白蛋白对脂多糖诱导中性粒细胞胞外诱捕网生成的抑制作用

目的探讨白蛋白对脂多糖(LPS)诱导人外周血中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)生成的抑制作用及机制。方法分离人外周血中性粒细胞,分别培养于无白蛋白和含生理浓度白蛋白的培养体系中,加入LPS刺激,同时使用钙离子(Ca~(2+))以及自噬调节剂干预,采用sytox green染色法检测NETs,采用Fluo-4 AM染色法检测胞内Ca~(2+)水平,免疫荧光法检测NETs相关蛋白髓过氧化物酶(MPO)、弹性蛋白酶(NE)和瓜氨酸化组蛋白H3(cit-H3)以及自噬体相关蛋白LC3B的表达。结果 LPS可诱导中性粒细胞释放NETs,白蛋白可抑制NETs生成;白蛋白可降低LPS刺激下中性粒细胞胞内Ca~(2+)浓度和自噬水平。Ca~(2+)载体可增强中性粒细胞自噬水平并促进LPS诱导的NETs生成,Ca~(2+)螯合剂可降低自噬水平并抑制NETs生成。自噬激动剂可显著增强NETs,自噬抑制剂则显著抑制NETs。结论白蛋白对LPS诱导中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)生成具有抑制作用,其作用机制可能与减少中性粒细胞Ca~(2+)内流进而抑制自噬有关。     

脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞parkin表达及线粒体自噬形成

目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)处理后parkin表达及对线粒体自噬的影响。方法:无菌分离并原代培养小鼠腹腔巨噬细胞;200 ng/ml LPS作用巨噬细胞,JC-1标记线粒体,流式细胞仪检测线粒体膜电位变化;RT-PCR检测巨噬细胞parkin mRNA水平;Western blot检测parkin及自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平;激光共聚焦显微镜分别检测巨噬细胞在LPS处理前后parkin在细胞内的分布及与LC3和线粒体三者的共定位情况。结果:JC-1染色流式细胞仪检测结果显示,LPS处理后,巨噬细胞线粒体膜电位降低,并随LPS作用时间延长呈持续下降趋势;parkin mRNA在LPS处理6 h内仅有少量的增加,但parkin蛋白水平在LPS刺激6 h后增加明显;parkin在巨噬细胞定位结果表明,未受LPS处理时parkin呈弥散均匀分布,而LPS刺激后parkin呈明显的点状聚集;Western blot检测结果显示巨噬细胞在LPS刺激后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增大,表明巨噬细胞发生明显的自噬;激光共聚焦显微镜结果显示,巨噬细胞在LPS刺激后,parkin、LC3和线粒体三者存在共定位关系。结论:巨噬细胞在LPS刺激后,parkin表达增加并介导线粒体自噬形成,参与对损伤线粒体的清除,可能在巨噬细胞参与的炎症反应中发挥一定的调控作用。     

甘氨酸对内毒素刺激大鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α和升高[Ca~(2 )]_i的抑制作用特征

利用TNF-α敏感的细胞系L929,用MTT法检测细胞释放TNF-α的量和用单细胞钙荧光成像系统检测[Ca2 ]i变化动力学,研究甘氨酸对内毒素(LPS)刺激的大鼠腹腔巨噬细胞(PMψ)释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)和升高[Ca2 ]i的影响。结果显示,LPS剂量依赖性的刺激PMψ[Ca2 ]i呈单峰状升高。甘氨酸对正常PMψ基本无激活作用而能显著抑制LPS刺激PMψ过度释放TNF-α和升[Ca2 ]i,两种效应都呈现相似的剂量依赖性,其对[Ca2 ]i升高的抑制作用主要表现为抑制胞外钙内流。结果表明,甘氨酸通过抑制LPS刺激的PMψ胞外钙内流抑制[Ca2 ]i升高,是其抑制LPS刺激PMψ过度释放TNF-α的信号传导的关键环节。     

通过LPS造成小鼠脓毒症模型探讨小鼠腹腔巨噬细胞的自噬在免疫功能变化中的动态意义

目的分析脓毒症模型小鼠腹腔巨噬细胞自噬性能的波动情况。方法生存实验小鼠随机分为WT/LPS组(n=12)以及IRF-1 KO型LPS组(n=12)。向LPS组小鼠腹腔中输入180~230μl LPS(20 mg/kg)。完成LPS输入后的96 h后采集小鼠的生存曲线。其余在体动物实验小鼠分为WT/NS组、WT/LPS组、IRF-1 KO/NS组、IRF-1 KO/LPS组,向LPS组小鼠腹腔中输入180~230μl 20 mg/kg的LPS,向NS组小鼠腹腔输入等量的LPS(20 mg/kg),完成注射12 h后全部处死,采集小鼠肺组织标本和肺泡巨噬细胞、脾脏巨噬细胞及腹腔巨噬细胞。利用免疫荧光染色法对各组小鼠腹腔巨噬细胞中的LC3B颗粒聚集情况进行检测,通过Western blot检测各组小鼠巨噬细胞cleaved caspase-3,LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达自噬水平。结果 WT/LPS组的病理组织学出现急性肺损伤的情况,IRF-1 KO/LPS组的急性肺损伤的情况有所减缓;WT/LPS组的小鼠腹腔巨噬细胞以及脾脏巨噬细胞中的cleaved caspase-3蛋白表达水平、LC3-Ⅱ蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例均要高于WT/NS组,IRF-1 KO/LPS组的小鼠腹腔巨噬细胞中的cleaved caspase-3蛋白表达水平要低于WT/LPS组,该组LC3-Ⅱ蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化均高于WT/LPS组;通过LPS诱导,WT组小鼠腹腔巨噬细胞线粒体损伤较为严重,IRF-1 KO组小鼠腹腔巨噬细胞产生线粒体自噬的情况;WT/LPS组以及IRF-1 KO/LPS组小鼠腹腔巨噬细胞中的LC3Bd颗粒聚焦程度,分别高于WT/NS组和WT/LPS组,IRF-1 KO组小鼠腹腔巨噬细胞自噬程度比WT组大。结论 IRF-1 KO对脓毒症的预后及脏器炎症有明显的修复作用,LRF-1干扰了小鼠巨噬细胞的凋亡和自噬平衡。     

多西环素通过上调自噬调控脂多糖诱导的THP-1细胞炎症因子水平

目的:探讨细胞自噬对多西环素调控脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞引发炎症反应的影响及其分子机制。方法:利用LPS刺激人单核/巨噬细胞系THP-1建立炎症反应细胞模型,用多西环素进行干预。通过测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)等细胞因子评估炎症水平;通过Western blot法检测LC3B、核因子κB(NF-κB)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)等蛋白水平评估细胞自噬水平及对炎症细胞信号通路的影响。利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和雷帕霉素分别抑制和促进细胞自噬,研究自噬对多西环素调控LPS刺激THP-1细胞炎症因子水平的影响。结果:LPS刺激THP-1细胞诱导细胞因子TNF-α及IL-8快速释放,12 h左右达到峰值;多西环素有效地抑制了LPS诱导的细胞因子产生(P0.05)。多西环素增加了LPS诱导的THP-1细胞自噬水平,且多西环素本身是一种自噬诱导剂。LPS上调p-mTOR蛋白水平,而多西环素抑制p-mTOR的蛋白水平,提示多西环素通过mTOR依赖的途径而LPS通过非mTOR依赖的途径诱导自噬。进一步研究显示,联用LPS、雷帕霉素及多西环素抑制了NF-κB的蛋白水平,雷帕霉素增加了多西环素对细胞因子生成的抑制;反之,自噬抑制剂3-MA减弱了多西环素对NF-κB的抑制效应,同时减弱了多西环素对炎症因子生成的抑制效应。结论:自噬参与多西环素调控LPS刺激单核/巨噬细胞引起的炎症反应。     

髓样细胞表达的触发受体1抑制LPS应激下巨噬细胞的自噬

目的　观察髓样细胞表达的触发受体1（TREM-1）对脂多糖（LPS）应激下巨噬细胞自噬相关基因表达的影响。 方法　观察LPS应激下的巨噬细胞TREM-1蛋白的表达。分别选用TREM-1的激动剂（MAB1187）和TREM-1的拮抗剂（LR12）作用于巨噬细胞,利用qPCR检测巨噬细胞自噬相关基因ATG7、ATG5、ATG12及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）mRNA的表达;采用Western Blot检测巨噬细胞TREM-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、ATG7蛋白的表达;采用免疫荧光检测在LPS应激与TREM-1激活的情况下,巨噬细胞的自噬标志蛋白LC3表达。 结果　LPS（400 ng/mL、1000 ng/mL）应激下巨噬细胞TREM-1蛋白表达明显增加;LPS（1000 ng/mL）作用巨噬细胞24 h,巨噬细胞TREM-1蛋白表达达到峰值。LPS应激的巨噬细胞自噬基因ATG7、ATG5、ATG12及自噬标志分子LC3 mRNA表达均降低;当给予TREM-1拮抗剂后,巨噬细胞的ATG7、ATG5、ATG12、LC3 mRNA表达均升高,而采用TREM-1激动剂后,自噬基因表达被抑制。Western Blot检测结果显示,TREM-1可抑制LPS应激下巨噬细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ、ATG7蛋白的表达。免疫荧光检测表明TREM-1激动剂可使巨噬细胞胞内的LC3蛋白表达量减少。 结论　巨噬细胞胞膜上TREM-1激活后,可使巨噬细胞自噬减弱,提示LPS应激下的巨噬细胞TREM-1可能通过抑制巨噬细胞的正常自噬从而发挥炎症放大作用。     

PI3K/Akt信号通路在脓毒症肾脏损伤诱导的自噬中的调节作用*

 目的：研究脓毒症造成肾脏损伤时的自噬情况以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(Akt)信号通路的调节作用。方法：对大鼠盲肠进行结扎与穿刺（CLP）,对肾脏组织切片进行HE染色,并测定血清尿素氮和肌酐。通过Western blotting定量分析CLP大鼠肾脏损伤发生后不同时点自噬相关分子微管相关蛋白轻链3（LC3）Ⅰ/Ⅱ、beclin-1和Akt蛋白磷酸化的表达情况;体外用LPS诱导人近端肾小管上皮细胞株HK-2发生自噬,检测不同浓度LPS和不同刺激时间自噬相关分子LC3Ⅰ/Ⅱ和Akt蛋白磷酸化的表达情况;进一步使用PI3K抑制剂、Akt抑制剂和LPS刺激HK-2细胞观察自噬相关蛋白的表达情况及细胞的凋亡水平。结果：同对照组相比,CLP大鼠显微镜下可见肾损伤的典型病理改变,血清尿素氮和肌酐均有上升。CLP肾脏损伤发生后,自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、beclin-1含量及Akt磷酸化水平均有上升。LPS刺激HK-2细胞后,随着刺激浓度的增加,p-Akt(308)表达量逐渐提高,而LC3Ⅰ/Ⅱ及p-Akt(472)的表达量在10 mg/L LPS刺激组最高。随着刺激时间的延长,p-Akt(308)表达量逐渐提高;LC3Ⅰ/Ⅱ表达量同p-Akt(472)在刺激8 h时最高;使用PI3K抑制剂及Akt抑制剂后,LPS诱导的LC3表达显著下调,HK-2细胞凋亡明显增加。结论：CLP肾脏损伤发生时可以诱导自噬发生, PI3K／Akt信号通路在其中发挥重要调节作用。     

芦荟大黄素影响巨噬细胞升高[Ca~(2 )]_i和释放TNF-α的作用特征

应用MTT法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)量,同时利用细胞钙离子成像分析系统检测单细胞内自由钙离子浓度([Ca2 ]i)的动态变化,来研究芦荟大黄素(aloe-emodin)对正常的和细菌脂多糖(LPS)刺激的大鼠腹腔巨噬细胞(PMψ)释放TNF-α和[Ca2 ]i的影响。结果显示,芦荟大黄素可较强活化正常PMψ释放TNF-α,同时诱发正常PMψ[Ca2 ]i呈振荡式变化,[Ca2 ]i变化主要来源于胞外钙内流。药物升高细胞[Ca2 ]i和促进TNF-α释放都随其浓度增加而增强。芦荟大黄素对LPS刺激的PMψ的影响有较复杂的剂量依赖性特征:低浓度芦荟大黄素(10-7 mol／L、10-6 mol／L)抑制LPS诱发的[Ca2 ]i升高和TNF-α的释放;10-5 mol／L的芦荟大黄素则对LPS诱发的[Ca2 ]i峰及TNF-α释放量没有明显影响。以上结果说明,芦荟大黄素对PMψ释放FNF-α和升高[Ca2 ]i表现出双向调节作用,但其活化正常PMψ和抑制LPS的刺激作用有相反的量一效关系。同时芦荟大黄素对PMψ的[Ca2 ]i动力学的调制,是其调节细胞释放TNF-α的信号传导通路中的重要环节。     

二氧化硅致肺泡巨噬细胞自噬对其自身分泌肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β的影响

目的:研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对二氧化硅(SiO_2)诱导的肺泡巨噬细胞自噬的激活,是否对自身分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)产生影响。方法:收集SD雄性大鼠肺泡巨噬细胞灌洗液,将其随机分为对照组,SiO_2刺激组(SiO_2组),自噬抑制剂组(3-MA组)。采用体外暴露肺泡巨噬细胞染尘法,染尘成功后12 h给予10 mmol/L 3-MA干预。分别于干预后6、18、24 h和36 h用胰酶消化并收集体外培养的肺泡巨噬细胞。采用H-E染色观察肺泡巨噬细胞形态学改变;免疫细胞化学检测肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的定位表达;免疫印迹检测肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的蛋白定量。结果:SiO_2组与对照组相比肺泡巨噬细胞体积增大,胞质丰富,部分细胞胞质内可见矽尘吞噬颗粒。3-MA组较SiO_2组肺泡巨噬细胞形态改变减轻。与对照组相比,SiO_2组各时间相肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的蛋白表达显著升高,于SiO_2刺激后6 h开始升高,18 h达高峰,24 h与36 h回落,但仍高于对照组水平。3-MA组可以显著下调SiO_2组对应时间点肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的表达。结论:自噬抑制剂3-MA抑制肺泡巨噬细胞自噬后可以下调肺泡巨噬细胞中TNF-α和TGF-β的表达及释放,进而促进炎症损伤的修复。     

尿毒症毒素通过刺激巨噬细胞外泌体分泌miR-22促进心肌细胞自噬

目的:探讨在尿毒症毒素微环境下巨噬细胞外泌体分泌微小RNA-22(miR-22)对心肌细胞自噬的影响。方法:收集硫酸吲哚酚(IS)刺激后的巨噬细胞源性外泌体,并将其与H9c2细胞共培养,RT-qPCR检测巨噬细胞及其分泌的外泌体中miR-22的表达水平,CCK-8法检测H9c2细胞的活力,Western blot检测外泌体表面标志蛋白CD63及自噬相关蛋白LC3和P62的表达。结果:在IS刺激下,巨噬细胞中外泌体表面标志蛋白CD63的水平显著高于对照组(P0. 05),同时IS组巨噬细胞及其分泌的外泌体中miR-22的水平较对照组显著上调(P0. 01)。随着共培养体系中巨噬细胞外泌体浓度的增大,H9c2细胞的活力逐渐降低(P0. 05),并且巨噬细胞外泌体的刺激降低了H9c2细胞P62的表达,并促进了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化,这种变化呈剂量依赖性(P0. 05)。在巨噬细胞外泌体刺激下,miR-22模拟物转染的H9c2细胞与相应阴性对照miRNA转染的细胞相比,具有更高的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率(P0. 05)及更低的P62蛋白表达量(P0. 05);而转染miR-22抑制物则产生了相反的结果。结论:IS刺激的巨噬细胞可通过外泌体途径上调心肌细胞miR-22表达,促进心肌细胞的自噬反应。     

铜绿假单胞菌的信号分子3-oxo-C12-HSL促进小鼠MH-S肺泡巨噬细胞自噬

目的探讨3-oxo-C12-HSL对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞自噬的影响。方法用Las I基因(3-oxo-C12-HSL合成基因)缺失型和野生型的铜绿假单胞菌(PA)菌株的培养物上清液以及化学合成的3-oxo-C12-HSL信号分子处理MH-S细胞,激光共聚焦荧光显微镜观察LC3-GFP荧光斑点以及Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值来监测自噬的形成,同时检测p62的降解以及氯喹对LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影响来监测自噬流(autophagic flux)的变化。结果野生型PA菌株的培养物上清液使MH-S细胞LC3-GFP荧光斑点增多(P0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P0.01),LasⅠ基因缺失型PA菌株不能引起上述自噬相关指标的改变。化学合成的3-oxo-C12-HSL信号分子能够明显增加自噬体数量,上调LC3Ⅱ的表达(P0.01);自噬底物p62随着3-oxo-C12-HSL作用时间的延长而进行性降解,溶酶体抑制剂氯喹可增强3-oxoC12-HSL引起的LC3Ⅱ累积(P0.05,P0.01)。结论 3-oxo-C12-HSL可增加MH-S细胞的自噬水平。     

miR-200b靶向ATG12对人牙周膜成纤维细胞自噬及炎症反应的调控作用

目的检测炎性人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)及细胞自噬后miR-200b的表达,验证miR-200b在自噬中的作用及与ATG12的靶向关系,探讨miR-200b及细胞自噬对牙周炎的调控。方法检测LPS、雷帕霉素及3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理后的hPDLF细胞中miR-200b的表达,ELISA检测炎性因子IL-6、IL-12及TNF-α的表达,Western blot检测LC3 II/LC3I的蛋白表达,RT-qPCR、Western blot检测ATG12表达量,双荧光素酶验证miR-200b与ATG12的靶向关系。结果 LPS可上调h PDLF中miR-200b的表达(P0.05),且LPS与miR-200b均可使炎性因子IL-6、IL-12及TNF-α的表达升高,后者上调更为明显;雷帕霉素及miR-200b均可使LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白升高;miR-200b与ATG12存在靶向调控作用关系。结论 miR-200b通过靶向下调ATG12基因的表达调控hPDLF细胞自噬,促进牙周炎的炎性反应。     

上调自噬抑制LPS诱导的小胶质细胞死亡

目的:观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理后,N9细胞自噬水平的变化,并探究LPS刺激下不同自噬水平对N9细胞的损伤和存活的影响。方法:体外培养N9细胞,给予24 h LPS处理,免疫荧光(IF)检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)及溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)的表达,Western Blot检测LC3与Beclinl的表达。LPS处理后分别使用自噬诱导剂雷帕霉素(RAP)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)调节N9细胞自噬水平,Western Blot检测不同处理组自噬标记蛋白LC3、Beclinl的表达;使用乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase)试剂盒、Cell Count Kit(CCK8)试剂盒检测细胞损伤及存活。结果:(1)LPS刺激造成N9细胞损伤,LDH释放量(113.6%±3.2%)较对照组(100.0%±3.9%)显著增加(P0.01),存活细胞数(69.8%±2.1%)较对照组(100.0%±3.9%)显著减少(P0.001);(2)与对照组相比,LPS显著上调N9细胞LC3以及Beclinl水平(P0.05)并同时上调LAMP2水平;(3)RAP上调LPS处理后N9细胞的自噬水平并减少小胶质细胞损伤(100.8%±2.3%),促进细胞存活(87.4%±5.7%)(P0.05)。3-MA则抑制LPS处理后N9细胞自噬水平并降低细胞存活(60.6%±2.9%),而细胞损伤(123.2%±3.7%)与LPS组相比未见统计学差异;(4)RAP与3-MA分别促进或抑制LPS诱导的N9细胞自噬相关蛋白的表达(P0.05)。结论:上调自噬水平减少LPS刺激诱导的N9细胞损伤,促进细胞存活。     

大黄素甲醚影响巨噬细胞[Ca~(2 )]_i变化和TNF-α释放的作用特征

应用L929细胞系和MTT法检测TNF-α量,同时用细胞[Ca2 ]i荧光图像分析系统检测单细胞[Ca2 ]i变化动力学,以研究大黄素甲醚(physcion,Phy)对正常的和细菌脂多糖(LPS)刺激的大鼠腹腔巨噬细胞(PMψ)释放肿瘤坏死因子(TNF-α)和[Ca2 ]i动态变化的影响。结果显示,大黄素甲醚对正常PMψ能适度促进其释放TNF-α和升高[Ca2 ]i,两种效应都随药物浓度增加而增强;同时,大黄素甲醚显著抑制LPS刺激的PMψ过度释放TNF-α和升高[Ca2 ]i,而两种抑制效应则随着药物浓度的增加而迅速衰减。以上结果说明,大黄素甲醚对PMψ释放TNF-α和升高[Ca2 ]i表现出双向调节作用,但其活化正常细胞免疫功能与抑制失控释放炎性细胞因子的剂量依赖关系相反。研究表明,大黄素甲醚调节PMψ的[Ca2 ]i变化可能是其调控细胞释放TNF-α的信号传导通路中的重要环节。     

AMPK信号通路在调节小鼠骨髓巨噬细胞抗菌性自噬效应中的作用

目的观察AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)对小鼠骨髓巨噬细胞自噬及杀菌活性的调节作用,并探讨其可能机制。方法分离和体外培养小鼠原代骨髓巨噬细胞(BMDM),观察大肠埃希菌刺激后对BMDM细胞自噬水平及AMPK活化状态的影响。使用AMPK激动剂和抑制剂干预其活化,进一步观察大肠埃希菌感染的BMDM细胞中AMPK活化、自噬水平以及杀菌能力的变化。结果大肠埃希菌感染后的小鼠BMDM细胞自噬相关分子LC3B和Beclin1的表达显著升高,同时LC3Ⅱ/Ⅰ比值也明显升高,且其AMPK的磷酸化水平也随之显著上调。AMPK活性增强后,能够进一步上调BMDM细胞的自噬水平以及对细菌的降解清除。而AMPK活性被抑制后,细胞自噬水平和杀菌活性均显著下降。结论 AMPK分子及其相关信号通路可能在调节巨噬细胞自噬水平以及抗菌效应方面发挥重要作用。     

K~+通道阻滞剂对结肠上皮细胞(HT-29/B6)胞内钙的调节

本文运用fura-2技术研究了K~+通道阻滞剂对Carbacol(氨甲酰胆碱)介导的Ca~(2+)进入人类排Cl~-的HT-29/B6并影响胞内钙浓度的作用。结果表明,用100μmol/L氨甲酰胆碱刺激HT-29/B6可产生清晰的双相Ca~(2+)反应:Ca从静息水平(85±3nmol/L)迅速激发至短暂的峰值(821±44nmol/L),随后降至一段平台(317±12nmol/L)。平台高度与胞外Ca~(2+)浓度相关并在Ca~(2+)出入胞浆膜之间代表着新的平衡状态。平台在缺Ca~(2+)的条件下不出现而钙峰无论在有钙或无钙条件下均能出现,这表明Ca~(2+)峰的出现是由胞内Ca~(2+)库释放所致,而平台的维持则是外钙流入胞内所致。加阿托品     

三氧化二砷抑制血管平滑肌细胞及巨噬细胞肿瘤坏死因子α启动子活性的实验研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对血管平滑肌细胞(VSMCs)及巨噬细胞(Mφs)体外转染的TNF-α基因启动子活性的调控作用。方法利用虫荧光素酶(luciferase)基因系统,构建含有人类TNF-α基因启动子的质粒DNA,经阳离子脂质体转染体外培养的VSMCs及Mφs,以LPS及AngⅡ刺激并经不同浓度的As2O3处理后,通过检测luciferase的活性来观察启动子活性的变化。结果TNF-α启动子在VSMCs及Mφs可高效稳定地表达,分别为阳性对照(CMV启动子)的58.3%和55.6%;而经LPS及AngⅡ刺激的VSMCs和Mφs中,TNF-α启动子活性呈现明显上调(P<0.05)。VSMCs中2~8μmol/L、Mφs中0.25~1μmol/L的As2O3对未受诱导的TNF-α启动子有抑制作用,更可显著抑制经LPS及AngⅡ刺激后上调表达的TNF-α启动子活性,并呈剂量依赖关系(P<0.05)。结论As2O3对TNF-α启动子转录活性的抑制,提示其对促炎细胞因子在转录水平有潜在抑制作用。     

RIPK2介导自噬对高糖诱导的小鼠肾系膜细胞ROS、caspase-1及IL-1β表达的激活作用

目的观察受体结合丝氨酸/苏氨酸激酶2(RIPK2)介导自噬对高糖诱导的肾系膜细胞(GMCs)ROS、caspase-1及IL-1β表达的调控。方法体外培养正常小鼠GMCs,高糖作为刺激因子,设计siRNA靶向沉默RIPK2表达并构建自噬双荧光(mRFP-GFP-LC3)标记体系,激光共聚焦显微镜观察自噬流变化;DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平;Western blot及RT-PCR检测RIPK2、LC3Ⅱ/Ⅰ、caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA表达;ELISA检测IL-1β的分泌。结果 1)高糖呈时间-浓度依赖性增加细胞内ROS水平,诱导caspase-1和IL-1β表达(P0.05)。2)短期(0~12 h)高糖刺激可诱导RIPK2和LC3Ⅱ/Ⅰ表达(P0.05),超过12 h后RIPK2和LC3Ⅱ/Ⅰ表达下调(P0.05)。3)siRNA靶向沉默RIPK2下调LC3Ⅱ/Ⅰ表达和细胞自噬流形成,上调细胞内ROS、caspase-1及IL-1β表达(P0.05)。结论 RIPK2介导自噬负性调控高糖诱导的ROS、caspase-1及IL-1β表达,可能是防治糖尿病肾脏疾病(DKD)的新思路。     

脂多糖诱导脓毒症小鼠心肌细胞及线粒体自噬

目的探讨脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平的变化。方法雄性C57BL/J小鼠随机分为空白对照组(NC)、LPS处理6、12、24、36 h组。LPS处理组小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS建立脓毒症模型,空白对照组注射等量生理盐水。分别于以上时间点处死小鼠,收集血液及心脏组织,提取心肌组织胞质蛋白、线粒体及线粒体蛋白,另取心肌组织进行冰冻切片;应用ELISA试剂盒测定血清心肌肌钙蛋白I(c Tn I)含量变化;JC-1染色结合荧光酶标仪检测LPS刺激后不同时间点线粒体膜电位变化;Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、PTEN诱导激酶1(pink1)、E3泛素连接酶帕金森病蛋白(parkin)水平;免疫荧光组织化学染色检测心肌组织LC3、pink1/parkin蛋白的定位及其在不同处理组的表达差异。结果与对照组相比,LPS诱导的脓毒症小鼠血清c Tn I在6 h即开始明显升高;LPS处理组线粒体膜电位下降,在LPS 12 h组最低;细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在腹腔注射LPS 12 h明显升高,然后逐渐下降;pink1/parkin在腹腔注射LPS 6 h明显升高,然后逐渐下降。结论脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平升高,自噬应激可能更早发于心肌线粒体。     

异丙酚通过TRPV1离子通道抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应

目的:探讨异丙酚(propofol,P)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞炎症反应的影响及其机制。方法:LPS(100μg/L)处理建立小鼠小胶质细胞BV2神经炎症损伤模型,将细胞分为对照(C)组、模型(L)组、L+P组和LPS+AMG517(L+A)组。ELISA法检测各组细胞培养液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;real-timePCR法检测各组细胞瞬时受体电位阳离子通道V亚族成员1(TRPV1) mRNA的表达;Western blot法检测各组细胞TRPV1、TNF-α、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和磷酸化钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(p-CaMKⅡ)的蛋白表达;荧光探针Fluo-3 AM标记法检测细胞内游离的Ca~(2+)含量。结果:与C组相比,L组细胞培养液中TNF-α水平显著升高(P0.01);单独propofol处理TNF-α水平无显著差异;与L组相比,L+P组细胞培养液中在4 h内TNF-α水平显著降低(P0.01)。与C组相比,L组TRPV1 mRNA表达显著上调(P0.01);与L组相比,L+P组TRPV1 mRNA表达显著下调(P0.01)。相比L组,L+P和L+A组TNF-α、IL-1β、IL-6和p-CaMKⅡ蛋白表达显著下调(P0.01)。相比L组,L+P和L+A组细胞内Ca~(2+)浓度显著降低(P0.01)。结论:Propofol通过下调TRPV1的表达,下调p-CaMKⅡ的表达,降低细胞内Ca~(2+)浓度,从而下调TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,抑制小胶质细胞的炎症反应。