计学意义（P〉0．05）外,其余各组结果与当日结果比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。-80℃冻存1、3和6个月的结果都比当日结果略高,且随时间的延长结果略有升高,偏离当日结果的程度要比-20℃、-40℃偏离程度小。结论在相同温度条件下贮存时间越短贮存温度越低HbA1c越接近当日结果;贮存温度对结果的影响要比贮存时间更大。-80℃贮存1个月是本实验显示的最佳贮存条件。     

存放全血温度及时间对提取DNA质量的影响

采用ＰＣＲ扩增评估提取ＤＮＡ的质量,研究在不同温度、时间条件下存放全血对提取ＤＮＡ的影响,结果：不同温度（４℃１￣４ｄ,－２０℃３个月,－８５℃３个月）条件下存放的全血,４０℃存放１￣４ｄ与－８５℃存放３个月无显著差异,４℃存放１￣４ｄ与－２０℃存放３个月,－２０℃与－８５℃存放３个月呈显著差异。结论：４℃１￣４ｄ及－８５℃３个月,能获得较高质量的ＤＮＡ样品。     

新鲜与陈旧外周抗凝血中miRNA表达变化的研究

目的 比较新鲜与陈旧外周抗凝血中miRNA(microRNA)表达的变化.方法 取5份新鲜及6份陈旧外周抗凝血液样本,提取全血总RNA并测定其纯度与浓度,应用实时定量RT-PCR技术分析外周血中miRNA的表达变化.结果 经过核酸蛋白定量仪检测,新鲜与陈旧外周抗凝血液中总RNA A260/280值为1.8～2.0范围内.实时荧光定量RT-PCR的结果显示:新鲜与陈旧的外周抗凝血液中miRNA RNAU6-2的相对拷贝数差异无统计学意义.结论新鲜与陈旧外周抗凝血液中miRNA RNAU6-2均有表达且无差异.     

高通量测序分析miRNAs在胃癌新鲜组织与石蜡包埋组织中的表达

目的 利用二代测序技术对FFPE标本进行高通量测序及相关的生物信息学分析,探讨miRNAs在来源于石蜡包埋胃癌组织(FFPE)中的标本检测的可靠性,探讨其临床意义.方法 选取2015年和2016年2例胃癌患者手术切除同一组织的FFPE和新鲜冰冻标本,从标本中提取RNA并分离构建small RNA文库,采用Illumina测序平台测序的方法对其进行高通量测序,统计各已知miRNAs家族序列的表达量,构建已知miRNAs表达谱,对标本miRNAs进行Spearman相关性分析,评估miR-NAs表达量的差异变化情况.结果 新鲜冰冻标本中提取的总RNA质量较高,RNA保存度完整,显示28S是18S的1.3～1.4倍,从石蜡组中提取的RNA,结果显示有不同程度的降解,28S和18S的波峰不明显,miRNAs表达谱在冰冻和FFPE标本中,Spearman相关系数分别为0.90争0.86,两者miRNAs表达量较一致,具有相关性.结论 FFPE中的miRNAs仍然保持一定的完整性,且可通过二代测序进行肿瘤标本检测.     

实验室血样保存条件对降钙素原浓度测定的影响

目的:探讨实验室血样保存类型、温度、时间、密封状态对降钙素原(procalcitonin,PCT)浓度测定的影响。方法:采用高敏免疫化学发光法检测10位脓毒血症患者的血样PCT浓度,分析比较保存不同时间血清与全血、4℃与25℃、密封与非密封PCT值的变化。结果:密封组与非密封组PCT值差异无统计学意义(P>0.05);全血4℃保存4h、25℃保存2h、血清25℃保存4h后,PCT值均较基线值下降,下降具有统计学意义(P<0.05);而血清4℃保存2h时其PCT值较基线值升高,有统计学意义(P<0.05),保存4～8h较基线值升高,但无统计学意义(P>0.05),保存24h后PCT较基线值下降有统计学意义(P<0.05);四组保存24h时PCT值较基线值下降了4.3%～16.8%。结论:检测PCT的血样标本以血清室温下保存最好,全血标本宜于冷藏保存,为提高检测的准确性和稳定性,建议采血后2h内完成检测,或制定规范的检测流程,确保采血与检测的时间间隔相对恒定,以利于PCT值的动态稳定性。     

肝癌患者外周血单个核细胞TGF-β1 mRNA表达水平的检测

目的探讨外周血单个核细胞（PBMCs）转化生长因子-β1（transforming growth factorbeta1,TGF-β1）mRNA表达水平在肝癌（HCC）发病中的作用。方法分离20例肝癌患者和20例健康体检者外周血单个核细胞,提取总RNA。利用半定量RT-PCR方法逆转录并扩增TGF-β1,通过凝胶图像扫描系统对PCR产物的电泳条带进行密度扫描。结果肝癌患者组PBMCs中TGFβ1mRNA表达水平明显高于健康对照组（P〈0.01）。结论TGFβ1mRNA表达水平升高与肝癌发病相关。