尿路致病性大肠杆菌iha基因敲除及其对细菌生物膜形成的影响

目的构建尿路致病性大肠杆菌(UPEC)W140菌株的黏附素基因iha缺陷株,分析iha基因缺失对UPEC生物膜形成的影响。方法采用Red重组系统的3种质粒(pKD46、pKD3、pCP20)敲除W140菌株的iha基因。pKD46表达λ噬菌体的3个重组蛋白,转入W140菌株使其具有同源重组能力。以pKD3携带的两侧带有翻转酶结合位点(FRT)的氯霉素抗性基因替换目的基因iha,再利用表达翻转酶重组酶的质粒pCP20将FRT之间的氯霉素抗性基因删除,从而获得iha基因敲除菌株。采用结晶紫染色法比较野生菌株与基因敲除菌株的细菌生物膜形成差异。结果 PCR验证和DNA测序表明,UPEC W140菌株染色体上的iha基因被成功敲除,得到iha基因缺陷株UPEC W140Δiha。基因缺陷菌株与野生菌株相比生物膜形成能力降低(P<0.01)。结论 iha基因及其编码产物参与UPEC生物膜的形成,通过抑制该基因的表达有望为控制尿路感染提供新的靶点。     

金黄色葡萄球菌临床分离株生物膜形成能力及其相关基因的检测

目的： 检测临床分离金黄色葡萄球菌（金葡菌）的生物膜形成能力及其相关基因。方法： 用半定量微量平板法检测临床分离的92株金葡菌生物膜形成能力,并通过扫描电镜观察生物膜形态,用PCR法来检测生物膜形成的相关基因ica和sarA。结果： 92株临床分离金葡菌菌株均可形成生物膜,PCR结果显示100%的分离株均含有sarA基因,78株（84.78%）含有ica基因。结论： 临床分离的金葡菌都具有形成生物膜的能力,生物膜形成的相关基因ica和sarA的携带率较高。     

变形链球菌LuxS基因缺失株对生物膜结构影响的研究

目的研究变形链球菌标准株和LuxS基因缺失菌株变形链球菌在离体模型上生物膜形成的差异变化情况。方法收集临床上因正畸而拔除的前磨牙或无龋坏的第三磨牙,行菌株复苏增菌及变形链球菌鉴定,最后将标本置于扫描电镜下观察。结果变形链球菌标准菌株和LuxS基因缺失菌株在24 h形成的生物膜有明显差异,经观察发现LuxS基因缺失菌株较标准菌稀疏。结论口腔变形链球菌可通过LuxS基因介导的菌种密度感应信号来影响口腔生物膜的形成。     

大肠杆菌qseC基因敲除及其缺陷株运动能力研究

目的 通过Red同源重组法构建qseC基因缺失的大肠杆菌突变株,探讨qseC基因对大肠杆菌运动能力的影响.方法 PCR扩增两翼与目的基因上下游同源、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化入大肠杆菌MC1000,在Red同源重组酶作用下,用含同源臂的氯霉素抗性片段置换目的 基因qseC,并利用FLP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除.测定qseC基因缺失株运动能力的变化.结果 qseC基因已被成功敲除.在LB培养基中,qseC基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异.MC1000与MC1000qseC基因缺失株运动圆环的直径分别为(6.10±0.36)mm和(3.20±0.53)mm(P<0.01).结论 成功构建大肠杆菌qseC基因缺失突变株,且qseC基因对细菌运动能力具有重要调控作用.     

表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的构建1个含有luxS基因上、下游片段、抗卡那霉素基因的重组克隆质粒,用以敲除表皮葡萄球菌luxS基因。方法检索GenBank获得luxS基因序列以设计引物,以生物膜阳性表皮葡萄球菌基因组DNA为模板,采用高保真PCR扩增得到包含luxS基因上游片段、完整的luxS基因和luxS基因下游片段的长片段DNA;以pEASYT4质粒为模板扩增得到抗卡那霉素基因,再用内侧引物分别扩增luxS基因上、下游序列,按luxS基因上游片段＋抗卡那霉素基因＋luxS基因下游片段的顺序重组连接,转化JMl09感受态细胞,通过卡那霉素筛选、酶切分析和PCR一测序验证luxS基因敲除的重组克隆载体。结果经酶切后电泳验证重组质粒中各目的片段插入无误,PCR检测结果证明重组质粒luxS基因缺失,测序结果显示碱基无错配,含目的基因的重组质粒菌株在含卡那霉素培养平板内正常生长,证明插入的抗卡那霉素基因表达良好。结论表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒构建成功,为后续luxS基因缺陷株的构建奠定了基础。     

hns基因对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响

目的 建立大肠埃希菌Red重组系统无痕敲除方法,探讨hns基因对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响.方法 以大肠埃希菌MG1655为研究对象,将pKD46质粒转化入MG1655感受态细胞.以质粒pKD3为模板扩增氯霉素抗性基因片段,并将其转化入MG1655/pKD46,氯霉素抗性平板筛选阳性克隆.利用pCP20质粒删除氯霉素抗性基因,构建MG1655 hns基因缺失菌株.96孔板结晶紫染色法分析MG1655 hns基因缺失株生物膜形成能力的变化.苯酚-硫酸法检测细菌胞外多糖含量.结果 氯霉素抗性基因消除后的hns基因缺失株PCR产物长度为434 bp,测序鉴定正确,成功构建MG1655 △hns基因缺失株.MG1655△hns菌株生物膜形成能力和胞外多糖产生显著低于MG1655(P＜0.01).结论 利用Red重组技术成功构建出MG1655△hns菌株,hns基因对细菌生物膜的形成具有重要的调控作用.     

黏附素基因iha与尿路致病性大肠杆菌形成生物膜的关系

【目的】分析尿路致病性大肠杆菌（uropathogenicEscherichiaeoli,UPEC）粘附素基因抽a与细菌生物膜形成的关系,探索细菌生物膜形成机制。【方法】采用结晶紫染色法检测临床分离的50株UPEC形成生物膜的能力,分别从生物膜阳性组与阴性组PCR扩增抽a基因,比较两组访a阳性率的差异。【结果】50株UPEC中34株能够形成生物膜。生物膜阳性组与阴性组中iha基因分布率分别为85．29％和56．25％,有显著性差异（P〈0．05）。【结论]UPEC形成生物膜是比较普遍的现象,粘附素基因iha与细菌形成生物膜存在相关性。     

临床分离金黄色葡萄球菌生物膜相关基因的PCR分析

目的 确定临床分离的金黄色葡萄球菌生物膜形成能力和生物膜相关基因之间的关系,为生物膜形成的机制研究提供依据.方法 96孔板番红染色法检测生物膜的形成,icaAD、icaBC、sar、agr和sigB的PCR扩增,并对产物进行测序和同源性比较.结果 27株金黄色葡萄球菌中共有17株形成了肉眼可见的生物膜,其中以X387和X409两株最明显;有22株扩增出icaAD和icaBC,全部菌株扩增出sar、agr和sigB.结论 ica是形成金葡菌生物膜的关键基因,但ica在形成生物膜过程中需要其他基因的协同作用.     

尿路感染分离金黄色葡萄球菌生物膜形成能力及相关基因的分析

目的：探讨尿路感染分离金黄色葡萄球菌的生物膜形成能力及相关基因分布,为预防和治疗临床感染提供理论基础。方法采用标准琼脂平板倍比稀释法检测最小抑菌浓度,菌落计数法检测细菌黏附能力,96孔板结晶紫染色法检测细菌生物膜形成能力,生物膜相关基因检测采用PCR扩增法。结果11株金黄色葡萄球菌临床株对青霉素和红霉素耐药率较高,而对万古霉素和呋喃妥因全部敏感。所有菌株都有较强的黏附能力,而生物膜形成能力一般。其中10株菌株扩增出icaAD和icaBC基因。结论尿路感染金黄色葡萄球菌的黏附能力和生物膜形成能力具有菌株差异性,ica是金黄色葡萄球菌生物膜形成的重要基因。     

野生型金黄色葡萄球菌株norA基因敲除菌株的构建及其耐药性变化

目的 探讨norA基因在野生型金黄色葡萄球菌多重耐药中的作用.方法 用DNA重组技术构建金黄色葡萄球菌norA基因敲除株并测定其对3种喹诺酮类抗生素的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值.结果 成功构建了野生型金黄色葡萄球菌株的norA基因敲除菌株,且其MIC值均有...     

亚抑菌浓度头孢他啶对临床尿管分离大肠埃希菌生物膜的作用

目的研究亚抑菌浓度头孢他啶对临床尿管分离大肠埃希菌生物膜形成的作用。方法采用琼脂平板倍比稀释法检测大肠埃希菌的最低抑菌浓度,双纸片协同法检测大肠埃希菌产超广谱β内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)的能力,菌落计数法分析细菌的粘附能力,96孔板结晶紫染色法检测细菌生物膜的形成。结果临床分离大肠埃希菌对氨苄西林、头孢哌酮、头孢噻肟和哌拉西林具有较高的耐药性,对阿米卡星、亚胺培南和美洛培南全部敏感。大肠埃希菌ESBLs阳性率为73.3%。1/4 MIC头孢他啶对大肠埃希菌生物膜形成均有抑制作用,生物膜形成能力降低8.7%~58.0%。除了大肠埃希菌E11和E15差异不显著外(P>0.05),亚抑菌浓度头孢他啶对其他14株菌的生物膜均有显著的抑制效果(P<0.05)。结论亚抑菌浓度头孢他啶可抑制临床尿管分离的大肠埃希菌生物膜形成,但其抑制程度具有菌株差异性。     

不同亚抑菌浓度头孢他啶抑制大肠埃希菌生物膜形成的量效分析

目的 分析亚抑菌浓度头孢他啶在抑制临床分离大肠埃希菌株生物膜形成过程中的浓度变化以及其作用机制.方法 根据CLSI倍比稀释法检测大肠埃希菌临床耐药株E46对15种抗生素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),通过PCR检测其超广谱β-内酰胺酶(superspectrumβ-1actamase,ESBLs)相关基因的表达,采用高效液相色谱法(HPLC)分析头孢他啶在抑制E46生物膜形成过程中药物的浓度变化.结果 E46仅对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、呋喃妥因敏感,对头孢他啶等9种抗菌药物耐药,头孢他啶在1/16 ～ 1/2MIC范围内呈剂量依赖性地抑制E46生物膜的形成(P＜0.05),E46携带TEM和CTX-M-15型酶,在对E46生物膜的抑制过程中,头孢他啶的浓度逐渐降低.结论 亚抑菌浓度的头孢他啶可以抑制大肠埃希菌临床耐药株E46生物膜的形成,但其作用浓度随时间延长降低显著.     

巯乙磺酸钠对家兔留置导尿管表面大肠杆菌生物膜的作用

目的构建留置导尿管表面大肠杆菌生物膜(biofilm,BF)体内模型,研究巯乙磺酸钠对体内留置导尿管表面大肠杆菌BF的作用。方法家兔行导尿术,经导尿管注入大肠杆菌4 d,扫描电镜及平板计数法检测留置导尿管表面大肠杆菌BF动物模型构建;经导尿管灌注巯乙磺酸钠,扫描电镜观察巯乙磺酸钠对导尿管表面大肠杆菌BF的作用,平板计数法检测巯乙磺酸钠对导尿管表面细菌数的影响。结果模型组可见大量细菌在导尿管上呈团状或膜状黏附生长,厚薄不均的黏液状物质连接成一大片,平均菌落计数模型组(4.76±0.29)较对照组(2.49±0.22)明显增多(t=17.44,P<0.01);巯乙磺酸钠干预后,巯乙磺酸钠能减少留置导尿管表面大肠杆菌BF中基质样物质,仅见散在的细菌黏附于管壁上,有少数细菌的散在团状聚集;平均菌落计数与空白对照组(5.77±0.26)及生理盐水对照组(5.54±0.52)比较,巯乙磺酸钠组(2.85±0.36)能使BF中的细菌数明显减少(F=136.44,P<0.01)。结论留置导尿管表面大肠杆菌BF动物模型成功建立;巯乙磺酸钠对体内留置导尿管表面大肠杆菌BF有破坏作用。     

巯乙磺酸钠单独及联合环丙沙星抗大肠杆菌生物膜的作用

目的研究巯乙磺酸钠(Mesna)对大肠杆菌生物膜(biofilm,BF)形成的影响,以及单独及联合环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)对大肠杆菌BF的作用。方法琼脂平板稀释法检测Mesna、CIP的最低抑菌浓度,扫描电镜观察Mes-na对大肠杆菌BF形成的作用,平板计数法检测Mesna单独及与CIP联用后BF内活菌数,用激光共聚焦显微镜(confocallaser scanning microscopy,CLSM)观察Mesna对已形成的大肠杆菌BF空间结构的影响并结合BF图像结构分析软件(image structure analyer,ISA)定量分析BF结构参数。结果 Mesna能减少BF中基质样物质以及被膜的厚度;单用Mesna(8 mg/ml)才能使BF中的活菌数减少(P<0.05),单用CIP 1MIC才可使BF中活菌数降低(P<0.05),小剂量Mesna(1 mg/ml)与1/2 MIC的CIP联合应用就可使BF上的活菌数明显减少(P<0.05);CLSM图像显示经Mesna作用后的BF厚度逐渐减少,密度逐渐稀疏;ISA软件定量分析显示:5 mg/ml Mesna作用后,BF厚度、平均扩散距离(average diffusiondistance,ADD)和结构熵(textual entropy,TE)均减少(P<0.05),区域孔率(areal porosity,AP)增加(P<0.05),2 mg/mlMesna干预后,效应不如高浓度明显。结论 Mesna能够抑制大肠杆菌BF形成,破坏成熟大肠杆菌BF形态结构;Mesna与环丙沙星存在协同作用,增强其杀菌能力。     

尿路致病性大肠埃希菌生物膜形成过程中差异表达基因筛选与分析

目的筛选尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)在形成生物膜过程中的差异表达基因,对其进行生物信息学分析,探索细菌生物膜形成机制。方法以UPEC W140菌株形成的48 h生物膜为实验组,该菌株对数生长期游离细菌为对照组,采用大肠埃希菌全基因组表达谱芯片比较细菌生物膜形成后基因表达谱的差异。结果基因芯片共检测出差异表达基因223个,其中表达上调基因192个,下调基因31个。功能分类涉及生物合成、代谢、物质转运、细胞增殖、转录调节、应激反应等相关基因。结论 UPEC形成生物膜过程中由于相关基因表达水平的改变导致细菌的生理、代谢、成分与结构的合成发生变化,这些差异表达基因将为尿路感染防治提供理论依据与研究方向。     

大肠埃希菌临床分离株耐药性变迁

目的了解大肠埃希菌对抗生素耐药性变迁,为临床治疗提供参考。方法菌株鉴定和药敏试验采用ATB全自动微生物分析仪进行测定,超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）采用双纸片协同法。结果从2001-2005年检出的大肠埃希菌对青霉素类药物耐药率最高,对亚胺培南耐药率最低,氨基糖苷类和第三代头孢菌素药物具有较好的体外抗菌活性,大肠埃希菌超广谱β-内酰氨酶（ESBLs）的发生率呈逐年上升的趋势,分别是8.5%、16.4%、19.3%、25.4%、27.8%。结论随着抗生素的广泛使用,大肠埃希菌的耐药性逐渐上升,要加强对其的耐药性监测,指导临床合理用药。     

大肠埃希菌qnrA基因的检测

[目的]了解大连地区耐环丙沙星的大肠埃希菌中qnrA基因的流行情况并研究其耐药机制。[方法]收集临床分离的耐环丙沙星的大肠埃希菌213株,通过PCR法扩增qnrA基因,对qnrA基因阳性株,KB纸片法检测抗菌药的体外抗菌活性,琼脂稀释法测MIC,并进行质粒结合试验。[结果]213株菌中查到2株qnrA阳性菌株,测序结果与Genbank中qnrA基因比对吻合率达100%。其中一株对多种抗菌药耐药,另一株则比较敏感。[结论]大连地区检测到了qnrA基因阳性的菌株,耐药机制复杂,应引起临床重视。