TNF-α激活RhoA/ROCK信号通路增加单核细胞增生性李斯特菌感染内皮细胞的通透性

目的探讨大鼠肉瘤同源基因A/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(RhoA/ROCK)信号通路在肿瘤坏死因子α(TNF-α)促进单核细胞增生性李斯特(Lm)感染致内皮细胞通透性升高的调控作用。方法培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为未感染细胞对照组、 TNF-α处理组(100 ng/mL TNF-α处理2 h)、 Lm感染组(以MOI=10的Lm感染2 h,加入庆大霉素杀菌0.5 h)、 TNF-α处理的Lm感染组(Lm感染组细胞加入100 ng/mL TNF-α处理2 h)、 Y-27632联合TNF-α处理的Lm感染组(细胞用50μmol/L ROCK抑制剂Y-27632处理30 min,再如上进行Lm感染和TNF-α刺激)。Western blot法检测HUVEC的RhoA、闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)、 ROCK蛋白水平,检测辣根过氧化物酶(HRP)渗漏量分析HUVEC通透性变化,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鬼笔环肽染色检测纤维型肌动蛋白(F-actin)细胞骨架的改变。结果 TNF-α可降低Lm感染的内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、 occludin的表达,促进其通透性升高、细胞骨架重排,并上调RhoA和ROCK的表达。ROCK抑制剂Y-27632可明显抑制TNF-α所致的HUVEC细胞骨架重排及通透性增高的作用。结论 TNF-α促进感染Lm的血管内皮细胞通透性增高可能通过RhoA/Rock信号通路调控。     

大鼠肺动脉平滑肌细胞Rho激酶对 p-Smad1核迁移的作用及机制

目的: 研究Rho激酶对p-Smad1核迁移的作用及信号转导途径,探讨它们在肺血管重构中的作用机制。方法: 分离培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,应用血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)启动肺动脉平滑肌细胞Rho激酶信号通路,应用骨形态发生蛋白2(BMP-2)启动BMP信号通路,并用Rho激酶抑制剂Y-27632、MEK抑制剂U0126进行干预。培养细胞分成5组:(1)对照组;(2)BMP-2组;(3)BMP-2+PDGF-BB组;(4)BMP-2+PDGF-BB+Y-27632组;(5)BMP-2+PDGF-BB+U0126组。免疫荧光染色标记p-Smad1在细胞核内外的分布并计算p-Smad1核迁移阳性细胞百分数(即核迁移率)。分离平滑肌细胞核蛋白和胞浆蛋白,Western blotting分析p-Smad1在细胞内的总量和细胞核内外相对含量的变化。Kit-WST-8试剂盒检测细胞增殖。结果: BMP-2组p-Smad1在细胞内的总量、在细胞核中的相对含量和核迁移率明显高于对照组(P<0.05);BMP-2+PDGF-BB 组p-Smad1的核迁移率和在细胞核中的相对含量明显低于BMP-2组(P<0.05),但是细胞内p-Smad1总量无明显改变(P>0.05);BMP-2+PDGF-BB+ Y-27632组和BMP-2+PDGF-BB+U0126组细胞内p-Smad1的总量、在细胞核中的相对含量和核迁移率与BMP-2组基本相似(P>0.05)。BMP-2组的A值明显小于对照组(P<0.05);PDGF-BB+BMP-2组的A值明显大于BMP-2组(P<0.05)且大于对照组(P<0.05);BMP-2+PDGF-BB+Y-27632组和BMP-2+PDGF-BB+U0126组的A值均小于PDGF-BB+BMP-2组(P<0.05)。结论: 在大鼠肺动脉平滑肌细胞,PDGF-BB激活的Rho激酶通过MEK/ERK1/2抑制BMP-2引起的p-Smad1核迁移,促进平滑肌细胞增殖。     

TIMP-3基因瞬时表达对兔血管平滑肌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的 观察特异性金属蛋白酶组织抑制剂-3(TIMP-3)基因瞬时表达对血管平滑肌(VSMC)增殖迁移及凋亡的影响.方法 通过阳离子脂质体介导TIMP-3重组质粒转染体外VSMC,将细胞分为对照组、空质粒组及重组质粒载体组.(1)转染后24、48和72 h进行细胞计数、检测MMP-2含量及TIMP-3 mRNA水平;(2)转染后48 h分别检测细胞凋亡率及细胞迁移数.结果 对照组各项观察指标与空质粒组相比均无显著性差异;重组质粒组与两者相比细胞生长缓慢,MMP-2含量明显降低,TIMP-3 mRNA表达旺盛,细胞迁移明显减少,细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论 TIMP-3能明显抑制体外VSMC的增殖和迁移并能促进细胞凋亡.     

右美托咪定减轻呼吸机相关性肺损伤模型大鼠肺组织损伤

目的 探讨右美托咪定(DEX)对呼吸机相关性肺损伤(VILI)大鼠肺组织Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho激酶1(ROCK1)信号通路的影响。方法 建立VILI大鼠模型,将大鼠分为对照组(control组)、模型组(VILI组)、右美托咪定低、高剂量组(DEX-L、DEX-H组)、右美托咪定高剂量+溶血磷脂酸(LPA)组(DEX-H+LPA组)。测定大鼠肺组织湿/干质量比值(W/D);HE染色观察肺组织病理形态;ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的水平;TUNEL染色法检测肺上皮细胞死亡;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白及RhoA、ROCK1表达水平。结果 DEX可以减轻VILI大鼠肺损伤,降低肺损伤评分、W/D、细胞凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK、α-SMA表达(P<0.05),升高Bcl-2表达(P<0.05);LPA可以促使大鼠肺损伤加重,肺损伤评分、W/D、细胞凋亡...     

MiR-126 通过MAPK 信号通路抑制oxLDL 处理的血管平滑肌细胞增殖和迁移

目的:探索miR-126 对oxLDL 处理的血管平滑肌细胞(VSMC)生物学功能的影响及其分子机制。方法:采用oxLDL 处理人主动脉血管平滑肌细胞建立模型。实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-126 表达。CCK-8 实验检测细胞增殖。Transwell 实验分析细胞迁移。免疫印迹分析增殖标记蛋白细胞增殖核抗原-67(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、迁移标记蛋白基质金属蛋白酶9(MMP-9)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK 和p-JNK 的表达。结果:模型组的miR-126 表达显著低于对照组(P<0.01)。与模型组相比,miR-126 mimic 组miR-126 表达极显著升高(P<0.001)。模型组和mimic control 组细胞增殖倍数明显高于对照组(P<0.05)。与模型组相比,miR-126 mimic 组细胞增殖倍数明显降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组和mimic control 组细胞迁移能力大大提高(P<0.001)。miR-126 mimic 组细胞迁移显著低于模型组(P<0.01)。模型组和mimic control 组细胞增殖标记蛋白Ki-67和PCNA,迁移标记蛋白MMP-9 和VEFG 表达显著高于对照组(P<0.01)。与模型组相比,miR-126 mimic 组增殖标记蛋白Ki-67 和PCNA 及迁移标记蛋白MMP-9 和VEFG 表达明显减弱(P<0.05)。而且,与对照组相比,模型组和mimic control 组中p-ERK1/2/ ERK1/2、p-p38/ p38、p-JNK/ JNK 的相对蛋白表达量的比值显著升高(P<0.01)。miR-126 mimic 组p-ERK1/2/ ERK1/2、p-p38/ p38、p-JNK/ JNK 的相对蛋白表达量的比值则明显低于模型组(P<0.05)。与对照组相比,模型组Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF 表达明显升高(P <0.05)。与模型组相比,miR-126 mimic 组Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF 表达明显降低(P <0.05);Anisomycin 组Ki-67、PCNA、MMP-9、VEGF 表达明显升高(P<0.05)。miR-mimic+ Anisomycin 组Ki-67、PCNA、MMP-9 和VEGF表达与模型组无明显差异。结论:MiR-126 通过MAPK 信号通路抑制oxLDL 处理的血管平滑肌细胞增殖和迁移。     

ROCK对系统性红斑狼疮患者外周血T细胞黏附和迁移的调控

 目的：研究系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血T细胞中Rho激酶（ROCK）活化情况,并探讨其对T细胞黏附和迁移的影响。方法：收集SLE患者33例,正常健康人12例和类风湿关节炎患者9例作为对照组。外周血T细胞分离采用RosettSep T细胞提取试剂盒提取,ROCK活性用磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基1（MYPT1）蛋白表达来表示,磷酸化MYPT1蛋白检测采用免疫印迹法,T细胞迁移采用Transwell小室测定。结果：新鲜分离的SLE患者外周血T细胞ROCK活性均显著高于正常对照组和类风湿关节炎组（均P<0.05）。SLE患者T细胞体外黏附和迁移能力显著高于正常对照组;ROCK特异性抑制剂Y27632显著抑制SLE患者T细胞黏附和迁移。结论：SLE患者存在T细胞ROCK活化异常;ROCK可能参与调控SLE T细胞的黏附和迁移;抑制T细胞异常的ROCK活性可能有助于SLE的治疗。     

T-bet质粒基因转染对哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液白细胞介素13和内皮素1的影响

目的 观察气道内T-bet质粒基因转染对哮喘小鼠气道肺泡灌洗液白细胞介素13(IL13)、内皮素1(ET-1)的影响.方法 C57BL/6J小鼠32只,完全随机分为4组(n=8),即哮喘模型组(A组)、正常对照组(B组)、空质粒干预组(C组)和模型T-bet质粒干预组(D组).用卵白蛋白(OVA)抗原溶液小鼠腹腔注射致敏,滴鼻造模.B组用生理盐水代替卵白蛋白,C组和D组卵白蛋白激发48 h前,分别经鼻滴入50μg空质粒或重组T-bet质粒.免疫印迹检测和酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠的支气管肺泡灌洗液中IL-13、ET-1的水平.结果 哮喘模型组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中Th2因子IL-13和ET-1水平比正常对照组升高[(2.32±0.40)ng/L比(0.38±0.16)ng/L,(40.07±6.52)ng/L比(14.16±0.51)ng/L,均P＜0.05];模型T-bet质粒干预组BALF中Th2因子IL-13和ET-1水平[(1.16±0.19)和(23.08±2.59)ng/L]比哮喘模型组降低(均P＜0.05).结论 气道内转染T-bet质粒能有效下调小鼠BALF中Th2因子IL-13及ET-1水平.     

PDGF-BB、IL-13和TGF-β1诱导真皮成纤维细分泌Ⅰ型胶原蛋白的比较

目的用不同浓度的白介素13(IL-13)、转化生长因子β1(TGF-β1)和血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)在体外诱导真皮成纤维细胞,以甄选促进诱导Ⅰ型胶原蛋白高分泌的细胞因子。方法选用出生2d的SD大鼠背部皮肤进行真皮成纤维细胞原代培养,采用免疫荧光技术对其进行纯度鉴定。实验分为4组:PDGF-BB(30ng/mL)组、IL-13(100ng/m)组、TGF-β1(10ng/mL)组和不加任何处理因素的阴性对照组,用MTT法、ELISA检测在24h、48h、72h时的真皮成纤维细胞的增殖情况及培养液中Ⅰ型胶原蛋白的浓度。结果原代培养真皮成纤维细胞的纯度达90%以上。PDGF-BB、IL-13、TGF-β1均能促进真皮成纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原蛋白分泌,在48h、72h时PDGF-BB组的培养液中Ⅰ型胶原蛋白浓度明显高于IL-13组、TGF-β1组及阴性对照组(P<0.05)。结论浓度为30ng/mL的PDGF-BB促进真皮成纤维细胞增殖和分泌Ⅰ型胶原蛋白的作用更为显著。     

IL-6对大鼠血管平滑肌细胞TWEAK受体Fn14表达及功能的影响

目的:观察白介素-6(IL-6)对Wistar大鼠血管平滑肌细胞肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)受体-人成纤维细胞生长因子诱导14(Fn14)表达及功能的影响。方法:将含有不同浓度IL-6(20ng/ml、50ng/ml)的培养液培养平滑肌细胞,用RT-PCR半定量检测各组平滑肌细胞Fn14mRNA的表达,用Westernblot检测各组平滑肌细胞Fn14蛋白的表达。在20ng/mlIL-6组中,用抗Fn14抗体阻断Fn14作用后,用ELISA观察各组血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的变化。结果:与空白对照组相比,20ng/mlIL-6组和50ng/mlIL-6组Fn14mRNA和蛋白表达均显著升高(P0.01);50ng/mlIL-6组显著高于20ng/ml组(P0.01)。20ng/mlIL-6可显著增加平滑肌细胞表达MCP-1,其水平显著高于抗Fn14单克隆抗体组(P0.05)和空白对照组(P0.01)。结论:IL-6可诱导血管平滑肌细胞表达TWEAK受体Fn14,阻断Fn14的作用可减少IL-6诱导的MCP-1的表达,提示TWEAK/Fn14参与IL-6诱导的动脉粥样硬化形成。     

溶血磷脂酸调控RhoA/ROCK2信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响

目的 探讨溶血磷脂酸(LPA)与RhoA/ROCK2信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响及其作用机制.方法 以不同浓度LPA干预乳腺癌MDA-MB-231细胞,每隔24 h以细胞计数法观察和记录细胞的增殖.以最佳LPA促增殖浓度作用于MDA-MB-231细胞,观察Rho激酶抑制剂(Y-27632)对癌细胞的影响;以Pull-down及Western blot法检测各组细胞内RhoA活性及RhoA、ROCK2蛋白表达.结果 LPA以时间及剂量依赖性关系显著促进MDA-MB-231细胞的增殖(P＜0.05);Y-27632可以显著抑制LPA的促增殖作用;LPA干预后RhoA活性及RhoA、ROCK2蛋白表达显著升高(P＜0.05),Y-27632干预后RhoA活性及RhoA、ROCK2蛋白表达显著下降(P＜0.05).结论 LPA可能通过调控RhoA/ROCK2信号通路促进乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌的临床治疗提供了新思路.     

人着色性干皮病D组基因对白细胞介素-6促进人血管平滑肌细胞增殖作用的影响

目的: 探讨人着色性干皮病D组基因(XPD)对白细胞介素-6(IL-6)促进人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖作用的影响。方法: 用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N2/XPD和空质粒pEGFP-N2稳定转染VSMCs,然后给予1×10⁵ U/L IL-6孵育48 h。实验分为6组:(1)空白对照组;(2)pEGFP-N2组;(3)pEGFP-N2/XPD组;(4)IL-6组;(5)IL-6 + pEGFP-N2组;(6)IL-6 + pEGFP-N2/XPD组。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况;用MTT法观察细胞增殖活力;用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;用RT-PCR和Western blotting检测XPD、Bcl-2、Bax和野生型P53(wt-P53)表达量的变化。结果: 在荧光显微镜下,可在转染了重组质粒pEGFP-N2/XPD或空质粒pEGFP-N2的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;MTT结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染抑制了细胞增殖活力(P<0.05),并能抑制IL-6促进VSMCs增殖的作用(P<0.05);流式细胞仪结果显示,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染引起了细胞G₀/G₁期增加(P<0.05)、S期减少(P<0.05)、凋亡率增加(P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs G₀/G₁期减少、S期增加、凋亡率降低的作用(P<0.01);RT-PCR和Western blotting检测发现,重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染使得XPD表达增高(P<0.05或P<0.01),同时Bcl-2表达降低,Bax和wt-P53表达增高(P<0.05或P<0.01),并能抑制IL-6促进VSMCs的Bcl-2表达增高、Bax和wt-P53表达降低的作用(P<0.05或P<0.01)。结论: XPD能抑制VSMCs增殖并促进其凋亡,并能抑制IL-6促进VSMCs增殖和降低其凋亡的作用,有望成为治疗动脉粥样硬化的靶点。     

AngⅡ诱导大鼠心肌细胞肥大过程中分泌型卷曲相关蛋白5表达上调

目的探讨分泌型卷曲相关蛋白5(s FRP5)在大鼠心肌细胞肥大中表达的机制。方法体外培养乳鼠心肌细胞,用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ10-6mmol/L,48 h)诱导心肌细胞肥大。应用替米沙坦和Y27632分别阻断血管紧张素1型受体(AT1R)及Rho/Rho激酶(Rho/ROCK)信号通路;PD98059、SB203580及SP600125分别阻断p38 MAPK、ERK1/2及JNK通路;RT-PCR检测s FRP5的表达;Western blot检测s FRP5、ROCK1、ROCK2、总MYPT1、p-MYPT1表达。结果 AngⅡ诱导的心肌细胞肥大致s FRP5表达上调(P<0.05),Y27632下调s FRP5的表达(P<0.05);替米沙坦下调ROCK1的表达(P<0.05);SP600125明显降低s FRP5表达的增加(P<0.05)。结论在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中,主要通过Rho/ROCK1/JNK通路上调s FRP5的表达。     

长链非编码RNA ZFAS1/miR-150/ROCK1调控血管平滑肌细胞增殖和迁移

目的:探讨长链非编码RNA ZFAS1是否通过调控微小RNA-150(miR-150)/ROCK1促进血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移,及其参与动脉粥样硬化发生发展的机制。方法:用血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导VSMCs增殖和迁移。用real-time PCR法检测VSMCs中ZFAS1的表达水平。进一步用小干扰RNA(siRNA)下调ZFAS1表达后,采用MTT和EdU法检测VSMCs的活力和增殖能力,采用Transwell法检测VSMCs的迁移能力,采用real-time PCR检测miR-150和ROCK1的表达水平,Western blot检测ROCK1蛋白的表达水平。萤光素酶报告基因实验验证RCOK1为miR-150的靶基因。最后,抑制miR-150表达,检测下调ZFAS1表达后VSMCs的增殖、迁移及ROCK1表达。结果:PDGF-BB上调VSMCs中ZFAS1的表达。下调ZFAS1表达后,VSMCs的增殖和迁移受到抑制(P0.05),miR-150表达水平上升(P0.05),ROCK1表达水平下降(P0.05)。萤光素酶报告基因实验结果显示miR-150能直接靶向调控ROCK1。抑制miR-150表达后,能减弱下调ZFAS1表达导致的VSMCs增殖和迁移的抑制作用(P0.05),上调ROCK1的表达水平(P0.05)。结论:ZFAS1通过调控miR-150/ROCK1促进PDGF-BB诱导的VSMCs增殖和迁移。     

mTORC1/2双重抑制剂OSI-027抑制高氧诱导的肺成纤维细胞增殖和分化

目的：分析哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）复合物1/2(mTOR complex 1/2, mTORC1/2)双重抑制剂OSI-027对高体积分数氧（高氧）所致人胚肺成纤维细胞增殖和分化的抑制作用。方法：高氧（95%O——2）处理人胚肺成纤维细胞MRC-5建立增殖分化模型，分为对照组、高氧组、高氧+OSI-027组和高氧+雷帕霉素组。Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）、I型胶原蛋白（collagen type I, Col I）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、RhoA、Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1, ROCK1)、蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)、p-AKT和mTOR的表达；CCK-8实验检测细胞活力；...     

miR-26a在血小板源性生长因子B诱导小鼠主动脉平滑肌细胞表型转换的作用

目的探讨miR-26a在血小板源性生长因子B(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转换中的调控作用。方法培养原代小鼠主动脉VSMCs,将细胞分空白对照组、anti-miR-26a、PDGF-BB+anti-miR-control组和PDGF-BB+anti-miR-26a组共4组。分别加入荧光蛋白(Ad-GFP)、anti-miR-26a、PDGF-BB+anti-miR-control和PDGFBB+anti-miR-26a,观察VSMCs的表型改变;用RT-qPCR及Western blot分别检测VSMCs中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)、钙调节蛋白(calponin)基因的mRNA和蛋白表达水平以及VSMCs中miR-26a表达。结果与对照组相比,PDGF-BB以浓度和时间依赖方式抑制VSMCs分化标志基因α-SMC、calponin、SM-MHC的mRNA和蛋白的表达(P0. 05),诱导VSMC表型转换为合成表型; PDGF-BB处理的VSMCs中miR-26a表达显著升高(P0. 05);抑制miR-26a后,PDGF-BB对VSMCs的α-SMC、calponin、SM-MHC的mRNA和蛋白的抑制作用被部分抵消(P0. 05)。结论 PDGF-BB使VSMCs中miR-26a表达显著升高,miR-26a促进VSMCs增殖和迁移,miR-26a在PDGF-BB诱导VSMCs表型转换中可能起关键作用。     

IL-1RⅡ和IL-1RAcP重组质粒对大鼠自身免疫性心肌炎的作用及机制

目的:研究白细胞介素1 Ⅱ型受体(IL-1RⅡ)和白细胞介素1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)重组质粒对大鼠实验性自身免疫性心肌炎(EAM)的作用及其机制。方法:构建体内导入用重组质粒pCAGGS-IL-1RⅡ和pCAGGSIL-1RAcP,并以pCAGGS-SP(signal peptide)作为对照质粒。将雄性Lewis大鼠分成4组:对照(control)组(未免疫未注射质粒的大鼠,n=5)、EAM+SP组(免疫的大鼠尾静脉注射对照质粒,n=9)、EAM+IL-1RⅡ组(免疫的大鼠尾静脉注射IL-1RⅡ质粒,n=8)和EAM+IL-1RⅡ+IL-1RAcP组(免疫的大鼠尾静脉注射IL-1RⅡ和IL-1RAcP质粒,n=7)。第0天免疫大鼠造模;第6天应用流体动力学方法尾静脉注射重组质粒;第17天处死大鼠进行疗效评估,评估指标包括组织病理学、心脏彩超检测、心脏重量/体重比值、心肌中心衰标志物心房钠尿肽(ANP)和脑钠尿肽(BNP)及炎症因子的表达。构建体外细胞转染用重组质粒pUC19-IL-1RⅡ-actin和pUC19-IL-1RAcP-tub,转染入Cos7细胞获得培养上清液,将含有IL-1RⅡ和IL-1RAcP的培养上清液加至脂多糖(LPS)诱导的H9c2细胞中,RT-qPCR检测炎症因子的表达变化。将构建的重组质粒pEGFP-IL-1RⅡ-actin和pEGFP-IL-1RAcP-tub转染入Cos7细胞,免疫共沉淀(Co-IP)检测目的蛋白的形成。结果:与EAM+SP组相比,EAM+IL-1RⅡ组和EAM+IL-1RⅡ+IL-1RAcP组大鼠心肌炎症程度均有显著减轻,左心室收缩期内径显著缩小(P0.05),心肌中ANP、BNP、TNF-α、IL-2、IFN-γ和TGF-β的表达水平显著降低(P0.01),IL-4的表达水平显著升高(P0.01)。在H9c2细胞中,与LPS组比较,LPS+IL-1RⅡ组和LPS+IL-1RⅡ+IL-1RAcP组TGF-β和IL-6的表达水平显著降低(P0.01),IL-10的表达水平显著升高(P0.05);与LPS+IL-1RⅡ组比较,LPS+IL-1RⅡ+IL-1RAcP组TNF-α和IL-2的表达水平显著降低(P0.05),IL-13的水平显著升高(P0.01)。Co-IP检测到IL-1RⅡ与IL-1RAcP相互结合并形成了一个新的蛋白,为异源二聚体。结论:IL-1RⅡ和IL-1RAcP重组质粒导入可有效缓解大鼠EAM的炎症损伤,其机制与两者结合形成异源二聚体并强力抑制炎症因子的表达有关。     

CXCL12α和CXCL12β促进培养的LX-2肝星状细胞迁移

目的探讨C-X-C趋化因子配体12α(CXCL12α)和CXCL12β对肝星状细胞迁移的影响。方法体外培养LX-2肝星状细胞,分为正常对照组、10ng/mL血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)组、(50、100、200)ng/mL CXCL12α组、(50、100、200)ng/mL CXCL12β组。采用TranswellTM法检测CXCL12α和CXCL12β对LX-2细胞迁移能力的影响;外源性CXCL12刺激LX-2细胞,用Western blot法检测C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)蛋白的表达。结果 TranswellTM实验结果显示各组迁移的LX-2细胞个数分别为:正常对照组(66.33±11.43)、PDGF-BB组(127.47±31.68)、50ng/mL CXCL12α组(106.13±12.94)、100ng/mL CXCL12α组(125.87±17.00)、200ng/mL CXCL12α组(137.07±21.03)、50ng/mL CXCL12β组(103.80±11.26)、100ng/mL CXCL12β组(122.33±19.46)、200ng/mL CXCL12β组(124.40±15.16)。CXCL12α和CXCL12β均可促进LX-2细胞迁移;且随着CXCL12α和CXCL12β浓度增加,LX-2细胞迁移增强。LX-2细胞可表达CXCR4蛋白,外源性CXCL12刺激LX-2细胞后,CXCR4蛋白表达无变化。结论 CXCL12α和CXCL12β均可促进肝星状细胞迁移。     

青蒿琥酯通过抑制ERK1/2蛋白活化负性调控HSC-T6细胞cyclin D1的表达和AP-1活性

目的: 通过观察青蒿琥酯(artesunate,Art)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的影响,探讨Art抗肝纤维化的分子机制。方法: 用血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB)诱导HSC-T6细胞的增殖。实验分为对照组、PDGF-BB组、PDGF-BB+Art组(Art终浓度6.25 mg/L、25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+ERK抑制剂PD98059组。ELISA法测定细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量,RT-PCR检测各组ERK1/2和cyclin D1 mRNA水平变化,Western blotting法检测各组p-ERK1/2和cyclin D1蛋白表达水平,凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测AP-1的活性。结果: (1)PDGF-BB 可明显促进HSC-T6细胞的增殖,PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059均可抑制HSC-T6细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量(P<0.05,P<0.01)。(2)PDGF-BB+Art组(50 mg/L)ERK1/2 mRNA的表达低于PDGF-BB组(P<0.05),其中PDGF-BB+PD98059组ERK1/2 mRNA的表达最低(P<0.01);PDGF-BB+Art组(25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+PD98059组cyclin D1 mRNA的表达明显低于PDGF-BB组(P<0.05,P<0.01)。(3)p-ERK1/2、cyclin D1蛋白表达水平在PDGF-BB组最高,而PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059组降低(P<0.05,P<0.01)。(4)Art可使AP-1与DNA结合活性下降。结论: Art可抑制HSC-T6细胞增殖,其机制可能与其抑制ERK1/2蛋白活化从而降低AP-1的活性和下调cyclin D1的表达有关。     

IL-6和TNF-α模拟炎性微环境促进人BMSCs向肿瘤相关成纤维细胞分化

目的观察在IL-6和TNF-α模拟的炎性微环境中骨髓间充质干细胞(BMSCs)是否向肿瘤相关成纤维细胞(TAFs)分化。方法将实验分为9组:对照组、IL-6 50 ng/m L及100 ng/m L干预组、TNF-α50 ng/m L及100 ng/m L干预组、IL-6 50 ng/m L+TNF-α50 ng/m L干预组、IL-6 50 ng/m L+TNF-α100 ng/m L干预组、IL-6 100 ng/m L+TNF-α100 ng/m L干预组、IL-6 100 ng/m L+TNF-α50 ng/m L干预组;连续诱导42 d后,通过倒置相差显微镜、流式细胞计量术及Western blot分别检测BMSCs细胞形态、细胞周期及(TAFs)标记分子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)蛋白的表达。结果与对照组相比,IL-6 100 ng/m L+TNF-α50 ng/m L组可明显促进BMSCs细胞增殖;G1期比例降低,S期比例升高,且α-SMA,FAP蛋白表达显著增加(P0.05)。结论 IL-6 100 ng/m L+TNF-α50 ng/m L所模拟的炎性微环境可诱导BMSCs细胞形态和增殖特性发生异常改变,TAFs标记分子α-SMA和FAP表达量升高。     

白细胞介素37过表达促进急性心肌梗死患者外周血内皮祖细胞的增殖和迁移北大核心CSCD

目的:探究白细胞介素(IL)-37对急性心肌梗死患者外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖和迁移的影响和机制。方法:从6例急性心肌梗死患者和6例年龄性别差异无统计学意义的同期进行体检的健康志愿者外周血中分离并培养EPCs。检测IL-37 mRNA和蛋白表达水平。将急性心肌梗死患者EPCs随机分成3组:对照组、pcDNA3.1组和IL-37组。其中对照组不进行任何处理,pcDNA3.1组和IL-37组分别使用Lipofectamine3000试剂转染pcDNA3.1质粒和pcDNA3.1-IL-37质粒。CCK-8检测细胞活力,Transwell检测迁移细胞数目,qRT-PCR检测IL-37和基质金属蛋白酶(MMP)9 mRNA表达水平,Western blot检测IL-37、增殖细胞核抗原(PCNA)、MMP9、磷酸化-Akt(p-Akt)、Akt、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平表达。结果:与健康志愿者相比,IL-37在急性心肌梗死患者外周血EPCs中表达上调(P<0.01)。与对照组相比,IL-37组中细胞活力、迁移细胞数目和IL-37、PCNA、MMP9表达以及p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K均增加,差异具有统计学意义(P<0.05);但pcDNA3.1组中以上指标差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,p-ERK1/2/ERK1/2在IL-37组和pcDNA3.1组中差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:IL-37过表达促进急性心肌梗死患者外周血EPCs的增殖和迁移,其可能通过激活Akt/mTOR通路发挥作用,与ERK1/2通路无关。