小鼠黑色素瘤细胞外泌体促进成纤维细胞表达Rac1蛋白

目的:探讨小鼠黑色素瘤细胞外泌体对成纤维细胞表达Ras相关C3肉毒毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)蛋白的影响。方法:超高速离心法分离小鼠黑色素瘤B16-F10细胞外泌体,电镜负染色观察外泌体的形态,纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)测定外泌体的粒径分布,Western blot鉴定外泌体标志蛋白肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,Tsg101)和酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 2,Tyrp2)的表达;激光共聚焦显微镜观察在共培养过程中小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)摄取外泌体的过程;免疫细胞化学染色和Western blot实验分析MEF表达Rac1蛋白的情况。结果:B16-F10细胞外泌体在电镜下呈典型茶托状形态,NTA测得其粒径范围在141~255 nm,Western blot测出其标志蛋白Tsg101和Tyrp2。激光共聚焦显微镜观察结果显示,与共培养0 h相比,共培养12 h的MEF内有少量的外泌体,且共培养24和36 h的MEF内聚集了大量的外泌体。Western blot结果表明,与共培养0 h相比,共培养24和36 h的MEF中Rac1蛋白表达水平显著增加(P<0. 01)。免疫细胞化学染色结果表明,与共培养0 h相比,共培养12、24和36 h的MEF中Rac1蛋白阳性表达水平显著增加(P<0. 05或P<0. 01)。结论:小鼠黑色素瘤细胞外泌体可促进成纤维细胞表达Rac1蛋白。     

外泌体介导miR-106a转运对胃癌细胞腹膜种植转移的影响

目的探讨肿瘤源性外泌体(tumor-derived exosomes, TDEs)介导miR-106a转运对胃癌细胞腹膜种植的影响及可能机制。方法选择人低分化胃癌细胞系AGS进行培养,从细胞培养上清液中提取外泌体,透射电镜及蛋白质印迹法对外泌体进行鉴定;采用Real-time PCR检测外泌体与细胞内miR-106a的表达差异;将外泌体标记荧光染料PKH26与人腹膜间皮细胞HMrSV5共培养,采用激光共聚焦显微镜观察外泌体的吞噬;增设阴性对照组,划痕实验检测外泌体介导下miR-106a转运对间皮细胞迁移能力的影响,Real-time PCR和Western blot检测miR-106a靶基因Smad7及间质标志物α-SMA的表达。结果透射电镜显示AGS细胞培养上清液中所提取的微囊泡直径30～150 nm,Western blot显示外泌体标记蛋白CD9、CD81均为阳性。Real-time PCR结果显示外泌体miR-106a表达量显著高于细胞内(P0.05)。携带PKH26红色荧光信号的外泌体可被间皮细胞摄取。划痕实验结果显示外泌体处理组间皮细胞迁移能力明显增强(P0.001),Real-time PCR和Western blot检测结果显示靶基因Smad7表达下调,α-SMA表达上调(P0.001)。结论胃癌细胞来源的外泌体可促进腹膜间皮细胞迁移,参与转移前微环境形成,其机制可能与外泌体介导miR-106a转运,转录后抑制Smad7表达并诱导间质转化相关。     

肺腺癌细胞源性外泌体活化的人THP-1巨噬细胞促进肺癌细胞的侵袭

目的研究肺腺癌细胞来源的外泌体对巨噬细胞极化的作用及受外泌体作用后的巨噬细胞对肺癌细胞生物学行为的影响。方法提取A549和H1299肺腺癌细胞外泌体, Western blot法检测其表面标志物CD9、 CD63进行鉴定。100 ng/mL佛波酯(PMA)处理人THP-1细胞48 h,实时定量PCR检测细胞CD68的mRNA水平。200μg/mL外泌体处理贴壁巨噬细胞24 h后,实时定量PCR检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、 CD163的mRNA水平, IMMULITE 1000化学发光免疫分析仪检测白细胞介素6(IL-6)、 IL-8、 IL-10的蛋白水平;将外泌体处理后的巨噬细胞分别与A549细胞和H1299细胞共培养,通过Transwell~(TM)实验检测肺腺癌细胞侵袭能力,实时定量PCR检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、 MMP9的mRNA水平。结果 CD9、 CD63在外泌体高表达, PMA诱导后的巨噬细胞高表达CD68,外泌体处理后的巨噬细胞iNOS表达降低, CD163、 TNF-α、 IL-6、 IL-8、 IL-10表达水平均增加;外泌体处理后的巨噬细胞与肺腺癌细胞共培养,可增强肺腺癌细胞的侵袭能力并促进MMP2、 MMP9的表达。结论肺腺癌细胞来源的外泌体可以诱导巨噬细胞极化,表现为M1/M2的混合表型,进而增强肺癌细胞的自身侵袭能力。     

胃癌源性外泌体对HLA-DR~(neg)leukocytes中Dicer1、PTEN基因的调控

目的通过观察胃癌源性的外泌体对HLA-DR~(~(neg))leukocytes中Dicer1、PTEN基因表达的影响,探讨肿瘤源性外泌体调控机体免疫抑制功能的机制。方法提取胃癌患者血清外泌体并鉴定,免疫磁珠法分选HLA-DR~(neg)leukocytes,吖啶橙染色后的外泌体与CFSE染色后的HLA-DR~(neg)leukocytes在37℃,5%CO_2条件下共培养12 h;采用QRT-PCR和Western blot方法分别检测共培养后胃癌患者与健康对照组中Dicer1、PTEN基因和蛋白的表达。结果成功分离胃癌患者外周血外泌体;同时观察到外泌体被HLA-DR~(neg)leukocytes有效摄取。QRT-PCR检测结果显示Dicer1 m RNA、PTEN m RNA的相对表达量分别是健康对照组的0.46±0.19、0.48±0.27倍(P0.05);Western blot结果显示Dicer1、PTEN蛋白表达量是健康对照组的0.15±0.11、0.33±0.19倍(P0.05)。结论胃癌来源的外泌体可以抑制HLA-DR~(neg)leukocytes中Dicer1、PTEN基因的表达,为今后进一步研究肿瘤来源的外泌体的免疫调控作用提供线索。     

M1型巨噬细胞源外泌体增强卵泡膜细胞的活力

目的:探讨M1型巨噬细胞源外泌体对卵泡膜细胞活力的影响及其作用机制。方法:采用脂多糖(LPS)处理Raw264.7小鼠巨噬细胞,构建M1型巨噬细胞模型及巨噬细胞-卵泡膜细胞共培养体系。超速离心法分离巨噬细胞分泌的外泌体;通过电镜、Western blot和纳米流式检测仪鉴定外泌体。体外分离培养小鼠卵泡膜细胞,与PKH67荧光标记的外泌体共孵育,观察卵泡膜细胞摄取外泌体的情况。CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术分析细胞周期分布,q PCR及Western blot检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B(CDKN1B)的表达。结果:在巨噬细胞-卵泡膜细胞共培养体系中,LPS诱导的M1型巨噬细胞通过外泌体增强卵泡膜细胞活力。电镜、Western blot及纳米流式检测结果显示,巨噬细胞源外泌体被成功分离。PKH67标记的外泌体与卵泡膜细胞共孵育实验证实卵泡膜细胞能摄取大量巨噬细胞源外泌体。这些外泌体可增强卵泡膜细胞的活力,使卵泡膜细胞G0/G1期比例下降,S期比例升高,且卵泡膜细胞CDKN1B的m RNA及蛋白相对表达量均明显低于对照组。结论:卵泡膜细胞能摄取巨噬细胞分泌的外泌体。M1型巨噬细胞源外泌体通过抑制CDKN1B的表达而增强卵泡膜细胞的活力。     

蜕膜巨噬细胞通过外泌体调控滋养细胞生物学行为参与不明原因复发性流产

目的:研究蜕膜巨噬细胞分泌的外泌体是否调控滋养细胞生物学行为,参与不明原因复发性流产(URSA)的发生。方法:收集正常早孕人工流产妇女和URSA患者的蜕膜组织,采用免疫磁珠法分选巨噬细胞。分离蜕膜巨噬细胞外泌体,透射电镜观察其形态,Western blot检测外泌体标记蛋白CD63的表达。荧光显微镜检测外泌体能否被滋养细胞摄取。将正常蜕膜巨噬细胞外泌体和URSA患者蜕膜巨噬细胞外泌体分别与滋养细胞HTR8/Snveo共培养,采用MTS法检测共培养后1 d、2 d和3 d滋养细胞的细胞活力;Transwell迁移实验检测共培养后滋养细胞的迁移能力。结果:透射电镜显示,外泌体直径40～80 nm,近似圆形。Western blot结果表明蜕膜巨噬细胞外泌体高表达CD63。荧光显微镜结果显示,外泌体可被滋养细胞内吞。MTS实验结果显示,与正常组相比,URSA组蜕膜巨噬细胞外泌体在共培养后第2和第3天均抑制滋养细胞的活力(P0.05)。Transwell迁移实验结果表明,与对照组相比,URSA组蜕膜巨噬细胞外泌体明显抑制滋养细胞的迁移能力(P0.01)。结论:蜕膜巨噬细胞可能通过外泌体调控滋养细胞生物学行为,参与母胎免疫调节,与URSA发病相关。     

蜕膜巨噬细胞经外泌体调控滋养细胞生物学行为参与不明原因复发性流产的作用机制分析

目的研究蜕膜巨噬细胞经外泌体调控滋养细胞生物学行为参与不明原因复发性流产的作用机制。方法采集从2018年1月～2019年2月于我院接受诊治的50例URSA患者蜕膜组织,记作实验组。另取同期于我院进行人工流产的50例孕早期女性蜕膜细胞组织作为对照组。以免疫磁珠法完成巨噬细胞的分选。借助透射电镜观察蜕膜巨噬细胞形态,以Western blot法检测外泌体标记蛋白CD63的表达。采用荧光显微镜观察外泌体是否可被滋养细胞所摄取。将两组不同蜕膜巨噬细胞外泌体和滋养细胞HTR8/Snveo共培养,以MTS法检测培养1～3d时HTR8/Snveo细胞的活力。采用Transwell迁移实验检测共培养3d后HTR8/Snveo细胞的迁移能力。结果在透射电子显微镜下观察发现,外泌体的形状为椭圆形,直径在40～80nm之间,且经Western blot法检测结果发现,蜕膜巨噬细胞外泌体存在明显的CD63高表达。将经PKH67染色处理的蜕膜巨噬细胞外泌体和滋养细胞HTR8/Snveo共培养,在荧光显微镜观察下发现:HTR8/Snveo胞质内存在荧光,提示了外泌体可被滋养细胞所摄取。实验组蜕膜巨噬细胞外泌体共培养2d、3d时的HTR8/Snveo活力低于对照组(均P0.05)。实验组HTR8/Snveo细胞迁移数少于对照组(P0.05)。结论蜕膜巨噬细胞经外泌体对滋养细胞的活力以及迁移能力均产生不同程度的抑制作用,继而可能引起胚胎的发育停止,进一步达到介导URSA发生的目的。     

外泌体介导miR-335-5p通过靶向LKB1对胶质瘤细胞上皮-间质转化的影响

目的 探讨外泌体中microRNA-335-5p(miR-335-5p)被胶质瘤细胞摄取并作用于肝激酶B1(liver kinase B1, LKB1)影响胶质瘤细胞侵袭的分子机制。方法 通过外泌体提取试剂盒提取外泌体;运用透射电镜、粒度仪、Western blot法鉴定分离获取的外泌体;RT-PCR检测不同肿瘤细胞来源外泌体中miR-335-5p的表达量;外泌体摄取实验检测胶质瘤细胞对外泌体的摄取情况;Transwell实验检测加入外泌体后胶质瘤细胞的侵袭能力;双荧光素酶报告实验验证miR-335-5p是否靶向结合LKB1;Transwell实验检测转染miR-335-5p mimic后胶质瘤细胞的侵袭能力;Western blot法检测转染miR-335-5p mimic后胶质瘤细胞中LKB1和上皮-间质转化相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和vimentin)的表达水平。结果 LN229细胞来源的外泌体中miR-335-5p表达水平明显高于H4细胞来源的外泌体;过表达miR-335-5p后LN229细胞侵袭能力增强;miR-335-5p靶向结合LKB1 mRNA...     

肝癌细胞外泌体鉴定及其对肝细胞的影响

目的 鉴定小鼠肝癌细胞Hepa1-6来源的外泌体（Hepa1-6 Exos），探讨Hepa1-6 Exos与小鼠正常肝细胞AML12共孵育时细胞摄取外泌体效率及对细胞增殖、凋亡和细胞功能的影响。方法 提取Hepa1-6 Exos；透射电子显微镜和纳米颗粒分析仪鉴定外泌体形态和粒径分布；Western blot实验检测外泌体特异性蛋白；免疫荧光技术分析AML12细胞摄取外泌体效率；CCK-8和transwell侵袭实验检测外泌体对AML12细胞增殖和凋亡能力的影响；定量聚合酶链式反应（qPCR）和Western blot实验分析外泌体对AML12细胞功能的影响。结果 Hepa1-6 Exos呈茶托样形态，粒径为50～200 nm，表达特异性蛋白CD9、CD63和TSG101。AML12细胞可高效摄取Hepa1-6 Exos。与正常AML12细胞对照组相比，Hepa1-6 Exos可促进AML12细胞增殖，24 h、48 h、72 h细胞增殖率分别为（10.15±0.91）%、（16.61±1.56）%、（28.57±1.53）%（均P <0.05）；与正常AML12细胞对照组相比，...     

高表达软骨调素1骨髓间充质干细胞来源外泌体促进骨关节炎软骨细胞的增殖

背景：软骨调素1(chondromodulin-1,Chm-1)在正常软骨中大量表达,具有抑制血管生成、阻止软骨细胞肥大、缓解骨关节炎发展的功能,在骨关节炎发生和发展中发挥着重要作用。目的：探讨高表达Chm-1骨髓间充质干细胞来源外泌体对骨关节炎环境中软骨细胞增殖的影响。方法：分离大鼠骨髓间充质干细胞并进行培养及鉴定;Chm-1慢病毒和空载慢病毒转染骨髓间充质干细胞,超高速离心法提取细胞培养上清液中外泌体(Chm-1-Exos和NC-Exos)。白细胞介素1β作用软骨细胞24 h构建体外骨关节炎模型,随后分别用2种外泌体处理7 d,将PBS处理的骨关节炎软骨细胞作为对照组。共聚焦显微镜观察骨关节炎软骨细胞对外泌体的摄取情况;CCK-8评估各组骨关节炎软骨细胞增殖能力;Western blot检测2种外泌体中Chm-1的表达;Western blot和RT-qPCR方法分别检测各组骨关节炎软骨细胞中Ⅱ型胶原、SOX9、AGG蛋白和mRNA的表达。结果与结论：(1)骨髓间充质干细胞呈典型纺锤状形态且具备三系分化能力;(2)带有绿色荧光的慢病毒成功转染骨髓间充质干细胞;(3)外泌体直径在40...     

BDNF干预MSCs源性外泌体减轻过氧化氢致PC12细胞氧化应激损伤

目的探讨经脑源性神经营养因子(BDNF)干预后的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)源性外泌体对H2O2损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的保护作用。方法全骨髓培养法提取大鼠MSCs,取P3代分为对照组及干预组(培养基中加入30 ng/mL BDNF),分别收集细胞上清,超速离心法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态;用Western blot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63;实验将嗜铬细胞瘤细胞PC12分为4个组:对照组、H2O2组、MSCs外泌体组和BDNF-MSCs外泌体组,前2组培养基中加入PBS,后2组加入相应外泌体(MSCs外泌体组和BDNF-MSCs外泌体组外泌体蛋白浓度均为50μg/mL)均预处理12 h,后3组在培养基中加入H2O2(0. 521 mmol/L)对PC12建立氧化应激的细胞损伤模型;于10 h后以CCK-8法检测细胞活性,检测活性氧(ROS)及超氧化物歧化酶(SOD)值,Western blot检测Bcl-2与Bax蛋白质表达情况。结果 P3代MSCs细胞表面CD90表达阳性。成功提取出外泌体,透射电镜下可见大量直径40～100 nm的不规则球体或茶托形的囊泡结构,膜清晰,相对完整,Western blot显示CD9、CD63蛋白表达阳性。相比于单纯损伤组与MSCs外泌体组,BDNF-MSCs外泌体组细胞活性最高、SOD活性最高、ROS含量最低、Bcl-2/Bax值最高。结论经BDNF干预后的MSCs源性外泌体在H2O2对PC12细胞造成的氧化应激损伤的保护作用优于MSCs源性外泌体。     

M2型巨噬细胞来源外泌体对乳腺癌细胞系4T1干性特征的影响

目的探讨M2型巨噬细胞来源的外泌体对乳腺癌细胞系4T1细胞肿瘤干性特征的影响。方法用超速离心法分离M2型巨噬细胞来源的外泌体;用透射电子显微镜、纳米粒子追踪技术,Western blot等对其进行鉴定;然后以乳腺癌细胞系4T1为肿瘤模型,使用Dil染料标记M2型巨噬细胞来源的外泌体,通过免疫荧光技术观察其能否进入4T1细胞。此外,用流式细胞计量术、共培养体系和Transwell实验探究在M2型巨噬细胞来源的外泌体影响下的4T1细胞的干性特征。结果 M2型巨噬细胞在体外被成功诱导,分离并鉴定了M2型巨噬细胞来源的外泌体。通过免疫荧光,看到Dil标记的外泌体可成功进入4T1细胞。M2型巨噬细胞来源的外泌体与4T1细胞共孵育后,可明显增强4T1细胞的迁移能力(P0.001)和成球能力(P0.05);外泌体抑制剂GW4869可明显抑制4T1细胞的成球能力(P0.05)。同时,M2型巨噬细胞来源的外泌体可明显增加4T1细胞中CD44~(high)CD24~(low)细胞的比例(P0.001)。结论 M2型巨噬细胞来源的外泌体能够促进4T1肿瘤细胞的迁移和成球能力,并明显增加4T1细胞中肿瘤干细胞的比例。     

CP-25调控巨噬细胞来源的外泌体分泌对子宫内膜癌Ishikawa细胞系自噬性细胞死亡的影响

目的：探讨芍药苷-6’-O-苯磺酸酯（CP-25）通过调控巨噬细胞来源的外泌体对子宫内膜癌Ishikawa细胞自噬性细胞死亡的影响。方法：使用佛波酯（PMA）将人单核细胞THP-1诱导为巨噬细胞，并提取其外泌体，透射电子显微镜观察外泌体形态，Western blot鉴定外泌体标志蛋白表达；使用不同浓度CP-25(0.1、0.5、1.0μmol/L)干预巨噬细胞外泌体，并与Ishikawa细胞共培养24 h,CCK-8法检测各处理组Ishikawa细胞活性，Transwell小室检测各处理组Ishikawa细胞的迁移与侵袭；以自噬抑制剂3-MA干预细胞，实验分为对照组、3-MA组、Exo-CP-25组、3-MA+Exo-CP-25组，进行对应处理后，Hoechst 33342染色观察各处理组Ishikawa细胞凋亡形态，流式细胞术检测各处理组Ishikawa细胞凋亡率，透射电子显微镜观察各处理组Ishikawa细胞自噬体，免疫荧光染色检测各处理组Ishikawa细胞自噬相关标志物LC3表达，Western blot检测各处理组Ishikawa细胞自噬相关蛋白表达。结果：经鉴定成功分离了诱...     

肝癌细胞自分泌外泌体通过TGF-β1调控自身细胞学行为北大核心CSCD

目的:研究肝癌Huh7细胞外泌体促进自身转移的机制。方法:培养肝癌Huh7细胞,分离提取外泌体并进行鉴定。将分离的外泌体与Huh7细胞共培养,Transwell比较细胞迁移和侵袭能力;检测外泌体中TGF-β1水平;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TGF-β1、SMAD2/3、EMT相关分子表达。结果:提取的外泌体经Western blot检出CD63、TSG101条带;透射电镜检测出双侧膜结构小体;纳米粒径分析显示颗粒大小集中在100 nm左右。外泌体中检出TGF-β1。外泌体与Huh7细胞共培养,免疫荧光显示外泌体成功进入Huh7细胞。与对照组相比,共培养组细胞迁移和侵袭大幅增加,TGF-β/Smad通路相关分子活化,上皮标志物E-钙黏蛋白、p-Smad7表达下降,间充质标志物-波形蛋白表达升高。结论:肝癌Huh7细胞自分泌的外泌体通过运输TGF-β1上调TGF/Smad通路进而影响肝癌转移,探明了肝癌发展机制,为肝细胞癌治疗提供了新思路。     

不同来源间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎疗效的比较

背景:在过去的数十年中,间充质干细胞作为组织工程种子细胞,在骨关节炎治疗中展现出了强大的疗效,在国内已开展了多项临床注册试验。研究表明,间充质干细胞主要依靠旁分泌效应释放外泌体等载体在体内发挥治疗作用。目的:比较骨髓间充质干细胞来源外泌体和脐带间充质干细胞来源外泌体治疗骨关节炎的效果。方法:采用超速离心法提取骨髓间充质干细胞来源外泌体和脐带间充质干细胞来源外泌体,采用透射电镜、Nanosight和Western blot鉴定两种外泌体;采用白细胞介素1β与软骨细胞共培养体外模拟骨关节炎环境,通过CCK-8、Western blot、qPCR评估两种外泌体对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡和细胞外基质分泌的影响;建立Ⅱ型胶原酶诱导的大鼠骨关节炎模型,通过大体和组织学染色评估体内注射两种外泌体治疗骨关节炎的疗效,ELISA检测关节液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平。结果与结论:(1)两种外泌体在透射电镜下均为典型的圆形或杯状,粒径在105-120 nm之间,均表达CD63、CD81和TSG1010特征性蛋白;(2)脐带间充质干细胞来源外泌体的产量和纯度均高于骨髓间充质干细胞来源外泌体;(3)...     

与肌源性干细胞共培养修复大鼠胰岛功能

目的采用体外共培养方式研究肌源性干细胞(MDSCs)修复大鼠胰岛功能的作用。方法提取新生大鼠MDSCs原代细胞,差速贴壁培养后行结蛋白免疫细胞化学鉴定,取第2代MDSCs接种在transwell底板。提取大鼠胰岛后,双硫腙染色鉴定,胰岛放入transwell板上层与MDSCs共培养作为实验组,用放射免疫法测胰岛功能,Western blot检测胰岛Bax、caspase3蛋白表达。另选胰岛单独培养作为对照组。结果实验组胰岛素释放指数(SI)值降低不明显,Bax、capase3蛋白定量升高不明显,与对照组相同时间比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 MDSCs与大鼠胰岛共培养后,大鼠胰岛功能被修复。     

人羊膜间充质干细胞来源外泌体的提取与鉴定

目的探索人羊膜间充质干细胞来源外泌体(hAMSC-Exos)的分离、纯化与鉴定方法,为外泌体的生物学功能研究奠定基础。方法由废弃的羊膜提取间充质干细胞;采取改良超速离心法分离、纯化培养液上清中的hAMSC-Exos;透射电镜观察、纳米粒子跟踪分析技术(NTA)、Western blot和流式细胞术用于hAMSC-Exos的鉴定外泌体。结果成功用改良超速离心法分离出hAMSC-Exos,透射电镜(TEM)下观察呈中间凹陷的茶杯样结构;NTA结果显示样品直径符合外泌体直径大小;Western blot和流式细胞术证实外泌体表面特异性蛋白CD9、CD63、CD81表达阳性。结论建立了hAMSC-Exos的提取纯化及鉴定方法,为它后续的研究提供依据。     

缺氧调节肺腺癌小鼠MDSCs来源外泌体携带的miRNA及其免疫抑制功能

目的 观察正常(21%O₂)和缺氧(1%O₂)条件下，髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)来源外泌体(exosomes derived from MDSCs, MDSCs-EX)的免疫抑制功能，探究缺氧对MDSCs-EX携带miRNA成分以及免疫抑制能力的影响。方法 构建肺腺癌小鼠移植瘤模型，磁珠分选脾脏中的MDSCs，分别在21%O₂和1%O₂条件下培养MDSCs，提取上清中的外泌体。通过透射电子显微镜观察形态、流式检测颗粒直径、Western bolt检测特异性蛋白鉴定制备的外泌体。观察正常和缺氧条件下MDSCs-EX对CD3⁺T细胞增殖的影响。对正常和缺氧条件下MDSCs-EX进行miRNA测序分析，观察2者在miRNA表达上的差异，将差异表达前十位的miRNA作为待筛选miRNA。运用siRNA特异性敲减待筛选miRNA，观察缺氧条件下MDSCs-EX携带的miRNA对其免疫抑制功能的影响。结果 成功分选出肺腺...     

巨噬细胞J774A.1外泌体促进结直肠癌细胞系MC38和CT26的增殖和迁移

目的探讨巨噬细胞J774A.1分泌的外泌体对小鼠结直肠癌细胞系MC38和CT26增殖和迁移的影响及作用机制。方法应用流式细胞术对J774A.1细胞进行表型鉴定;应用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和Western blot分别检测J774A.1细胞外泌体的形态特征、大小和表面标志物;荧光显微镜下观察MC38和CT26细胞对外泌体的摄取情况;应用CCK8法检测外泌体对MC38和CT26细胞增殖作用的影响;细胞划痕实验检测MC38和CT26细胞的迁移能力;Western blot检测增殖相关通路的磷酸化蛋白p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达变化。结果 J774A.1细胞为表达细胞表面标志分子CD68和CD206的M2型巨噬细胞。J774A.1细胞的外泌体均能被结直肠癌细胞MC38和CT26摄取,而且能够促进它们增殖(P0.05)、迁移及MEK-ERK信号通路激活。结论巨噬细胞J774A.1的外泌体能够促进结直肠癌细胞系MC38和CT26的增殖及迁移,这可能与MEK-ERK信号通路的磷酸化增加有关。     

黑色素瘤细胞来源的外泌体通过上调Treg的CXCR3促进其趋化

目的检测黑色素瘤细胞通过外泌体途径上调CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)CXCR3(chemokine receptor 3)受体表达,提高Treg向肿瘤免疫抑制微环境趋化的能力。方法以超速离心法纯化小鼠黑色素瘤细胞B16上清中的外泌体,透射电镜检测外泌体形态,Western blot检测外泌体标记性蛋白的表达。B16细胞荷瘤小鼠。流式细胞术检测荷瘤小鼠(1、2、3周)和尾静脉注射外泌体后脾脏、肿瘤内Treg的频率。磁珠法分离纯化小鼠的Treg;Transwell实验检测Treg的趋化能力。Western blot检测Treg的CXCR3、p-Smad2的表达水平。结果电镜结果显示,B16细胞释放的外泌体为直径30～100 nm的圆形或类圆形结构;高表达标志性蛋白CD63和Alix,不表达Calnexin。在外泌体刺激下Treg的趋化能力显著增强,但可被抗CXCR3的单克隆抗体阻断。Western blot结果显示外泌体可提高Treg细胞内Smad2的磷酸化,并上调CXCR3的表达水平,Treg的趋化能力随之增强。结论 B16细胞来源的外泌体通过Smad2磷酸化途径提高了Treg细胞内CXCR3的表达,进而增强其趋化能力。