大鼠肝卵圆细胞的增殖模型建立和体外分离培养、诱导分化研究

目的 建立大鼠肝卵圆细胞(HOC)的增殖模型,探讨分离培养及鉴定HOC的方法.方法 采用2-乙酰氨基芴/部分肝切除术刺激建立成体大鼠肝卵圆细胞增殖模型,于肝切除术后第12天切取剩余肝脏,使用胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞,免疫荧光技术和KT-PCK分析法检测肝卵圆细胞标志物mRNA表达.行体外培养并添加干细胞生长因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)诱导其分化.结果 分离得到的肝卵圆细胞存活率达到90%,经c-kit免疫荧光显色,PCR 分析显示有CK19和白蛋白mRNA表达.生长因子诱导下有向胆管细胞和肝细胞分化的特性.结论 肝卵圆细胞分离纯化及鉴定方法和肝卵圆细胞成功培养,为进一步研究肝干细胞生物学特性和与肝癌的关系提供了物质基础.     

人肝病变组织低分子量角蛋白CK19的表达

目的研究低分子量角蛋白CK19在人肝细胞癌、肝癌前病变、肝硬化组织中的表达状况及意义。方法采用免疫组织化学SP法检测56例肝细胞癌、8例肝硬化及9例正常肝组织中CK19的表达。结果56例肝细胞癌组织中26例CK19表达阳性,显著高于对照组(P<0.001),癌组织CK19多分布于腺样型或梁索型肝细胞癌。癌旁不典型增生组中异型增生细胞及卵圆细胞的CK19表达率(51.9%)显著高于癌旁非不典型组中肝细胞的表达率(17.2%),但与肝癌组织的表达率差别不大。肝硬化组中CK19的表达率为37.5%(3/8),阳性细胞均为卵圆细胞及异型增生细胞。结论肝细胞癌和增生的卵圆细胞及异型增生肝细胞表达CK19,提示CK19可做为判断肝细胞异型增生的一个指标。肝细胞癌CK19表达与其组织学类型有密切关系。     

小鼠肝脏中细胞角蛋白19阳性细胞的肝向分化特性

目的 明确小鼠肝脏中的细胞角蛋白19 (cytokeratin 19,CK19)阳性(CK19+)细胞是否可分化为成熟肝细胞.方法 利用CK19CreERT小鼠和Rosa26-GFP小鼠杂交得到CK19CreERT/Rosa26-GFP双转基因小鼠,注射他莫昔芬(tamoxifen,TM)后检测小鼠肝脏中CK19+细胞的GFP标记情况.在此基础上分别构建3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-2,4,6-三甲基吡啶和四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)肝脏损伤模型,采用肝脏组织冰冻切片结合免疫荧光染色检测肝脏中GFP标记的CK19+细胞的分化情况.结果 获得CK 19CreERT/Rosa26-GFP双转基因小鼠,免疫荧光染色结果显示CK19+细胞可被GFP标记.在DDC肝脏损伤模型小鼠中检测到增生性小胆管内有GFP+细胞,这些GFP+细胞表达胆管上皮细胞标志物CK19,且DDC肝损伤模型小鼠中GFP+胆管细胞比例高于未损伤对照组[(63.5±6.3)％ vs (53.6±4.8)％,P＜0.05];在CCl4肝损伤模型组小鼠中检测到肝脏实质细胞中有GFP+细胞,这些GFP+细胞表达成熟肝细胞标志物白蛋白(ALB),且CCl4肝损伤模型组小鼠肝脏中GFP+细胞比例高于未损伤对照组[(0.15±0.02)％vs (0.008±0.003)％,P＜0.01].结论 小鼠肝脏内的CK19+细胞群体中存在具有肝向分化潜能的前体细胞,可能为真正的肝干细胞的识别鉴定提供一个新线索.     

人胰腺干细胞的体外分离培养、鉴定和分化特性

目的：体外分离培养人胰腺干细胞，进行鉴定并初步观察其分化为胰岛内分泌细胞的能力。方法：用酶消化法从人胎儿胰腺分离胰腺干细胞，培养并传代，应用胰腺干细胞特异性标志物CK－19、胰岛β细胞特异性成分胰岛素和α细胞特异性成分胰高血糖素的抗体进行免疫细胞化学染色鉴定细胞种类和分化特性。结果：分离培养的人胎儿胰腺干细胞呈梭形，最初1周生长较慢，以后增殖较快，约培养3周后即可传代培养。传代细胞约生长2周即可再次传代，免疫细胞化学染色显示细胞呈CK－19免疫阳性反应。经诱导分化后，细胞形成类胰岛样组织，此时免疫细胞化学染色显示部分细胞呈随岛素免疫阳性反应，少数细胞呈胰高糖素免疫阳性反应。结论：人胰腺干细胞能在体外培养条件下快速增殖，并具有多向分化潜能，能分化形成胰岛β细胞和α细胞。     

免疫磁珠法分选人脑胶质瘤干细胞的体外培养及鉴定

目的:旨在从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞、进行体外培养并对其干细胞特性加以鉴定,以期对后续个体化敏感药物化疗奠定基础。方法:采用以CD133为标志的免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外培养,通过免疫荧光技术检测干细胞标志物CD133、Nestin,干细胞特性加以鉴定。结果:新鲜人脑胶质母细胞培养得到悬浮生长的肿瘤干细胞球,其能在体外自我更新、增殖,形成新的克隆性细胞球,保持连续稳定的传代,能表达神经干细胞表面标志物CD133。在含血清培养基中能够分化为与原肿瘤组织相似的贴壁生长的细胞。结论:胶质母瘤细胞株中存在的一小部分CD133+胶质瘤细胞具有干细胞的属性,并能稳定传代增生。     

脐带间充质干细胞对干燥综合征患者外周血的免疫调控研究

目的:研究脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对干燥综合征(SS)患者外周血的免疫调节作用。方法:取新生儿脐带组织分离并培养UC-MSCs,流式细胞术检测UC-MSCs的细胞表面标记;选取20例疾病活动期的SS患者,收集静脉血提取外周血单个核细胞(PBMC),将SS患者的PBMC与UC-MSCs共培养,CCK-8法检测细胞存活率,筛选最优共培养细胞比例进行后续实验;流式细胞术检测共培养后SS患者PBMC中淋巴细胞亚群的变化情况。结果:UC-MSCs可降低SS患者PBMC中的外周血CD3⁺ T细胞、CD3⁺CD8⁺ T细胞以及CD19⁺ B细胞的比例,而CD16⁺ CD56⁺ NK细胞比例、CD3⁺ CD4⁺T细胞比例、CD4⁺/CD8⁺无明显变化。结论:UC-MSCs可以调节SS患者的免疫功能,从而对SS有一定的治疗作用。     

大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究

目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.     

宫颈癌预后与泛素蛋白1及免疫细胞群表达特征的关联性

目的 研究宫颈癌患者外周血免疫细胞群及癌组织内泛素蛋白1(UBQLN1)表达水平与其预后的关系。方法将2018年6月至2020年1月在晋城大医院行宫颈癌根治术联合术后规范化治疗的98例宫颈癌患者纳为观察组，同时将同期于同一医院行健康体检的60例同年龄段女性纳为对照组。术前采集2组研究对象外周静脉血，检测CD4⁺T、CD8⁺T细胞以及CD28⁺T细胞表达水平，并于术中收集观察组患者宫颈癌及癌旁组织，采用免疫组化法检测UBQLN1表达水平。随访至2022年1月，统计观察组患者宫颈癌复发率。分析外周血免疫细胞群及宫颈癌组织内BUQLN1表达水平与其临床病理特征及预后之间的关系。结果 观察组外周血CD8⁺T细胞占比高于对照组，CD4⁺/CD8⁺比值低于对照组，观察组宫颈癌组织内UBUQLN1阳性率高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌临床分期为ⅡA期的患者外周血CD4⁺T细胞占比以及CD4⁺/CD...     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化肝样细胞

目的观察骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝样细胞。方法自大鼠的股骨中提取骨髓细胞,利用 Percoll 法行骨髓间充质干细胞分离、纯化。取第3代的骨髓间充质干细胞,应用肝细胞生长因子(HGF)20ng/ml 表皮生长因子(EGF)1.5μg/ml 联合诱导。两周后免疫荧光染色及逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)鉴定诱导后细胞白蛋白的 mRNA 的表达。结果诱导分化一周骨髓间充质干细胞变为圆形,两周后免疫荧光染色可见肝细胞标志物 CK18和白蛋白表达,RT-PCR 检测有白蛋白的 mRNA 的表达。结论骨髓间充质干细胞体外诱导能定向分化为肝样细胞。     

人肝病变组织低分子量角蛋白CK19的表达

目的 研究低分子量角蛋白CK19在人肝细胞癌、肝癌前病变、肝硬化组织中的表达状况及意义。方法 采用免疫组织化学SP法检测56例细胞癌、8例肝硬化及9例正常肝组织中CK19的表达。结果 56例肝癌旁不典型增生组中异型增生细胞及卵圆细胞的CK19表达率（51.9%)显著高于癌旁非不典型组中肝细胞的表达率（17.2%),但与肝癌组织的表达率差别不大。肝硬化组中CK19的表达率为37.5(3/8)阳性细胞均为卵圆细胞及异型增生细胞,结论 肝细胞癌和增生的卵圆细胞及异型增生肝细胞表达CK19,提示CK19可做为判断肝细胞异型增生的一个指标,肝细胞癌CK19表达与其组织学类型有密切关系。