siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠乙肝抗原表达的影响

目的：研究氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的作用,并初步探讨其作用机制。方法：以乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠ＩＣＲ－ＴｇＮ（ＨＢＶａｄｒ１．２）ＳＭＭＵ 为动物模型,运用ＥＬＩＳＡ和免疫组化的方法检测小鼠肝脏内乙肝抗原含量。结果：分别予氧化苦参碱１００, ２００, ３００ ｍ ｇ／ｋｇ 腹腔注射,１次／ｄ,３０ ｄ 后,乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较空白对照组（予等体积生理盐水腹腔注射）均有明显的下降,且对两者作用一致;进一步的研究表明氧化苦参碱２００ ｍ ｇ／ｋｇ 作用１０ ｄ,２０ ｄ 时小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较治疗前有明显的下降。结论：氧化苦参碱能降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量,有抗乙型肝炎病毒作用。     

乳汁成分对乙型肝炎病毒DNA检测的影响

目的探讨乳汁成分对乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)检测的影响以及乙肝病毒DNA在乳汁中的分布情况,为建立可行、标准的乳汁HBVDNA检测方法提供依据。方法建立乳汁成分干扰模型、生理盐水对照模型,比较干扰模型与对照模型中的HBV-DNA检测结果。在HBV-DNA阴性乳汁中掺入高中低值标准HBVDNA阳性血清,分别取样本乳酪层、乳清与沉淀进行HBV-DNA检测。结果乳酪、乳清、沉淀干扰模型分别与盐水对照模型比较差异均有统计学意义(t值分别为3.30、3.00、4.60,P<0.05)。乳酪、乳清、沉淀干扰模型间相互比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。在掺入高值和中值标准血清时,HBV-DNA在乳酪、乳清和沉淀中的测定结果两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),其中沉淀中的测定结果最高,其次为乳清,最低的为乳酪层;在掺入低值标准血清后,除乳酪与沉淀中的HBV-DNA测定结果差异有统计学意义(P<0.05)外,其余差异均无统计学意义(P>0.05)。结论乳汁主要成分对于乳汁样本中HBV-DNA的检测具有干扰作用,使得测定值低于实际值。乳汁样本中HBV-DNA主要存在于沉淀部分,乳清、乳酪中也同时存在HBV-DNA。     

沈阳地区乙型肝炎病毒DNA前C区变异研究

用限制性酶切片段长度多态性分析对沈阳地区７０例血清经巢式聚合酶链反应扩增ＨＢＶ ＤＮＡ阳性的乙型肝炎患者的Ｃ基因前Ｃ区１８９６位点进行分析。结果：（１）急性乙型肝有Ｃ区变异检出率为４％（１／２０），慢性迁延肝炎为２５％（５／２０），慢性活动性肝炎为３８％（５／１３），肝硬化为３３％（４／１２）；（２）ＡＬＴ升高组中，ＨＢｅＡｇ及抗ＨＢｅ均阴性患者和ＨＢｅＡｇ阴性，抗ＨＢｅ阳性患者ＨＢＶ ＤＮＡ前Ｃ     

克隆乙型肝炎病毒DNA在肝与肾细胞中复制与表达的研究

对比研究在外细胞培养系统中乙型肝炎病毒在肝,紧名的复制与表达。方法髟克隆ＨＢＶＤＮＡ分别转染ＨｅｐＧ２与２９３细胞系;ｐ１７７ｔｎ与ｐ３．８Ⅱ还转染了原代人胚肾细胞。培养后收集转染细胞培养上清液,用ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ;提取转染细胞的ＤＮＡ与ＲＮＡ,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ与Ｎｏｒｈｅｒｎ印迹杂交检测细胞内ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢＶＲＮＡ。结果转染ＨｅｐＧ２细胞,ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ均有     

肾组织中乙型肝炎病毒DNA和RNA的存在及其意义

目的 探讨肾组织中乙型肝炎病毒（HBV）DNA和RNA的存在及其致病作用。方法 通过原位杂交检测27例HBV相关肾炎患者肾组织中HBV DNA和RNA的存在和分布情况,探讨HBV在肾组织中的致病机理。结果 患者肾组织中存在HBV和RNA,其分布与HBV抗原基本一致,主要存在于肾小管上皮细胞胞浆和细胞核内,以及肾小球系膜区,毛细血管袢等处;肾小管上皮细胞内HBV DNA和RNA阳性率分别为81．5％、63．0％,显著高于肾小球内的48．1％、25．9％（P＜0．05）。结论 HBV在肾组织,特别是在肾小管上皮细胞中存在并复制。复制时表达的抗原,与来自循环的抗原相似,都可能导致免疫复合物形成或细胞免疫而损伤肾脏致病。肾小管间质病变与小球病变同样决定HBV相关肾炎病情的进展和预后。     

乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达TLR3的影响

目的 乙肝病毒全基因组体外扩增,构建质粒并测序,酶切后瞬时转染HePG2细胞,观察对HBV抗原分泌,病原识别受体Toll样受体3(TLR3)的表达及细胞增殖的影响.方法 长片段PCR法扩增HBV DNA全长,构建pBlueScript-HBV质粒并转化宿主菌,摇菌后提取质粒经测序,用Sap Ⅰ酶切,获得HBV 3.2 kb基因组,采用脂质体瞬时转染HepG2细胞株,IMX检测HBV所分泌抗原,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测表达TLR3的阳性细胞百分率,并与空白对照组对比.结果 HBsAg和HBeAg的分泌随着转染HBV DNA量的增加而升高,除4 μg和6 μg组两组间比较的表面抗原外,差异均有显著性(P＜0.05).TLR3在转染后均有上调,除4 μg与6 μg组间比较外,各组间差异有显著性(P＜0.05).台盼蓝拒染法示细胞存活随转染剂量的升高而减少(P＜0.05),但4 μg和6 μg两组间比较差异无显著意义(P＞0.05).而各转染剂量组HBsAg和e抗原的分泌及细胞的存活数均与TLR3的表达呈显著正相关(P＜0.01).结论 本研究初步表明乙肝病毒可能直接引起HepG2细胞TLR3的上调,而且上调可能启动了细胞的凋亡或坏死机制,成为HBV损伤细胞的非免疫细胞介导机制.     

乙型肝炎患者病毒前S1抗原与病毒DNA的关系探讨

目的探讨乙型肝炎患者病毒前S1抗原与病毒DNA的关系.方法对186例乙型肝炎大三阳患者分别进行前S1抗原和DNA检测,前S1用酶联免疫法,DNA用蛋白印迹法.结果两法的阳性检出率分别为95.2%和88.2%,前S1抗原法检出率略高(RRR>-25%);两法检测结果呈变量关系(γ=0.038,P>0.05).结论作为反映乙肝病毒复制和传染性的血清学标志,前S1抗原和DNA与HBeAg相一致,与非PCR DNA法比较,前S1抗原法灵敏度稍高,可以作为非PCR DNA检测法的加强和补充.     

乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达TLR4的影响

目的探讨乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达Toll样受体4（Toll—likereee-ptor4，ⅡR4）的影响。方法采用免疫荧光流式细胞术检测TLR4在肝癌细胞株HepG2、HepG2-X和HepG2．2．15上表达的平均荧光强度及阳性细胞率，采用荧光定量PCR检测三种细胞TLR4的mRNA水平。结果肝癌细胞株HepG2．2．15上TLR4表达的平均荧光强度及阳性细胞率分别为（18．24±8．18）、（17．79±9．46）％，TLR4mRNA水平为（0．62±0．11），明显高于HepG2-X和HepG2细胞的相应值（P’〈0．001），而HepG2和HepG2-X两者之间的表达则无统计学差异（P〉0．05）。结论乙型肝炎病毒可直接上调细胞TLR4的表达，这种上调是通过乙型肝炎病毒非X基因或蛋白来完成的。     

MxA蛋白对HepG2.2.15细胞HBV复制的影响

目的 分析比较α干扰素(IFN-α)、抗黏液病毒A(MxA)蛋白及IFN-α联合MxA蛋白对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 以肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞为细胞模型,以IFN-α、基因转染表达MxA蛋白及IFN-α与MxA蛋白联合等方式处理细胞,Western blot法检测M...     

HepG2.2.15细胞株中乙型肝炎病毒基因异质性的实验研究

目的以乙型肝炎病毒(HBV)前C/C基因的异质性来探讨在HepG2.2.15细胞体内是否存在HBV准种.方法依据Genebank中HBV ayw亚型全基因序列,选择保守区域设计出特异性多聚酶链反应引物,自HepG2.2.15细胞培养上清液中扩增HBV前C/C基因序列,克隆入pGEM-T Easy载体,挑选15个克隆测序以比较病毒的变异程度.结果测序发现HepG2.2.15细胞HBV前C/C基因存在异质性,碱基序列之间的同源性大于93%,突变类型全部为碱基替换.结论 HepG2.2.15细胞内存在HBV准种.     

Ad-1.2乙型肝炎病毒感染HepG2细胞后HBV cccDNA的动态分析

目的 研究Ad-1.2 HBV感染HepG2细胞后HBV的复制情况.方法 携带1.2拷贝FIBV DNA的腺病毒体外感染人肝癌细胞株HepG2,ELISA法检测培养上清中HBsAg、HBeAg的动态表达;利用质粒抽提试剂盒提取细胞内cccDNA,经绿豆核酸酶处理后,用特异引物进行实时定量PCR检测.结果 Ad-1.2HBV感染HepG2细胞后,可有效表达HBsAg及HBeAg;感染后第1天即可在细胞内检出cccDNA,第4天达到高峰.结论 Ad-1.2HBV感染细胞,可作为抗病毒药物筛选和评价的模型.     

乙型肝炎病毒X蛋白表达及其对HepG2细胞凋亡的影响

目的探讨HBV X蛋白表达对转染x基因HepG2细胞的影响。方法构建真核表达质粒pCDNA3．1（＋）／x，磷酸钙沉淀法转染到人肝癌细胞株HepG2；Western—blot检测X蛋白表达；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率；MTT法测定细胞活力。结果磷酸钙沉淀法能有效的导入X基因且Western—blot能检测到X蛋白表达；MTT法、流式细胞术结果显示X蛋白表达组细胞活力受抑制（P≤0．01），凋亡率增加（P≤0．01）。结论HBV感染及其相关慢性肝病中，X蛋白的表达可能与肝细胞凋亡，炎症活性相关。     

HBV DNA经小鼠精细胞垂直传递的研究

目的 建立乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)垂直传递的小鼠模型,探讨HBV垂直传递的机制.方法 体外培养小鼠精细胞,阳离子转染剂介导HBV DNA转染精细胞,应用聚合酶链反应(PCR)检测小鼠精细胞中HBV DNA的存在,并使用荧光原位杂交技术(FISH)观察HBV DNA在精细胞中的定位;采用精子载体法建立HBV DNA垂直传递小鼠模型,应用PCR和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测新生代小鼠中HBV DNA的存在及表达.结果 PCR检测到被转染的精细胞中有HBV DNA的存在,并且荧光显微镜下部分精子带有黄绿色阳性杂交信号,主要在精子头部的中后部区域两侧和顶部;31只新生代小鼠中11只小鼠检出HBV DNA,其中又有3只检出HBV RNA.结论 为研究乙肝病毒垂直传播的机制建立了理想的HBV DNA垂直传递小鼠模型.     

肝硬变组织内HBV DNA和HBsAg的分布及意义

作者用原位杂交和免疫组织化学PAP法双标记,在51例人肝硬变石蜡组织切片中检测HBV DNA和HBsAg.共检出HBV DNA 21例(41.2％),HBsAg 43例(84.3％),二者同时检出共19例(37.3％).HBVDNA阳性颗粒主要分布于肝细胞的胞浆或同时分布于胞核及胞浆内,少数仅位于核内或沿胞膜内侧分布.51例肝硬变患者中,活动性肝硬变与静止性肝硬变组织中HBV DNA的阳性检出率分别为52.8％和13.3％,HBV DNA和HBsAg二者均阳性的检出率分别为47.2％和13.3％,均以活动性肝硬变为高(P<0.05).结果说明,HBV的感染以及HBV DNA在肝组织中的存在和持续活动是肝硬变发生发展的重要因素之一.     

Toll样受体4在乙型肝炎组织及细胞株HepG2/HepG2.2.15内的表达特征

[目的]探讨Toll样受体4（TLR4）在乙型肝炎组织及细胞株HepG2/HepG2.2.15内的表达特征。[方法]采用免疫组化染色法检测慢性乙型病毒性肝炎（CHB）63例、慢性重型肝炎（CSH）11例及健康对照组10例肝组织TLR4的表达,综合评分法判断结果。常规培养肝癌细胞株HepG2及HepG2.2.15,采用直接免疫荧光流式细胞术（FCM）检测TLR4在细胞上表达的平均荧光强度（MFI）及阳性细胞率。[结果]TLR4在慢性乙型病毒性肝炎及慢性重型肝炎患者肝组织上的表达明显高于健康对照组（P〈0.01）,主要表达于肝细胞胞浆及部分胞膜,在慢性乙型病毒性肝炎中,TLR4的表达强度与肝组织炎症活动度分级（G）呈显著正相关（r=0.632,P〈0.001）。TLR4在肝癌细胞株HepG2.2.15上表达的平均荧光强度及阳性细胞率分别为18.24±8.18、（17.79±9.46）%,明显高于HepG2的2.33±0.41、（1.71±0.77）%（P〈0.001）。[结论]TLR4的表达与乙型病毒性肝炎肝组织的炎症活动密切相关,而乙型肝炎病毒可直接上调细胞TLR4的表达,故TLR4参与了乙型病毒性肝炎发病过程中的免疫反应并极有可能与免疫损伤有关。     

PPN抑制HBV-DNA表达及复制的体外实验

目的：体外观察PPN对HBV－DNA表达、复制的抑制效果及其细胞毒性作用。方法：取10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml PPN水溶液分别加入2.2.15细胞株培养悬液中，8天后用放射免疫法检测上清液中HBeAg的含量，并计算HBeAg抑制率、细胞存活率、HBeAg抑制率为50％时的药物浓度（ID50）、实验组存活细胞为对照组的50％时的药物浓度（CD50）和治疗指数（TI）。PCR技术检测HBV－DNA阳性血清中加入160μg/ml PPN水溶液后对HBV－DNA复制的抑制作用。结果：当加入的PPN浓度为160μg/ml和80μg/ml时，HBeAg抑制率分别为89．8％和82．4％，细胞存活率分别为98．7％和99．2％；HBV－DNA阳性血清中加入PPN后可有效抑制其复制。结论：PPN可有效抑制HBV－DNA的表达和复制，且对靶细胞（肝细胞）无细胞毒作用，有进一步研究和推广应用的价值。