逆转录-聚合酶链反应对肾综合征出血热早期的诊断

为了选择更为敏感,特异,快速的肾综合征出血热（HFRS）的诊断方法。我们建立了碘化钠—异流氰酸胍—氯仿法提取汉坦病毒（HV）核酸（RNA）用于逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同病型HFRS患者一周内血清中HV－RNA且与酶联免疫吸附法（ELISA）检测HFRS-IgM进行比较。45例HFRS患者血清中HV－RNA阳性率为82．2％,其中轻、中、重型阳性中分别为75％,78.5％,86.9％。HFRS-IgM阳性率55．5％,其中轻、中、重型阳性率分别为37.5％,50.0％,65/2％。RI-PCR法检出率高于ELISA法,差别有显著性。RT-PCR法和ELISA法均可以用于HFRS的早明诊断。但前者更为敏感。     

原发性睾丸恶性淋巴瘤克隆性IgH基因重排的检测

目的：探讨原发性睾丸淋巴瘤克隆性IgH基因重排的检测方法。方法：用半巢式PCR方法和聚丙烯凝胶（PAGE）－银染法检测14例睾丸恶性淋巴瘤的IgH基因重排。结果：与免疫组化对照，PCR检测的睾丸原发性B细胞淋巴瘤FR3A检出测率为85.71%，FR2的检出率为64.29%，而二者的综合检出率为100％，互补性较强。结论：半巢式PCR方法及PAGE－银染法对于原发性睾丸细胞淋巴瘤IgH基因的检出率有较高的灵敏度，FR3A和FR2引物的共同应用可以有效提高综合检出率，在目前情况下，应用PCR方法来鉴别恶性淋巴瘤，必须结合HE形态和免疫表型等综合判断。     

孕妇血清CMV—DNA与CMV—IgM的检测与分析

应用聚合酶链式反应（PCR）及酶联免疫吸附实验（ELISA）两种方法．同时对100例门诊优生咨询孕妇进行了血清CMV－DNA及CMV－IgM的检测，结果PCR法的阳性检出率为12％，而ELISA法的阳性检出率为6％，PCR法敏感性较ELISA法高，两者差异显著。     

RT-PCR扩增汉滩病毒及其核苷酸序列的发生树分析

目的：用RT－PCR方法扩增肾综合征出血热病人血样品的汉滩病毒RNA，对扩增产物进行测序并分析汉滩病毒基因组的变异，方法：用引物PⅠ/PⅡ对22例血样品中的汉滩病毒RNA进行第一次PCR扩增，PⅠ/PⅡ扩增样品有再PⅠ1/PⅡ2引物进行槽式RT－PCR扩增，将扩增效果良好的PCR产物进行测序，对测序结果用生物化学软件进行同源性比较和进化树分析，其中HV226样品用引物P1／P2进行RT－PCR扩增。结果：22例肾综合征病人血样品用PⅠ/PⅡ和P1／P2引物扩增有19例阳性，其中编号W613、W1141样品用PⅠ1／PⅡ2进行槽式增后对其扩增产物直接进行测序。HV226号样品用引物P1／P2进行扩增后，其扩增物也直接进行测序，对该3株序列测定结果进行比较分析发现，编号W613、W1141样品核苷酸序列与HV114株的同源性为84％，而与HTN76－118株的同源性为99％，HV226号样品与HV114有95％的同源性，而与HTN76－118有82％的同源性。进化树分析表明，W613，W1141与HTN76－118株立同一分枝，而HV226与HV114、A9株处于同一分枝。结论：湖北地区汉滩病毒至少存在2个亚型，其中W613、W1141与HTN76－118的核苷酸序列高度同源，属于同一亚型，而HV226与HV114属于另一亚型。     

聚合酶链反应杂交ELISA对肝炎患者血清HCV RNA的测定和分析

目的 应用丙型肝炎病毒（HCV）聚合酶链反应杂交酶联法（HCV－PCR－H ELISA）152份各型肝炎血清进行HCV RNA测定和分析。方法 利用标记生物素的寡核苷酸引物对患者血清进行PCR扩增，扩增产物与结合在微孔反应板的HCV特异探针快速杂交，通过抗生物素－酶联反应判定结果。结果 152份肝炎患者中，HCV RNA的检出率为57．9％（88／152），其中抗－HCV阳性组的检出率为81．8％（72／88）。抗－HCV与HCV RNA的总符合率为78．9％（120／152）。对5例丙型肝炎患者应用α干扰素治疗者追访显示，HCVRNA的消长与抗病毒药物疗效一致。结论 HCV－PCR－H ELISA方法简便、稳定、敏感、特异，为半定量指标，可应用于HCV感染的临床诊断和抗病毒药物疗效判定。     

逆转录环介导等温扩增检测风疹病毒RNA方法的建立

目的建立逆转录环介导等温扩增快速检测风疹病毒RNA的方法。方法选取保守基因E1设计引物,建立并优化RT—LAMP反应体系,同时进行特异性和敏感性评估。在此基础上应用建立的方法对46例ELISA检测阳性的孕妇血清标本进行检测,并与RT—PCR相比较。结果建立的方法仅对风疹病毒RNA扩增出特有的梯状条带,酶切结果与预期相符。46例孕妇标本经RT—PCR和RT—LAMP检测,分别检出28例和29例。结论该方法特异性强、敏感性高、简便快速且成本低,有望在临床检测中发挥一定的作用。     

A组轮状病毒一步法RT—PCR检测技术的建立和应用研究

目的 设计A组轮状病毒（RV）的特异性引物,应用Tth酶,建立一步法RT－PCR扩增方案,检测西安地区腹泻幼儿196份粪便标本,并与本室研制建立的反向间接血凝法（RPHA）,聚丙烯酰胺凝胶电泳,市售ELISA试剂盒平行检测对比分析。方法 设计并合成第九基因序列保守区互补的特异性引物,在经典法RT－PCR试验成功的基础上,建立合理的一步法RT－PCR＞要四种检测结果阳性率分别为33．16％,23．47％,21．94％和25％,X^2检验表明,RT－PCR最为敏感。结论 反转录和PCR由Tth酶一步完成,克服了经典法中AMV、RNasin等试剂昂贵,操作繁锁等缺点,很适合临检需要。     

应用PCR检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卜啉单胞菌及感染菌株基因型的分析

目的 建立慢性牙周炎（CP）龈下标本中牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg)的PCR检测方法，了解不同患牙龈下菌斑中Pg基因型的差异。方法 采用培养法分离不同患牙龈下菌斑中Pg，同时采用PCR进行Pg 16S rDNA基因、prtC基因和fimA基因的检测。部分扩增产物T－A克隆后测定核苷酸序列。结果 61例患者122个龈下菌斑标本中，Pg 16S rDNA、prtc和fimA分别扩增的阳性率依次为90．6％、81．9％和78．0％，联合扩增的阳性率高达98．4％，培养法阳性率仅为31．1％。30．0％（18／60）患者不同牙位龈下菌斑中的Pg基因型不一致。Pg 16S rDNA、prtC和fimA扩增片段与文献报道的核苷酸序列比较，同源性98．62％－100％。结论 所建Pg PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性，可用于慢性牙周炎龈下标本中Pg的快速临床诊断。部分CP患者可被不同基因型的Pg菌株同时感染。     

兰州地区5岁以下婴幼儿病毒性腹泻的分子流行病学研究

目的调查兰州地区5岁以下婴幼儿病毒性腹泻的流行情况,了解四种主要腹泻病毒在儿童中的分布情况。方法采集2009年7月至2010年6月兰州大学第一医院儿科5岁以下腹泻患儿粪便标本290份及儿童保健中心健康婴幼儿正常粪便标本114份,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测轮状病毒抗原,采用巢式聚合酶链反应对轮状病毒阳性标本进行分型;采用反转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测杯状病毒和星状病毒,聚合酶链反应（PCR）检测腺病毒。结果290份腹泻标本中四种病毒的阳性率分别为：轮状病毒39．31％,杯状病毒11．38％,腺病毒10．69％,星状病毒4．83％;对114份轮状病毒阳性标本G、P分型,G3型及P[8]型为优势株;114份正常标本轮状病毒检出率为0,杯状病毒检出7例,星状病毒检出1例,腺病毒检出5例。结论病毒性病原在兰州地区婴幼儿腹泻中占有重要地位,长期系统的监测具有重要意义。     

HCV E1基因序列的原核高效表达及表达产物的初步应用

目的 在原核表达系统中对HCV E1基因进行克隆和高效表达,并初步探讨表达产物在抗－HCV筛选中的作用。方法 通过RT－PCR法从HCV RNA阳性的血清标本中扩增出HCV E1片段,并在扩增用的引物中引入克隆所需的酶切位点,克隆产物经Xba I和EcoR I酶切后,在T4DNA连接酶的作用下克降人经同样双酶切的原核表达载体PMS－31b中,并用此连接产物转化大肠埃杀菌POP2136,挑取具有氨苄抗性的菌东扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定,鉴定出的阳性菌经42℃诱导后用SDS－PAGE检查其表达状况,并用Western blot鉴定表达产物有特异性,同时用初步纯化的表达产物用ELISA法检测病人血清。结果 经Sma I酶切后PCR产物被切成144bp和356bp的两个片段,在具有氨苄抗性的菌中提取的质粒经Sma I和Xba I酶切后产生了一356bp的片段;42℃诱导后在SDS－PAGE中出现了一条相对分子质量为31000的条带,其表达量约为17％,经Western blot鉴定后在该处出现了阳性信号;ELISA实验显示在抗HCV阳性的血清中的阳性率约为29．8％（26／90）,而在抗HCV阴性的 血清中其阳性率约为3．9％（3／76）。结论 通过RT－PCR方法将HCV E1基因从HCV RNA阳性的血清标本中调出,构建了HCV E1的原核表达载体－PMS－E1,其表达量为17％,表达产物具有良好的特异性,有望应用于抗HCV的检测中。     

Performance of an RT-nested PCR ELISA for detection of Newcastle disease virus

A sensitive and specific RT-nested PCR coupled with an ELISA detection system for detecting Newcastle disease virus is described. Two nested pairs of primer which were highly specific to all the three different pathotypes of NDV were designed from the consensus fusion gene sequence. No cross-reactions with other avian infectious agents such as infectious bronchitis virus, infectious bursal disease virus, influenza virus, and fowl pox virus were observed. Based on agarose electrophoresis detection, the RT-nested PCR was about 100 times more sensitive compared to that of a non-nested RT-PCR. To facilitate the detection of the PCR product, an ELISA detection method was then developed to detect the amplified PCR products and it was shown to be ten times more sensitive than gel electrophoresis. The efficacy of the nested PCR-ELISA was also compared with the conventional NDV detection method (HA test) and non-nested RT-PCR by testing against a total of 35 tissue specimens collected from ND-symptomatic chickens. The RT-nested PCR ELISA found NDV positive in 21 (60%) tissue specimens, while only eight (22.9%) and two (5.7%) out of 35 tissue specimens were tested NDV positive by both the non-nested RT-PCR and conventional HA test, respectively. Due to its high sensitivity for the detection of NDV from tissue specimens, this PCR-ELISA based diagnostic test may be useful for screening large number of samples.     

比较PCR酶免法与套式PCR法在不孕症中沙眼衣原体的临床检测

目的 比较PCR酶免法(PCR—ELISA)与套式PCR法(nPCR)法检测沙眼衣原体(CT)在不孕症宫颈分泌物中的临床意义。方法 应用PCR-ELISA法对185份宫颈分泌物进行CT检测，nPCR法对l12份宫颈分泌物进行CT检测，两种方法同时对38份宫颈分泌物进行检测，两种方法的检测结果进行对比分析。结果 PCR-ELISA法，CT阳性率为36．22％，(67／185)。nPCR法检到法CT阳性率为19.64％(22／112)两种方法同时检测的CT阳性率分别为34.21％及13．16％。PCR-ELISA与nPCR法比较差异有显著性(P＜0.05)。结论 PCR—ELISA法检测CT比nPCR法更敏感，特异，简单，并且没有EB污染等优点，结合临床治疗结果分析更适用于对长期慢性CT感染不孕症的诊断。     

深圳市HFRS疫源地鼠携带汉坦病毒与人感染汉坦病毒的基因特征对应性研究

目的 了解深圳市肾综合征出血热(HFRS)疫源地鼠携带汉坦病毒与人感染汉坦病毒二者的病原学特征及联系,为HFRS的防控提供科学依据.方法 收集疑似HFRS病人急性期血清标本,并在相同区域开展笼日法捕鼠,无菌取鼠肺.分别采用ELISA和直接免疫荧光法筛选阳性标本,选择代表性血清标本以及鼠肺标本进行逆转录-套式聚合酶链反应(RT-nested PCR)扩增部分M和S片段及核苷酸序列测定,与国内外的汉坦病毒毒株一起进行同源性比对和系统进化树分析.结果 472份鼠肺经直接免疫荧光检测共获得阳性鼠肺47份,带毒率为9.96%.对60份IgM抗体阳性的血液标本进行RT-nested PCR扩增,检出12份阳性,阳性率为20%.从代表性的8份鼠肺和8份病人血清中提取的标本二者之间M片段核苷酸序列的同源性高达95%以上,S片段之间的同源性高达96.5%以上.其推导的氨基酸序列同源性分别为98.0%～100%、98.4%～100%.深圳市HFRS疫源地鼠携带的汉坦病毒和人感染汉坦病毒均为汉城型S2亚型.结论 深圳市流行的汉坦病毒为SEO型S2亚型.无论是同一地区的鼠和人之间,还是不同地区的鼠和人之间,汉坦病毒都是具有较高的同源性.     

河北省人感染汉坦病毒G2片段基因分型及序列特征分析

目的 了解河北省人感染汉坦病毒的基因型和基因亚型.方法 根据76～118株和R22株的C2编码区设计型特异性引物,利用RT-nested PCR技术对采集的HFRS患者中汉坦病毒抗体阳性的血清标本进行检测及基因分型,从中选取部分标本的扩增产物纯化回收后进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件包进行基因分析.结果 69份阳性血清标本经RT-nested PCR检测17份阳性,检出率为24.64%,其中≤7 d的标本检出率为34.29%,8～14 d的检出率为19.23%,≥14 d的未能检出.17份阳性标本均为SEO型.对其中9份扩增产物的G2区测序后表明,9份血清标本的同源性为92.0%～100.0%,其中HeB7与其他8份标本的同源性为92.0%～95.0%,属不同亚型,与R22的同源性为97.7%,同属于S1亚型;除HeB7外其余8份标本同源性高达95.7%～100%,同属于S3亚型.9份标本与76～118株的同源性仅为70.3%～72.7%.结论 河北省人感染汉坦病毒以SEO型为主,亚型以S3为主,也存在S1亚型.在一定范围内,同型汉坦病毒基因相对保守,具有区域稳定性特征.     

河北省鼠携带汉坦病毒G2片段基因分型及序列特征分析

目的 了解河北省肾综合征出血热(HFRS)疫源地宿主动物所携带汉坦病毒的基因型和基因亚型.方法 根据76-118株和R22株的保守序列设计型特异性引物,用RT-nested PCR从IFA筛选的阳性鼠肺中扩增部分M片段,经琼脂糖凝胶电泳进行基因分型,并从中选取部分扩增产物纯化回收后进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件包进行基因分析.结果 32份经IFA筛选阳性的鼠肺标本经RT-nested PCR扩增出418bp特异性目的 片段,均为SEO型.10份扩增产物测序结果 表明G2片段变异不大,同源性高达98.0%～100%,与R22株和76-118株的同源性分别为93.3%～94.3%和67.7%～69.0%.结论 依据G2片段,河北省HFRS疫源地汉坦病毒基因型以SEO型病毒为主,主要为S3亚型,同亚型病毒基因高度同源,遗传物质相对稳定.不同鼠种可携带同亚型汉坦病毒.     

河北省鼠携带汉坦病毒G2片段基因分型及序列特征分析

目的 了解河北省肾综合征出血热(HFRS)疫源地宿主动物所携带汉坦病毒的基因型和基因亚型.方法 根据76-118株和R22株的保守序列设计型特异性引物,用RT-nested PCR从IFA筛选的阳性鼠肺中扩增部分M片段,经琼脂糖凝胶电泳进行基因分型,并从中选取部分扩增产物纯化回收后进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件包进行基因分析.结果 32份经IFA筛选阳性的鼠肺标本经RT-nested PCR扩增出418bp特异性目的 片段,均为SEO型.10份扩增产物测序结果 表明G2片段变异不大,同源性高达98.0%～100%,与R22株和76-118株的同源性分别为93.3%～94.3%和67.7%～69.0%.结论 依据G2片段,河北省HFRS疫源地汉坦病毒基因型以SEO型病毒为主,主要为S3亚型,同亚型病毒基因高度同源,遗传物质相对稳定.不同鼠种可携带同亚型汉坦病毒.     

河北省鼠携带汉坦病毒G2片段基因分型及序列特征分析

目的 了解河北省肾综合征出血热(HFRS)疫源地宿主动物所携带汉坦病毒的基因型和基因亚型.方法 根据76-118株和R22株的保守序列设计型特异性引物,用RT-nested PCR从IFA筛选的阳性鼠肺中扩增部分M片段,经琼脂糖凝胶电泳进行基因分型,并从中选取部分扩增产物纯化回收后进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件包进行基因分析.结果 32份经IFA筛选阳性的鼠肺标本经RT-nested PCR扩增出418bp特异性目的 片段,均为SEO型.10份扩增产物测序结果 表明G2片段变异不大,同源性高达98.0%～100%,与R22株和76-118株的同源性分别为93.3%～94.3%和67.7%～69.0%.结论 依据G2片段,河北省HFRS疫源地汉坦病毒基因型以SEO型病毒为主,主要为S3亚型,同亚型病毒基因高度同源,遗传物质相对稳定.不同鼠种可携带同亚型汉坦病毒.     

河北省鼠携带汉坦病毒G2片段基因分型及序列特征分析

目的 了解河北省肾综合征出血热(HFRS)疫源地宿主动物所携带汉坦病毒的基因型和基因亚型.方法 根据76-118株和R22株的保守序列设计型特异性引物,用RT-nested PCR从IFA筛选的阳性鼠肺中扩增部分M片段,经琼脂糖凝胶电泳进行基因分型,并从中选取部分扩增产物纯化回收后进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件包进行基因分析.结果 32份经IFA筛选阳性的鼠肺标本经RT-nested PCR扩增出418bp特异性目的 片段,均为SEO型.10份扩增产物测序结果 表明G2片段变异不大,同源性高达98.0%～100%,与R22株和76-118株的同源性分别为93.3%～94.3%和67.7%～69.0%.结论 依据G2片段,河北省HFRS疫源地汉坦病毒基因型以SEO型病毒为主,主要为S3亚型,同亚型病毒基因高度同源,遗传物质相对稳定.不同鼠种可携带同亚型汉坦病毒.     

河北省鼠携带汉坦病毒G2片段基因分型及序列特征分析

目的 了解河北省肾综合征出血热(HFRS)疫源地宿主动物所携带汉坦病毒的基因型和基因亚型.方法 根据76-118株和R22株的保守序列设计型特异性引物,用RT-nested PCR从IFA筛选的阳性鼠肺中扩增部分M片段,经琼脂糖凝胶电泳进行基因分型,并从中选取部分扩增产物纯化回收后进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件包进行基因分析.结果 32份经IFA筛选阳性的鼠肺标本经RT-nested PCR扩增出418bp特异性目的 片段,均为SEO型.10份扩增产物测序结果 表明G2片段变异不大,同源性高达98.0%～100%,与R22株和76-118株的同源性分别为93.3%～94.3%和67.7%～69.0%.结论 依据G2片段,河北省HFRS疫源地汉坦病毒基因型以SEO型病毒为主,主要为S3亚型,同亚型病毒基因高度同源,遗传物质相对稳定.不同鼠种可携带同亚型汉坦病毒.