结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较

目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 .     

结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫

目的　研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法　以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RNA的表达 .将 p TB30 m质粒肌注免疫 BAL B/c和 C5 7BL /6小鼠 ,EL ISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,生物学方法检测 IFNγ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 RT- PCR检测证实 p TB30 m可在 CHO细胞中表达 .p TB30 m免疫小鼠可引起较高水平的 Ag85 B特异性的抗体应答 .免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞增殖显著 ,BAL B/c和 C5 7BL/6小鼠 IFNγ的量分别达到 136 0 ng· L- 1 和 196 5 ng· L- 1 ,而生理盐水和空质粒对照组均低于 80 ng· L- 1 .结论　应进一步研究 p TB30 m作为TB的基因疫苗用于 TB的防治的效果 .     

MPT64 DNA疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的:研究MPT64 DNA疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.方法:C57BL/6小鼠36只,随机分为4 组.A组(PBS)、B组(pcDNA3.1)、C组(BCG)、D组(pcDNA/MPT64);分别于胫前肌注射质粒DNA免疫,70 μg/次,1次/2 wk,共3次.末次免疫后5 wk用106 CFU H37Rv经尾静脉攻击,攻击后6 wk处死小鼠,测血清总IgG,特异性脾淋巴细胞增殖实验、IFN-γ及IL-4分泌水平.作脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及观察小鼠存活时间.结果:MPT64基因疫苗诱导小鼠特异性IgG的产生、脾淋巴细胞增殖以及IFN-γ的分泌.MPT64 DNA免疫组肺、脾组织荷菌量,病理学改变和小鼠存活时间明显优于阴性对照组.结论:MPT64 DNA疫苗在抗结核分枝杆菌(Mtb)感染过程中具有一定免疫保护作用.     

小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应

目的研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性。方法将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只。BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次。NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次。在免疫的第2周,4周及最后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平。同时,最后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应。结果构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究。     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合基因的克隆表达及生物信息学分析

目的构建结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合表达载体,并进行抗原的生物信息学分析,为候选疫苗筛选奠定基础。方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株中分别扩增出Ag85B基因,TB10.4基因,Ag85B-TB10.4;将Ag85B克隆入pET-28a(+)表达载体中,将TB10.4和Ag85B-TB10.4分别克隆入pET-SUMO表达载体中。上述重组质粒转化入大肠埃希杆菌BL21菌中(DE3),经IPTG诱导表达,并对其进行生物信息学分析。结果 (1)成功将结核分枝杆菌Ag85B和TB10.4,Ag85B-TB10.4基因分别克隆入pET28a(+)和pET-SUMO表达载体中,经IPTG诱导蛋白表达后,对经超声裂解的菌液上清进行SDSPAGE电泳,表明获得了与预期蛋白大小一致的表达产物,重组融合蛋白pET-SUMO-Ag85B-TB10.4蛋白分子质量约为54kDa。(2)生物信息学分析显示Ag85B-TB10.4融合蛋白具有多个潜在抗原位点。结论成功构建了重组质粒pET-28a-Ag85B,pET-SUMO-TB10.4和pET-SUMO-Ag85B-TB10.4,并获得了Ag85B,TB10.4和Ag85B-TB10.4的可溶性原核表达产物;生物信息学分析在Ag85B与TB10.4蛋白加入一段蛋白linker后蛋白的亲水性增强,抗原决定簇面积增大,为后续的功能实验研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法　用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论　Ag85 B有可能作为新型结核疫苗的组分     

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

细胞因子IL-18基因对Ag85A DNA疫苗诱导产生抗体水平的影响

目的 :研究表达含白介素 (IL) 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (MTB)H37Rv Ag85A基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆真核表达载体pcDNA3.1的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。将分别表达人IL 18基因的真核表达质粒pcIL18与MTBpcAg85A基因疫苗联合肌注免疫BALB c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2周。每次免疫后 2周采血 ,分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗Ag85A抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBCs的RNA中扩增IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。联合应用pcIL18,三次免疫后血清抗Ag85A抗体的滴度明显较单独应用pcAg85A增高。结论 :pcIL18与pcAg85A基因疫苗联合免疫 ,可显著增强Ag85A抗原的特异性体液免疫应答。pcIL18+pcAg85A基因联合免疫是否具有增强Ag85A抗原特异性细胞免疫的作用有待进一步研究     

遍在蛋白质-结核MPT64融合基因DNA疫苗的构建及免疫效应

目的:用遍在蛋白质调节结核杆菌单一抗原DNA疫苗,以期获得更强的免疫保护.方法:构建结核杆菌MPT64抗原DNA疫苗(pM)和遍在蛋白质基因与MPT64抗原基因融合的DNA疫苗(pUM).分别将构建的两种DNA疫苗肌内注射免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)、细胞因子(IFN-γ、IL-4)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较融合基因DNA疫苗和单基因DNA疫苗诱导的免疫应答强度.结果:pM组小鼠血清IgG水平高于pUM组(P＜0.01),但IgG2a/IgG1比值低于pUM组(P＜0.05).与pM组相比,pUM组小鼠IFN-γ分泌水平增高(P＜0.01),IL-4分泌水平下降(P＜0.01);pUM组的CTL活性高于pM组.提示融合基因DNA疫苗诱导的抗原特异性体液免疫应答不及单基因DNA疫苗,但其能诱导更强的细胞免疫应答.结论:遍在蛋白质-MPT64融合基因DNA疫苗对于防治结核病可能比单基因DNA疫苗更为有效.     

结核分枝杆菌MPT64-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的:测定MPT64与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力. 方法:将MPT64与ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次,每次间隔2 wk,ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度. 最后一次免疫完成后4 wk,分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞刺激指数,ELISA检测悬液中IFN-γ水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4 wk后计数脾脏细菌负荷数. 结果:MPT64-ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度1∶ 1500,免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为2.23,而生理盐水免疫组只有0.88;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ为(4.28±0.27)μg/L,显著高于生理盐水免疫组[(0.48±0.17) μg/L,P<0.05],但不及BCG免疫组[(5.18±0.31)μg/L]. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.45±0.17)相比较,融合蛋白免疫的小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,细菌负荷为5.04±0.11,但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微(细菌负荷4.38±0.22). 结论:MPT64与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因的克隆及生物信息学分析

目的获得结核分枝杆菌MPT64诊断抗原基因,进行DNA测序、序列特性生物学特性分析,为研究结核病诊断抗原侯选基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌MPT64抗原基因,测序表明该片段由699bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为98%,推导编码氨基酸序列同源性为98%。结论经DNA测序证实,扩增出的片段确为MPT64,该片段阅读框完整。     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。     

结核分枝杆菌差异蛋白MPT64与ESAT6的融合表达与纯化

目的: 融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64-ESAT6,为结核病的预防提供可供选择的有效亚单位疫苗. 方法: 设计含不同酶切位点的mpt64和esat6引物,采用PCR的方法从结核分枝杆菌毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与T-easy载体连接测序. 将测序正确的mpt64和esat6按照不同的酶切位点克隆入pPro-EX HT表达载体,挑选出阳性克隆,将诱导的表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳分析,同时与6×His的mAb进行Western-blot分析,并用Ni-NTA亲合柱纯化表达产物. 结果: PCR获得的mpt64和esat6序列与GenBank报道的完全一致. 两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物Mr为38×103,与预计大小相吻合. Western-blot结果显示,在Mr约38×103处有表达产物与6×His mAb特异性结合带. 表达产物为包涵体,通过Ni-NTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白. 结论: 结核分枝杆菌的分泌蛋白MPT64和ESAT6被成功的融合表达,有望为结核的临床判定提供有效的诊断试剂.