层粘连蛋白与脑微血管内皮细胞对神经干细胞分化的影响

目的 探讨层粘连蛋白(LN )与脑微血管内皮细胞(CMECs)在体外对神经干细胞(NSCs)分化的影响. 方法原代分离培养CMECs和NSCs.实验分为对照组(NSCs+NSCs完全培养基)和处理组(NSCs+NSCs完全培养基+LN+ CMECs),分别于6 h、1天、3天、7天等时间点用免疫细胞化学方法比较两组NSCs的分化情况. 结果从第1天开始处理组 NSCs的神经元分化率较对照组增加(P<0.05),从第3天开始, 处理组较对照组星型胶质细胞分化率下降(P<0.05). 结论 LN及CMECs可使NSCs神经元分化比率提高.     

骨髓间充质干细胞外泌体促进大鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移

  目的  探讨骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyml stem cells, BMSCs）外泌体正常状态下对大鼠脑微血管内皮细胞的增殖和迁移的影响。  方法  提取大鼠BMSCs并进行鉴定,将其与脑微血管内皮细胞（bEnd.3细胞）通过Transwell小室共培养24 h（BMSCs共培养组）;提取BMSCs外泌体进行鉴定,荧光显微镜下定性观察细胞吞噬外泌体的行为,CCK8 法检测细胞活力选定最佳BMSCs外泌体工作浓度,将其与bEnd.3细胞共培养24 h（BMSCs外泌体共培养组）。另设bEnd.3细胞单独培养组。培养24 h后通过EDU和细胞划痕实验,分别检测以上3组bEnd.3细胞的增殖和迁移能力。  结果  第3代BMSCs表面CD90、CD29为阳性,CD45显示为阴性,可成骨、成脂,表明所提取的BMSCs纯度较高。透射电镜下BMSCs外泌体形态为类圆形,直径在100 nm左右;NTA分析发现BMSCs外泌体的直径分布范围为50～600 nm,其中粒径峰值为150 nm;免疫荧光显示内皮细胞能够吞噬BMSCs外泌体;CCK8显示20 μg/mL外泌体加入对细胞增殖影响达到最佳。EDU检测显示,相较于对照组,BMSCs共培养组、BMSCs外泌体共培养组均可促进bEnd.3细胞的增殖（P<0.05）,且促进增殖的能力相当（P>0.05）。细胞划痕实验示,BMSCs外泌体共培养组细胞的迁移率高于对照组（P<0.05）,但与BMSCs共培养组差异不明显（P>0.05）。  结论  BMSCs外泌体可代替BMSCs,有效促进脑微血管内皮细胞的增殖和迁移,并为卒中后的血管新生提供新的潜在治疗手段。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养可自发分化为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow－derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在体外正常培养条件下能否自发分化为内皮细胞?方法:分离原代大鼠BMSCs,传代后正常培养至第7代,选用第3代和第7代用于本次实验?用Real－time PCR方法检测第3代和第7代BMSCs内皮细胞标识物CD31?血管生成素受体2(tyrosine kinase with immunoglobulin－like and EGF－like domains 2,Tie－2)及血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的表达;体外血管生成试剂盒(Matrigel)检测血管生成能力;免疫荧光染色检测细胞内vWF蛋白的表达?结果:在培养至第7代后,部分BMSCs在形态上呈椭圆形;Real－time PCR和免疫荧光的结果显示第7代BMSCs的内皮细胞标志物表达水平明显高于第3代BMSCs;体外血管生成实验表明第7代BMSCs在Matrigel胶上能形成网状结构?结论:BMSCs在体外正常培养条件下细胞表型会发生一定的变化,并可部分自发分化为内皮细胞?     

剪应力诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化

目的：研究剪应力对骨髓间充质干细胞（MSCs）分化的作用.方法：采用平行平板流动腔系统,将人骨髓间充质干细胞在3×10-5,8×10-5,15×10-5N/cm2剪应力水平分别作用24h,观察细胞形态变化,并进行内皮细胞标记物Von Willebrand factor（vWF）定性间接免疫荧光染色,进行Dil标记的乙酰化LDL（Dil-Ac-LDL）摄取实验以鉴定是否具有内皮细胞功能.结果：在剪应力作用24h后,MSCs形态变得偏圆、呈多角形,平行于流体方向排列.MSCs在接受3×10-5,8×10-5N/cm2剪应力作用24h后vWF染色阳性,提示内皮细胞表型特征,同时Dil-Ac-LDL摄取实验阳性,提示具有内皮细胞功能.而接受15×10-5N/cm2剪应力作用的MSCs,vWF染色与Dil-Ac-LDL摄取实验均阴性,提示未出现向内皮细胞分化.结论：剪应力可诱导MSCs向内皮细胞分化,并且与力的大小相关.     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

VEGF诱导人骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性

目的:研究内皮细胞生长因子(VEGF)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向内皮细胞定向分化的可行性并观察其生长增殖特性.方法:采用密度梯度离心法获取大量较纯的骨髓间充质干细胞,分为2组,实验组以含VEGF的M199培养液进行体外诱导分化,对照组用M199培养液培养.通过光镜、电镜及免疫组织化学染色方法分别观察所分化细胞的形态及表型,并绘制细胞生长曲线.结果:培养早期BMSCs多呈扁平、梭形、多角形形态,2周后实验组细胞渐呈集落状、椭圆形、铺路石样排列,而对照组细胞呈"毛发状"成纤维细胞外形.透射电镜下实验组细胞浆内有内皮细胞特征性单层质膜包裹结构--Weible-Palade 小体.对照组无此结构.实验组第3代细胞的Ⅷ因子相关抗原阳性比例接近(78.20±5.90)%,与人血管来源内皮细胞((82.70±4.47)%)相比,差异无统计学意义,而对照组细胞Ⅷ因子相关抗原染色呈阴性.生长曲线呈指数增长,短期内无明显衰老现象.结论:人BMSCs在VEGF的诱导下可定向分化为内皮细胞,并且保持了干细胞旺盛的增殖能力.     

脑溢安对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达的影响

目的:观察脑溢安血清对体外缺氧培养的大鼠脑微血管内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法:大鼠用脑溢安浸膏连续灌胃3d后,心脏内采血分离出血清;用新生7d SD大鼠脑内分离培养的微血管内皮细胞（RCMEC）移入厌氧培养箱造成缺氧模型;MTT法测定细胞活性;免疫细胞化学及Werstern blotting研究脑微血管内皮细胞VEGF蛋白表达。结果:缺氧18h脑溢安组OD值较对照组增高（P<0.05）。缺氧损伤的脑微血管内皮细胞内VEGF蛋白表达增强,脑溢安血清组VEGF蛋白的表达水平高于对照组(P<0.01)。结论:缺氧可诱导脑微血管内皮细胞VEGF蛋白的表达;脑溢安可以上调VEGF蛋白的表达,这可能是脑溢安对缺氧的脑微血管内皮细胞的保护作用机制之一。     

阿魏酸钠对培养大鼠大脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用

目的：研究缺氧对脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMEC）的损伤及阿魏酸钠（Sodium ferulate）对它的保护作用.方法：取体外培养的大鼠脑皮质微血管内皮细胞,置于95%N2和5%CO2的缺氧盒中12h造成内皮细胞缺氧.用透射电镜观察BMEC的超微结构变化.用内皮细胞线粒体活性和内皮细胞死亡率来评价内皮细胞活力,并用乳酸脱氢酶（LDH）漏出量作为评价损伤的指标.结果：体外培养大鼠脑皮质BMEC缺氧12h后,细胞超微结构损伤,细胞存活率及线粒体活性明显降低,LDH释放量显著增加.阿魏酸钠可显著对抗缺氧对BMEC的损伤.结论：阿魏酸钠对大鼠脑皮质BMEC缺氧损伤具有保护作用.     

同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养及多向分化潜能鉴定

目的 探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞在体外的共培养,并行多向分化诱导鉴定。方法 分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,各传至第3代后,取等量细胞,混合后共培养,共培养之细胞再次传代后,分别进行成骨细胞、成脂肪细胞诱导,并分别行碱性磷酸酶、Von Cossa及油红染色鉴定。结果 全骨髓直接培养法原代细胞形态不均一,但是增殖能力好;密度梯度法分离得到的细胞较为均一,但增殖力不如全骨髓直接培养法。经过3代传代后,细胞均可获得相对纯化。共培养细胞增殖力较好,细胞形态较为均一,且未出现因免疫排斥导致的细胞死亡。共培养之大鼠骨髓间充质干细胞分别经诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞形态（分别经碱性磷酸酶、Von Cossa染色和油红染色证实）。结论 采用全骨髓直接培养及密度梯度离心法,经3-5代培养后均可获得相对纯化之骨髓间充质干细胞。同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养生长良好,不发生免疫排斥,证实该类细胞的免疫原性极低。在体外,大鼠骨髓间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,表明它具有多向分化潜能。     

体外定向诱导人胎盘源间充质干细胞向内皮细胞分化

目的：探讨人胎盘源间充质干细胞（HPMSCS）在特定环境诱导下向内皮细胞分化的潜能，为其促进创伤愈合提供理论依据。方法：在患者知情同意的情况下，从足月分娩产妇娩出的胎盘组织中分离培养HPMSCS，通过倒置显微镜观察其生物学形态，利用流式细胞术检测其表面标志，并通过成骨诱导鉴定及成脂肪诱导鉴定确定其多向分化潜能。对鉴定后的HPMSCS在体外通过内皮细胞诱导液使之向内皮细胞分化，并对诱导后细胞进行细胞化学荧光染色，检测内皮细胞特异性Ⅷ因子（vWF）的表达；采用流式细胞术检测诱导后细胞表面标志，观察是否具有内皮细胞表型。结果：HPMSCS在培养基中持续培养后,形态由成纤维细胞样转变为类似内皮细胞的铺路石样结构。成熟内皮细胞特异的表面标志vWF为阳性表达。流式细胞术检测结果显示：CD31及CD34均有表达。结论：本诱导方案能够诱导HPMSCS出现内皮细胞表型,提示HPMSCS在体外特定条件下具有定向分化为内皮细胞的潜能。     

Co-culture of mesenchymal stem cells with umbilical vein endothelial cells under hypoxic condition

By co-culturing humm mesenchymal stem cells (hMSCs) and human umbilical rein en-dothelial cells (HUVECs) under hypoxia and creating a microenvironment similar to that of trans-planted hMSCs for the treatment of avascular ni ANFH, the effect of hMSCs on survival, apoptosis, migration and angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) under the hypoxic condition were investigated in vitro. hMSCs and HUVECs were cultured and identified in vitro. Three kinds of conditioned media, CdM-CdMNOR, CdM-CdMHYP and HUVEC-CdMHYP were pre-pared. HUVECs were cultured with these conditioned media under hypoxia. The survival rate, apop-tosis rate, migration and angiogenesis of HUVECs were respectively detected by CCK-8, flow cy-tometry, Transwell and tube formation assay. The content of SDF-1α, VEGF and IL-6 in CdM was determined by ELISA. Our results showed that hMSCs and HUVECs were cultured and identified successfully. Compared with MSC-CdMNOR and HUVEC-CdMHYP groups, the survival rate, migra-tion and angiogenesis of HUVECs in MSC-CdMHYP group were significantly increased while the apoptosis rate was declined (P<0.05). Moreover, the expression of SDF-1α, VEGF and IL-6 in MSC-CdMHYP group was up-regulated. Under hypoxia, the apoptosis of HUVECs was inhibited while survival, migration and angiogenesis were improved by co-culture of hMSCs and HUVECs. The underlying mechanism may be that hMSCs could secrete a number of cytokines and improve niche, which might be helpful in the treatment of femoral head necrosis.     

细胞间直接接触对骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)直接接触共培养诱导MSCs向血管内皮细胞分化的作用.方法 将MSCs和HUVECs按一定比例混合直接共培养,48 h后用ELISA检测其共培养细胞培养液(实验组)及MSCs与HUVECs各自单独培养48 h后再混合的培养液(对照组)中VEGF含量;5 d后用免疫荧光细胞化学法观察和分析诱导后MSCs的胎肝激酶-1 ( fetal liver kinase-1, Flk-1) 和血管性血友病因子( von Willebrand factor, vWF)的表达以及其Dil-ac-LDL吞噬能力;并用透射电镜观察MSCs超微结构改变.结果 VEGF在实验组中的含量显著高于对照组;直接接触共培养诱导MSCs表达Flk-1蛋白,且部分Flk-1阳性MSCs同时表达vWF蛋白;部分MSCs具有吞噬Dil-ac-LDL功能;电镜下见MSCs出现分化特征,核质比缩小,细胞器较为丰富,并可见细胞融合现象.结论 HUVECs可以通过细胞间直接接触诱导共培养的MSCs开始向内皮分化;其机制可能与细胞间直接接触促进细胞分泌VEGF以及细胞融合密切相关.     

成体间充质干细胞内皮诱导方法的改进

目的 对现有成体间充质干细胞(MSCs)内皮分化诱导方法 进行改进,以期找到更方便、更价廉并具有优良诱导效果的诱导方法.方法 取生长良好的P3代MSCs,分为3组.诱导1组:以含10%胎牛血清(FCS)、10 μg/L血管内皮生长因子(VEGF)、4 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的低糖DMEM培养基进行内皮诱导14 d;诱导2组:以含10%FCS、20 μg/L VEGF、4 μg/L bFGF的低糖DMEM培养基进行内皮诱导14 d;对照组:以含10%FCS低糖DMEM培养基培养14 d,均于倒置相差显微镜下观察细胞形态及排列方式变化,免疫组化检测Ⅷ因子相关抗原表达,免疫荧光检测CD31表达,透射电子显微镜观察细胞内超微结构.结果培养14 d后,诱导1、2组细胞均变为扁平状,呈"铺路石"样排列,Ⅷ因子相关抗原及CD31均高度表达,阳性率均大于90%,透射电镜发现细胞内有W-P小体形成.而对照组细胞未发现此类改变.结论 联合使用低浓度VEGF及bFGF可使成体MSCs获得内皮系细胞的特征,是一种方便、价廉、有效的诱导方法.     

Proliferation and differentiation of neural stem cells co-cultured with cerebral microvascular endothelial cells after oxygen-glucose deprivation

Various stem cells, including neural stem cells (NSCs), have been extensively studied in stroke models, but how to increase neuronal differentiation rate of NSCs remains unresolved, particu- larly in a damaged environment. The purpose of this study was to investigate the effects of cerebral mi- crovascular endothelial cells (CMECs) on the neurogenesis of NSCs with or without oxygen-glucose deprivation (OGD). The NSCs acquired from primary culture were immunostained to prove cell purity. Survival and proliferation of NSCs were determined after the co-culture with CMECs for 7 days. After removing the CMECs, NSCs were randomly divided into two groups as follows:OGD and non-OGD groups. Both groups were maintained in differentiation culture for 4 days to evaluate the differentiation rate. Mouse embryo fibroblast (MEF) cells co-cultured with NSCs served as control group. NSCs co-cultured with CMECs had an increase in size (on the 7th day:89.80±26.12μm vs. 73.08±15.01 μm, P<0.001) (n=12) and number [on the 7th day:6.33±5.61/high power objective (HP) vs. 2.23±1.61/HP, P<0.001] (n=12) as compared with those co-cultured with MEF cells. After further differentiation culture for 4 days, NSCs co-cultured with CMECs had an increase in neuronal differentiation rate in OGD and non-OGD groups, but not in the control group (15.16% and 16.07% vs. 8.81%; both P<0.001) (n=6). This study provided evidence that OGD could not alter the effects of CMECs in promoting the neuronal differentiation potential of NSCs. These findings may have important implications for the development of new cell therapies for cerebral vascular diseases.     

Astrocytes Facilitate the Growth and Differentiation of Co-cultured Mesenchymal Stem Cells

The effect of astrocytes on the growth and differentiation of co-cultured mesenchymal stem cells （MSCs） was studied. MSCs of Wistar rats were isolated, cultured and labeled with Hoechst33342. The labeled MSCs were co-cultured with astrocytes in DMEM/F12/10%FBS. The growth status and morphologic change of MSCs were observed. The expression of specific protein NeuN, GFAP and CNP was detected by using immunofluorescence staining. The results showed that the two kinds of co-cultured cells grew well. Some labeled MSCs stretched out long processes with spin, triangle and star shapes. Immunofluorescence stain showed that these cells expressed NeuN, GFAP or CNP. It was suggested that astrocytes could promote the prolifevation of co-cultured MSCs and induce them to differentiate into neural like cells.     

大鼠骨髓间充质干细胞内皮分化后诱导同种异体白细胞毒作用

目的探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）内皮分化前后对同种异体白细胞的耐受能力。方法体外分离培养Wistar大鼠骨髓MSCs,传代扩增,使用含50 ng/ml VEGF和2%FBS的内皮分化诱导培养液诱导分化7 d,倒置相差显微镜观察细胞形态,并免疫组化染色方法鉴定内皮细胞特有标记物vWF和FLK-1。通过混合白细胞试验,将MSCs或内皮样分化后的d-MSCs与同种异体Lewis大鼠外周血白细胞（peripheral blood leukocytes,PBLs）共同培养3 d,检测实验组（＋PBLs）和对照组（未加PBLs）上清液中LDH释放量以评价免疫反应程度。结果诱导分化后的d-MSCs细胞形态学上与未分化的MSCs没有明显差异,经免疫组化染色显示d-MSCs表达vWF和FLK-1;MSCs实验组与对照组释放LDH量无统计学差异（P〉0.05）,d-MSCs实验组与对照组释放LDH量有显著性差异（P〈0.05）。结论向内皮细胞分化的d-MSCs诱导了同种异体白细胞毒作用。     

脐带间质干细胞多向分化潜能的鉴定

目的:研究脐带间质干细胞的多向分化潜能,为心血管组织工程研究提供一个新的种子细胞来源?方法:采用胶原酶胰酶消化脐带组织,将获得的细胞传代培养,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,再以不同方法使其向骨?脂肪?心肌和内皮细胞方向诱导,分别采用Von Kossa?油红O染色和免疫组化对分化的细胞进行鉴定?结果:脐带间质干细胞分别向成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,Von Kossa染色和油红O染色阳性?在5-氮胞苷诱导后,心肌特异性抗体肌动蛋白α-actin和肌球蛋白myosin免疫组化染色阳性?在VEGF诱导后,细胞形成网格样结构,免疫荧光示CD31?CD34染色阳性?结论:脐带间质干细胞具有分化为骨?脂肪?心肌和内皮细胞的潜能,是非常有前途的心血管组织工程种子细胞来源?     

骨髓间充质干细胞与胶质瘤细胞非接触共培养后相关生物学特性分析

目的在体外通过大鼠胶质瘤C6细胞与大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)非接触共培养,以探明BMSCs是否受到肿瘤微环境的作用获得肿瘤细胞的相关生物学特性。方法通过6孔板结合Transwell小室建立BMSCs和C6胶质瘤细胞的共培养体系,以共培养组为实验组,设单独培养的BMSCs为对照组;相差显微镜下观察培养后2组细胞形态学的改变;核干细胞因子(nucleostemin,NS)检测细胞增殖力的变化;荧光定量PCR和Western blot检测细胞中mdm2、p53mRNA水平及其蛋白的变化;免疫荧光法检测神经胶质细胞特异的胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)在细胞中的定位及表达。结果共培养后实验组细胞呈现类似胶质瘤细胞样的形态,表达神经胶质细胞特异的GFAP蛋白;NS蛋白反映的细胞增殖能力未发生改变;共培养后实验组p53mRNA水平明显低于对照组(P<0.01),而p53蛋白的表达水平显著高于对照组[(1.63±0.31)vs(0.85±0.12),P<0.05];实验组mdm2mRNA及...     

内皮祖细胞条件培养基对间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制

目的:探讨小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)条件培养基(CM) 对同源间充质干细胞(MSCs)增殖和成骨分化功能的影响,并阐明其作用机制。方法:小鼠骨髓细胞经差速贴壁法结合专用培养基分别培养扩增MSCs和EPCs,采用流式细胞术(FCM)检测MSCs和EPCs表面标记物,以成骨、成脂和成软骨诱导分化对MSCs进行功能鉴定,以成血管对EPCs进行功能鉴定。将MSCs分为0% EPCs-CM组(对照组,采用LG-DMEM培养)、50% EPCs-CM组(采用50% EPCs-CM+50% LG-DMEM培养)和100% EPCs-CM 组(采用100% EPCs-CM培养)。采用MTT比色法检测各组MSCs的增殖活性;采用茜素红染色检测各组MSCs的成骨分化能力。结果:FCM法检测,第3代MSCs高表达Sca-1、CD29, 低表达CD45、CD11b;经诱导可向成骨、成软骨和成脂方向分化。第3代EPCs 高表达CD34、CD133和VEGFR2;在铺有基质胶的96孔培养板中可形成血管样结构。与对照组比较,50% EPCs-CM组和100% EPCs-CM组MSCs增殖活性明显增加,且呈浓度依赖性(P<0.05)。茜草色素红染色法检测,培养21 d后50%和100% EPCs-CM组MSCs的钙结节数量和钙盐沉积均高于对照组(P<0.05)。结论:利用差速贴壁法可同时分离MSCs和EPCs,EPCs-CM能促进MSCs 的增殖和成骨分化。     

观察大鼠血管平滑肌细胞与间充质干细胞直接接触培养对细胞的诱导分化

目的 观察血管平滑肌细胞与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)直接接触对MSCs向血管成分细胞的诱导分化.方法 分别将MSCs(DAPI标记)与血管平滑肌细胞按一定的比例混合直接接触培养;MSCs加血管平滑肌细胞条件培养液或单独常规培养后,用平滑肌细胞抗体SM-α-actin、Calponin及内皮细胞抗体CD31免疫荧光染色,并观察MSCs的细胞形态变化,检测MSCs的分化情况.结果 MSCs与血管平滑肌细胞混合培养3 d后免疫荧光染色,可见胞核蓝染的MSCs与抗SM-α-actin(绿色),抗Calponin、CD31(红色)的双标细胞出现;5 d后阳性表达率增加.而加血管平滑肌细胞条件培养液或常规单独培养的MSCs抗SM-α-actin阳性,抗Calponin、CD31均为阴性.结论 与血管平滑肌细胞直接接触可以诱导MSCs向血管成分细胞分化.